Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 10 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 35 0 C trong khoảng 24-48 giờ. Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương. (-) khi không có khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh lục. 1.4 Cách tính kết quả Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus 2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+) có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng tăng trưởng làm tan máu trên môi trường thạch máu. S. aureus có thể nhiễm vào thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. 2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao. Hình 8: thử nghiệm Citrate Hình 9: S. aureus trên BPA Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 11 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com 2.3 Cách tiến hành và tính kết quả Mẫu phân tích: thịt heo sống, khối lượng 50g cho 1 lớp Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ th ậ p phân 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 … Chuyển 1ml dung dịch 10 - 1 , 10 - 2 , 10 - 3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37 0 C, 48 giờ Chọn ống (+) đục ở mỗi độ pha loãng Ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 37 0 C, 48 giờ Chọn khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và quầng sáng xung quanh (đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng)) Cấy vào TSA, ủ ở 37 0 C ± 1 0 C , 24 giờ Thử nghiệm ngưng kết coagulase Ghi nhận số coagulase (+) ở mỗi độ pha loãng Tra bảng MPN Mật độ S.aureus (MPN/g hoặc MPN/ml) Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 12 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú SPW (Saline Pepton Water) NaCl : 42.5g Pepton: 5g 500 ml nước cất Phân phối cho mỗi tổ 27ml SPW (9ml/ống nghiệm) trước khi khử trùng. (buổi 2) MSB (Mannitol Salt Broth) Cao thịt: 1g Polypeptone: 10g NaCl: 75g Mannitol: 10g Phenol red: 0.025g 1000 ml nước cất pH 7.4 ± 0.2 Phân phối 90ml MSB cho mỗi tổ (10ml/ống nghiệm) trước khi khử trùng. (buổi 2) BPA (Baird Parker Agar) Môi trường cơ bản Tryptone:10g Cao thịt: 5g Cao nấm men: 1g Sodium pyruvate: 10g Glycine: 12g Lithium chloride.6H 2 O: 5g Agar: 20g Môi trường hoàn chỉnh 5ml Bacto EY tellurite enrichment (45-50 0 C) vào 95ml môi trường cơ bản được làm nóng chảy. Môi trường hoàn chỉnh phải đục. 1000 ml nước cất cho môi trường cơ bản pH 7.0 ± 0.2 Phân phối 100ml BPA cho mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2) TSA (Tryptone Soya Agar) Trypticase peptone: 15g Phytone peptone: 5g NaCl: 5g Agar: 15g 1000 ml nước cất pH 7.3± 0.2 Phân phối 50ml BGBL cho mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3) Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 13 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 121 0 C trong 15 phút. Bước 3: đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dich SPW, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2) Bước 4: Cấy mẫu vào canh MSB Chuyển 1ml dung dịch 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37 0 C, 48 giờ. (xem bài 1, mục 1.3.2). Chọn các ống (+) có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA Bước 5: phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA Dùng kỹ thuật cấy ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 37 0 C, 48 giờ. Chọn khuẩn lạc đặc trưng :tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và quầng sáng xung quanh; đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng (xem hình 10). Chọn khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên BPA để thử nghiệm sinh hóa coagulase Bước 6: thử nghiệm sinh hóa coagulase Nguyên tắc: các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra môi trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương, tạo thành các khối đông làm đông huyết tương. Phương pháp tiến hành: Huyết tương người hay thỏ đông khô thương phẩm được dùng cho thử nghiệm này. Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hay thỏ không pha loãng, bổ sung 0.5ml dịch nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn lạc. Xoay nhẹ ống để trộn đều VSV. Ủ ống thử nghiệm ở 37 0 C trong 4 giờ. Quan sát, ghi nhận sự ngưng kết mỗi 30 phút. Tiếp tục ủ đến 24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ. Đọc kết quả: (+) có sự kết tụ; (-) không có sự kết tụ, hỗn hợp vẫn đồng nhất Hình 10: hình dạng S. aureus trên BPA Hình 11: thử nghiệm coagulase. Ống trên (+); ống dưới (-) . Mẫu phân tích: thịt heo sống, khối lượng 50g cho 1 lớp Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ th ậ p phân 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 … Chuyển 1ml dung dịch 10 - 1 , 10 - 2 , 10 - 3 . (xem bài 1, mục 1.3 .2) Bước 4: Cấy mẫu vào canh MSB Chuyển 1ml dung dịch 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37 0 C, 48 giờ. (xem bài 1, mục 1.3 .2) nhiễm vào thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm