THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM - BÀI 1 ppt

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vi sin

2010

ThS Lê Thùy Linh

THỰC HÀNH PHÂN TÍCH

VI SINH THỰC PHẨM

NỘI DUNG Trang

1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp MPN 3

2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN 10

4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 20

Bài 5 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc 24

Tài liệu tham khảo

1 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ

phẩm, NXB Giáo dục, 2006

2 http://www.microbelibrary.org

3 http://www.chromagar.com

4 http://www.rapidmicrobiology.com

5 http://www.marietta.edu

Bài 1: Định lượng Coliforms và E coli

1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

1.1.1 Định nghĩa

Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử,

hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và

sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ Coliforms được xem là nhóm vi

sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước

hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện

diện của các loại vi sinh vật khác Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:

E coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter Tính chất sinh hóa

đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I),

Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi là IMViC

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi

trong khoảng 24h khi ủ ở 440C trong môi trường canh EC

Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh

indole khi ủ khoảng 24h ở 440C trong canh Trypton E coli là Coliforms phân cho kết

quả thử nghiệm IMViC là ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -)

1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN)

Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm

được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau Thông thường, việc định lượng này được

thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm

Quy trình thực hiện như sau:

Pha loãng mẫu phân tích ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp

Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định

Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính

ở từng độ pha loãng Tra bảng Mac Crady

Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu

Hình 1: phát hiện Coliforms và E

coli trong thực phẩm hay nước bằng

môi trường CHROMagar ECC

Chú ý:

Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml Trên thực tế phân tích, người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Lượng mẫu với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên Vậy số liệu của bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng khi 1ml của các dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 được dùng để phân tích

Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng tiếp theo cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng Ví dụ: sử dụng 1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng

độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Do vậy, trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10

1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp MPN

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…

Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ

Ghi nhận các ống LSB (+) (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL,

ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ

Cấy vào ống canh EC, ủ

ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ

Số ống (+)(sinh hơi )ở

mỗi độ pha loãng

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Coliforms

Cấy lên thạch EMB, ủ ở 370C,

24 giờ

Xem trang sau

1.3 Cách tiến hành thí nghiệm

Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ)

1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ

Bước 1: pha môi trường

SPW

Water)

NaCl : 42.5g Pepton: 5g

500 ml nước cất

Phân phối cho mỗi tổ 27ml

trước khi khử trùng (buổi 1) LSB

(Lauryl Sulphate

Broth)

Tryptose: 20g Lactose: 5g Sodium chloride: 5g

KH2PO4: 2.75g

K2HPO4: 2.75g Lauryl sulphate: 0.1g

1000 ml nước cất

pH 6.8 ± 0.2

Phân phối 90ml LSB cho mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)

trước khi khử trùng (buổi 1)

Tiếp theo

Chọn khuẩn lạc (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP,

SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ

Thử nghiệm IMViC

Đếm số ống canh EC (+) và IMViC ++ , tra bảng MPN

E coli

(Brilliant Green

Broth)

Lactose: 10g Mật bò: 20g Brilliant green: 0.0133g

cất

pH 7.4

mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có chứa ống Durham) trước khi

khử trùng (buổi 1)

EC

(E.coli medium)

Trypticase or tryptose:

20g Muối mật No.3: 1.5g Lactose: 5g

KH2PO4: 1.5g

K2HPO4: 4g NaCl: 5g

1000 ml nước cất

pH 6.9

Phân phối 90ml BGBL cho mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có chứa ống Durham) trước khi

khử trùng (buổi 1)

EMB

(Eosin Methylene

Blue Agar)

Pancreatic digest of gelatin: 10g

Lactose: 10g

K2HPO4: 2g Eosin Y: 0.4g Methylene blue: 65mg Agar: 15g

1000 ml nước cất

pH 7.1 ± 0.2

Phân phối 100ml EMB cho

mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2)

trypticase:10g

1000ml nước cất

pH 7.2 ± 0.2

Mỗi tổ chỉ dùng 20ml, phân

(buổi 3)

(Glucose

Phosphate)

Môi trường 1:

Buffered peptone-water powder: 7g

Glucose: 5g

K2HPO4: 5g

Môi trường 2:

Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g

Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g

1000ml nước cất

pH 6.9 ± 0.2

Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân

Kiểm tra lại môi trường cung

cấp nào để pha môi trường (buổi 3)

pH 6.9 ± 0.2

Môi trường 3:

Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g

pH 7.5 ± 0.2

SCA

(Simmons Citrate

Agar)

Sodium citrate: 2g NaCl: 5g

K2HPO4: 1g

NH4H2PO4: 1g MgSO4: 0.2g

0.08g Agar: 15g

1000ml nước cất Đun nóng nhẹ và thỉnh thoảng lắc

Đun sôi 1-2 phút cho đến khi hòa tan hết pH 6.8 ± 0.2

Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân

(buổi 3)

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha

Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút

1.3.2 Cách tiến hành:

Bước 3: pha loãng mẫu

Hình 2: quy trình pha loãng mẫu

Pha loãng mẫu thành 3 nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3

ống mẫu

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Độ pha loãng

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

9ml

Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB

Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370

C, 48 giờ

Bước 5: Định lượng Coliform và E coli

Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu

từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa

canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ

Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu

từ các ống LSB (+) sang môi trường canh

EC, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với

mỗi độ pha loãng

Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với mỗi độ pha loãng

(+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Ủ ở 370C, 24 giờ

Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh)

(xem hình 4), cấy vào Trypton, MR-VP, SC

Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ

10-1 10-2 10-3

Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng

Bước 6: thử nghiệm IMViC

Hình 5: Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủ ở 37°C (Anne Hanson, University of Maine, Orono)

Ống A: dương tính thử nghiệm indole trên môi trường tryptone Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường sau khi nhỏ thuốc thử Kovács

Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red

Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay đổi màu sau khi cho thuốc thử Barritt’s A và Barritt’s B

Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và không có khuẩn lạc trong ống nghiệm

a Thử nghiệm Indol (I):

Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật

có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu

đỏ

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước

tryptone Sinh khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ

370C trong 24-48 giờ Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết

Hình 4: E.coli nuôi trên môi trường thạch EMB

cho khuẩn lạc màu kim xanh (theo Naowarat Cheeptham, Thompson Rivers University, Kamloops, BC, Canada)

tách indol lên lớp dung môi hữu cơ Nhỏ 5 giọt thuốc thử

vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu

đỏ trong lớp dung môi hữu cơ

Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt

môi trường (-) lớp màu vàng của thuốc thử Đôi khi có sự

xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa

của indol, tạo ra

b Thử nghiệm Methyl Red (MR):

Nguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH<4.4 đỏ;

pH 5.0-5.8 màu cam; pH>6.0 màu vàng

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường

lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth) Dùng que vòng cấy một lượng nhỏ khuẩn lạc trên môi trường MR-VP, ủ ở 370C trong khoảng 2-5 ngày Thêm vào vài giọt thuốc thử

đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản ở 40C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay

Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung

thuốc thử (-) khi có màu vàng Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm

c Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, bài 3)

d Thử nghiệm Citrate (iC)

Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kềm hóa môi trường Mặt khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều

có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường

Hình 6: thử nghiệm Indol

Hình 7: thử nghiệm MR

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường

lỏng SCA Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên

môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 350C

trong khoảng 24-48 giờ

Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường

chuyển sang màu xanh dương (-) khi không có khuẩn lạc và môi

trường giữ nguyên màu xanh lục

1.4 Cách tính kết quả

Từ số lượng các ống nghiệm có E coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng

MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng

Bài 2 Định lượng Staphylococcus aureus

2.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý,

hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+) có khả năng lên men và sinh acid từ

mannitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng S aureus đều mẫn

cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl Một số dòng có khả năng tăng trưởng làm

tan máu trên môi trường thạch máu S aureus có thể nhiễm vào

thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm

Sự hiện diện với mật độ cao của S aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và

kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến

2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN

Phương pháp này được dùng để định lượng S aureus trong mẫu có mật độ S aureus thấp

nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao

Hình 8: thử nghiệm Citrate

Hình 9: S aureus trên BPA