Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 14 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Bài 3. Định tính Salmonella 3.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H 2 S. Salmonella có thể phân tích định tính bằng mộ quy trình gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella. 3.2 Quy trình định tính Salmonella trong thực phẩm Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh BPW, ủ ở 37 0 C, 18-24 giờ Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ ở 42 0 C, 18-24 giờ Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc đặc biệt (XLD, HE, BS, SS…), ủ ở 37 0 C, 24 giờ Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả: - Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H 2 S, sinh hơi/không - Urea (-); Indol (-); VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol (+); Sorbitol (+) Salmonella dương tính/ âm tính trong 25g mẫu Hình 12: Salmonella trên thạch XLD Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 15 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com 3.3 Cách tiến hành và tính kết quả Mẫu phân tích: cá hoặc ruột cá, khối lượng 25g cho 1 lớp Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú BPW (Buffered Pepton Water) Pepton: 10g NaCl : 5g Na 2 HPO 4 : 3.5g KH 2 PO 4 : 1.5g 1000 ml nước cất pH 7.2 ± 0.2 Phân phối cho mỗi tổ 20ml BPW trước khi khử trùng. (buổi 2) RV (Rappaport- Vassiliadis Soya Pepton) Môi trường cơ bản Tryptone:5g NaCl: 8g KH 2 PO 4 : 1.6g Nước cất: 1000 ml Dung dịch MgCl 2 MgCl 2 .6H 2 O: 400g Nước cất: 1000 ml Dung dịch Malachite green oxalate Malachite green oxalate: 0.4g Nước cất: 100 ml Môi trường hoàn chỉnh Môi trường cơ bản: 1000ml Dung dịch MgCl 2 : 100ml Dung dịch Malachite green oxalate: 10ml 1110 ml pH 5.5 ± 0.2 Phân phối 30ml RV cho mỗi tổ (10ml/ống nghiệm) trước khi khử trùng. (buổi 2) XLD (Xylose Lysine Desoxycholate) Cao nấm men: 3g L-lysine: 5g Xylose: 3.75g Lactose: 7.5g Sucrose: 7.5g 1000 ml nước cất pH 7.4 ± 0.2 Đun sôi môi trường. Phân phối 50ml XLD cho mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3) Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 16 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Sodium deoxycholate: 2.5g Ferric ammonium citrate: 0.8g Sodium thiosulfate: 6.8g NaCl: 5g Agar:15g Phenol red: 0.08g Không hấp. Không giữ quá 1 ngày HE (Hektoen Entric Agar) Proteose Peptone: 12.0g Yeast Extract: 3.0g Bile Salts No. 3: 9.0g Lactose: 12.0g Saccharose: 12.0g Salicin: 2.0g Sodium Chloride: 5.0g Sodium Thiosulfate: 5.0g Ferric Ammonium Citrate : 1.5g Agar: 14.0g Bromthymol Blue: 65.0mg Acid Fuchsin : 0.1g 1000 ml nước cất pH 7.5± 0.2 Đun sôi môi trường. Không hấp. Phân phối 50ml HE cho mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3) TSA (Tryptone Soya Agar) Trypticase peptone: 15g Phytone peptone: 5g NaCl: 5g Agar: 15g 1000 ml nước cất pH 7.3± 0.2 Phân phối 50ml TSA cho mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 4) KIA (Kliger Iron Agar) Polypeptone peptone: 20g Lactose: 20g Dextrose: 1g NaCl: 5g 1000 ml nước cất pH 7.4± 0.2 Phân phối 20ml KIA cho mỗi tổ (10ml/ống nghiệm) (buổi 5) Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 17 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Ferric ammonium citrate: 0.5g Sodium thiosulfate: 0.5g Agar: 15g Phenol red: 0.025g MR-VP Both (Glucose Phosphate) Môi trường 1: Buffered peptone-water powder: 7g Glucose: 5g K 2 HPO 4 : 5g Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 1000ml nước cất. pH 6.9 ± 0.2 Mỗi tổ chỉ dùng 40ml, phân phối 10ml/ống nghiệm. Kiểm tra lại môi trường cung cấp nào để pha môi trường. (buổi 5) RSU (Rustigian-Stuart Urea Broth) Dipotassium Phosphate: 9.5g Yeast Extract: 0.1g Urea: 20g Monopotassium Phosphate: 9.1g Phenol Red: 0.01g 1000ml nước cất. pH 6.8 ± 0.2 Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân phối 3ml/ống nghiệm. (buổi 5) Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 18 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 121 0 C trong 15 phút. Bước 4: Tăng sinh Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 37 0 C, 18-24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống, sữa khô, các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị, casein, pho mát, bơ, sản phẩm chứa cocoa, các sản phẩm của dừa) có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt (xem TLTK). Bước 5: Tăng sinh chọn lọc Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0.1ml sang 10ml môi trường tăng sinh RV đã được ủ ấm 42 0 C. Ủ ở 42 0 C, 18-24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ. Bước 6: Phân lập và nhận diện Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD và HE. Biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường như sau: + Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. + Môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. Bước 7: Khẳng định Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc TSA. Ủ ở 37 0 C, 18-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau: Hình 13: khuẩn lạc Salmonella trên XLD Hình 14: khuẩn lạc Salmonella trên HE Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 19 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com + Thử nghiệm sinh H 2 S trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H 2 S. Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1% glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường này có 3 trường hợp xảy ra đối với sự tăng trưởng của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và lactose, không sử dụng cả hai đường này. Salmonella chỉ lên men được đường glucose vì thế phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ. Về sinh hơi: đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H 2 S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm. + Thử nghiệm urea (-): được thực hiện trên môi trường urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Broth), chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH 6.8-8.4). Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 37 0 C trong 48 giờ. Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam. + Thử nghiệm VP (-): môi trường được sử dụng là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn Hình 15: thử nghiệm KIA. Ống 1: môi trường KIA không có VSV. Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men glucose cũng tốt). Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ trên phần thạch nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có quá trình khử lưu huỳnh và sinh H 2 S. Hình 16: kết quả thử nghiệm Urea Hình 17: kết quả thử nghiệm VP Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 20 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường. Bài 4. Định lượng Bacillus cereus 4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5 0 C – 50 0 C, tối ưu ở 35 0 C – 40 0 C; pH dao động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn. 4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, đồng nh ấ t b ằ ng Stomacher, đ ộ pha loãng 10 -1 Pha loãng đến các độ pha loãng 10 - 2 , 10 - 3 Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch MYP, ủ ở 30 0 C, 24 gi ờ Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc) cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 30 0 C, 24 giờ Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên men glucose, th ử nghi ệ m VP. Kết luận B. cereus . 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 37 0 C, 1 8-2 4 giờ. Đối với một số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống, sữa khô, các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị, casein, pho mát, bơ, sản phẩm chứa. http://lethuylinh.weebly.com 3. 3 Cách tiến hành và tính kết quả Mẫu phân tích: cá hoặc ruột cá, khối lượng 25g cho 1 lớp Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú BPW. 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh BPW, ủ ở 37 0 C, 1 8-2 4 giờ Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ ở 42 0 C, 1 8-2 4 giờ Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất