LỜI NÓI Đầu
Sự ra đời và phát triển ngày càng mạnh mẽ của Công nghệ Sinh học trong những năm gần đây đã là một cột mốc đẩy ấn tượng trong những thập niên cuối của thế kỉ 20, đồng thời cũng mang đến nhiều niễm hi vọng lớn lao cho nhân loại trong những thập niên đâu của thế kỉ 21 Không phải ngẫu nhiên mà có người nói : "Thế kỉ 21 là thế kỉ của Sinh học"
Trong bối cảnh ấy, việc chuẩn bị cho thể hệ trẻ Việt Nam có đầy đủ cả kiến thức lắ thuyết và kĩ năng thực hành về Sinh học nói chung, về Vị sinh vật học nói riêng là việc làm thậi cấp bách và cần thiết, để họ có thể thắch ứng tốt và làm chủ được những yéu cầu mới mà thời đại đặt ra
Cuốn Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học này cũng mong muốn góp một phần nhỏ bé của mình vào mục dich nêu trên
Sách được cấu trúc theo đơn vị bài Mỗi bài theo một chủ đề riêng, nhằm hình thành những kĩ năng nhất định trên cơ sở củng cố và rèn luyện các kiến thức tắ thuyết và kĩ năng đã có
Mỗi bài đều gồm các phần - - Mục đắch yêu cầu của bài
~ Hóa chất, nguyên liệu và dụng cụ cần chuẩn bị
- Các nội dung thực hành - Câu hỏi và bài tập
Để có thể sử dụng được cho nhiều đối tượng, nhiều hoàn cảnh đa dạng của các trường, trong mỗi bài đều có chú ý tới các đối tượng tác động khác nhau, các
cách tiến hành khác nhau cho người sử dụng sách dễ lựa chọn
Sách được xuất bản lần đầu chắc không tránh khỏi thiếu sót Hải mong được sự chỉ bảo và góp ý nhiệt thành của các bậc thầy, các đồng nghiệp và quý độc giả gần xa để lần xuất bản sau sách được hoàn chỉnh hơn
Trang 3
I - NHỮNG QUY TẮC CHUNG CỦA PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC Vi sinh vật là những cơ thể sống có kắch thước vô cùng nhỏ bé, mắt thường không nhìn thấy được Bên cạnh những loài có ắch được ứng dụng
trong sản xuất và đời sống, có rất nhiều loài gây bệnh cho người, động vật và thực vật Trong quá trình nghiên cứu, việc tiếp xúc thường xuyên với vi
sinh vật và các vật phẩm có vi sinh vật là điều không thể tránh khỏi Do đó, để giữ gìn sức khỏe, để đạt hiệu quả cao trong công tác nghiên cứu, người làm thắ nghiệm cân thực hiện đúng các quy tắc sau :
1 Mặc áo Blu và cài khuy kắn khi vào phòng thắ nghiệm
2 Bảo đảm sự vô trùng tuyệt đối khi cấy truyền vi sinh vật Giữ gìn
trật tự, vệ sinh của phòng
3 Không ăn uống, hút thuốc, nói chuyện ổn ào khi đang tiến hành thắ nghiệm
4 Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dây ra quần áo, sách vở, dụng cụ cá nhân
5 Khi sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ phải hết sức thận trọng,
tránh làm đổ vỡ và hư hồng
6 Kết thúc bài thực hành, các dụng cụ, thiết bị vừa sử dụng xong đều
phải được vệ sinh theo đúng quy trình và xếp vào nơi quy định
H - MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC
ề Trước khi vào bài thực hành :
Cân nghiên cứu kĩ mục đắch - yêu cầu và nội dung toàn bộ bài hướng dẫn để hình dung được khối lượng công việc sắp làm
Trang 4- Đọc thật cẩn thận cách tiến hành thắ nghiệm để hiểu được tiến trình
của nó
- Nếu có vấn để gì không rõ cẩn xem lại các khái niệm, các kiến thức có liên quan với lắ thuyết để làm sáng tô vấn để trong bài
Ấ Trong giờ thực hành :
Cần thực hiện đúng các thao tác và quy trình thắ nghiệm để đạt được mục đắch và yêu cầu để ra
Ấ Sau mỗi bài thực hành :
Phải làm đây đủ tường trình theo phần câu hỏi và bài tập ở cuối bài
III - NHỮNG TRANG THIẾT BỊ CẨN THIẾT CHO MỘT PHÒNG THÍ NGHIỆM
VI SINH HỌC
Để phục vụ cho công tác giảng dạy thực hành và nghiên cứu khoa học,
ngoài những trang thiết bị chung cho các phòng thắ nghiệm sinh học, cần
trang bị thêm cho phòng thắ nghiệm vi sinh một số dụng cụ và trang thiết bị cơ bản sau : 1 Dụng cụ thắ nghiệm Các thắ nghiệm vi sinh học liên quan rất nhiều đến các dụng cụ thủy tỉnh Có 3 loại dụng cụ chắnh : ~ Dụng cụ thông thường - Dụng cụ đong
~ Dụng cụ chuyên dùng cho thực hành vi sinh
Một số dụng cụ chuyên dùng trong thực hành vi sinh là : a) Phiến kắnh (lam kắnh) : Dùng làm tiêu bản trong nghiên cứu hình thái, sinh lắ tế bào T7 Ộ ⁄⁄ ⁄ | 4 4| Ấ Z po ⁄ Z â 5 Hình 1 a- Lá kắnh ; b- Phiến kắnh b) Lá kắnh (/amen) :
Dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản giúp cho việc quan sát, nghiên cứu vi sinh vật dễ dàng hơn (hình 1)
Trang 5c) Phiến kắnh lõm :
Phiến kắnh này giúp ta nghiên cứu khả năng di động, sự hình thành
bào tử và các đặc điểm về sinh sản của tế bào vi sinh vật (hình 2) ol ⁄ ỞỞ ỞỞ 4 @|Z⁄ ae = |" = | Hình 2 Phiến kắnh lõm
d) Phiến kắnh có khung đếm Goriaep : Dùng để kiểm tra số lượng
tế bào có kắch thước lớn : nấm, bào oO we tử nấm, tảo (bình 3) e) Hộp lồng (đĩa pêtrj) : Ei Dùng để nghiên cứu các đặc
điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy fa và phân lập của tế bao vi sinh vật
Trang 6
Hình 5 Các loại bình tam giác Hình 6 a- Que gạt ; b, c- Que cấy
h) Que gạt (que trang) :
Dụng cụ này để phân lập, tuyển chọn tế bào vi sinh vật (hình 6-a)
i) Que cấy :
Gồm :có 3 loại que cấy : que cấy đầu tròn (Hình 6-b), que cấy đầu nhọn, que cấy đầu hình thước: thợ (hình 6-c) Công đụng chủ yếu của nó để lấy giống, cấy truyền và làm tiêu ban vi sinh vat - e
2 Các loại kắnh hiển vi :
Kắnh hiển vi là dụng cụ rất quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật
học Dụng cụ này cho phép ta quan sát, nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lắ tế bào nhờ khả năng phóng đại từ ừ hàng chục đến hàng vạn lần hình
ảnh của mẫu vật cần quan sát
Tùy mục đắch để ra mà người nghiên cứu có thể lựa chọn và sử dụng các loại kắnh biển vi khác nhau như :
a) Kắnh hiển vi thường (hình 7) :
Dùng ánh sáng thường chiếu từ dưới lên Kắnh này cho phép ta quan sát và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, cấu tạo và sinh lắ nói chung của tế bào nên được sử dụng phổ biến trong giảng dạy và học tập
Trang 7Hình 7: Kắnh hiển vi 1 mắt (a) Kắnh hiển vi 2 mắt (b)
b) Kắnh hiển vi nền đen : Cũng dùng ánh sáng thường nhưng nhờ cấu
trúc đặc biệt của kắnh tụ quang nên ánh sáng chiếu vào mẫu vật từ phắa
bên Kắnh này cho phép quan sát các cấu trúc khó thấy trên kắnh hiển vi thường, ở tiêu bản không nhuộm màu và tiêu bản các tế bào sống
c) Kắnh hiển vi đổi pha : Cũng dùng ánh sáng thường nhưng nhờ cấu
trúc đặc biệt của kắnh tụ quang, vật kắnh, thị kắnh làm đổi pha dao động
của ánh sáng Kắnh này cho phép ta nhìn thấy các cấu trúc nhỏ, rõ nét hơn như tiên mao, các lớp màng, không bào, tỉ thể
d) Kắnh hiển vi huỳnh quang : Dùng chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bởi các chất quỳnh quang Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau cho phép ta phân biệt rõ chúng
Trang 8e) Kắnh hiển vi điện tử : Dùng chùm tia điện tử với độ phân giải cao
thay cho ánh sáng thường cho phép nhìn thấy ảnh của mẫu vật được phóng
đại từ 30 - 50 vạn lần Có 2 loại ỉ
~ Kinh hiển ui điện tử truyền suốt : Dùng để nghiên cứu các đại phân
tử sinh học (hình 8-a)
- Kắnh hién vi điện tử quét : Dùng để nghiên cứu các cấu trúc có
kắch thước lớn hơn các đại phân tử sinh học (hình 8-b) : Aguốn điện ở
Chim tra điện 42
Thow kink héite Aguôn điện lở
Mae vit Chim fia dif tet
, Theta kitah hoi te Thấu kắnh chiêu Thi kinh Miahanh ae Mau vat Hinh anh Mig dé
Hình 8 Sơ đồ kắnh hiển vi điện tử truyền suốt (a)
Sơ đồ kắnh hiển vì điện tử quét (b)
Tuy nhiên, kắnh hiển vi điện tử thường được trang bị ở các phòng
thắ nghiệm có quy mô lớn với các cán bộ chuyên môn có đủ trình độ và kinh
nghiệm mới sử dụng được 3 Các thiết bị khác
a) Nổi hấp vô trùng ở áp suất cao (auioclave) : Dùng để khử trùng rất
nhiêu loại dụng cụ, môi trường nuôi cấy và một số nguyên liệu khác Đây là thiết bị đạt hiệu quả cao nhất trong các dụng eụ vô trùng vì nó đốt nóng môi trường bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao (hình 9)
Trang 9Hình 9 Nồi hấp vô trùng ở áp suất cao a) Các giỏ đựng dụng cụ, nguyên liệu đưa vào nồi hấp
b) Nhìn toàn cảnh nổi hấp bên
ngoài,
b) Tủ sấy :
Trang 10
Hình 11 Tủ cấy vô trùng
Trang 11e) Tủ ấm :
Thiết bị này có khả năng duy trì nhiệt độ thắch hợp cho quá trình nuôi cấy để nghiên cứu các đặc điểm sinh lắ vi sinh vật (hình 13)
g) Máy lắc :
Thiết bị này dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi theo các chiều khác nhau một cách đều đặn để tăng thêm
lượng ôxi hòa tan trong môi trường (hình 14) :
Hình 14 Máy lắc Hình 15 Máy li tam
h) Máy li tâm :
Máy này dùng để tách sinh khối tế bào trong môi trường nuôi cấy hoặc tách các tiểu phần có độ lắng khác nhau trong thành phần của tế bào
(hinh 15)
Trang 12i) May do pH: Hinh 16 May do pH Hình 17 Can phan tich 14 Dùng để xác định độ pH môi trường nuôi cấy vi sinh vật (hình 16) k) Cân :
Thiết bị này dùng để định lượng các chất trong quá trình làm môi trường nghiên cứu vi sinh vật (hình 17) Có nhiều loại cân khác nhau nhưng sử dụng nhiều nhất là cân
phân tắch
J} Tủ kinh lớn :
Tủ này được xây trên tường gồm nhiều kệ ngang bằng gạch men để đựng và bảo quản kắnh hiển vi Phần ngoài tủ làm bằng kắnh
Trên đây là những thiết bị rất cơ bản
của phòng thắ nghiệm vi sinh học Ngoài ra,
còn một số các thiết bị khác như máy sắc kắ, máy điện di, máy quang phổ, máy so màu - sẽ được giới thiệu trong nội dung các bài thực
Trang 134 Các nguyên liệu và dụng cụ khác
- Agar (còn gọi là thạch) thường ở dạng sợi khô hay dạng bột
~ Các loại thuốc nhuộm (sẽ giới thiệu cụ thể ở bài sau)
- Dầu bách hương : Dùng khi quan sát mẫu vật ở bội giác có độ phóng đại lớn (x 100) của kắnh biển vi
- Axêtôn dùng để lau vật kắnh và các tiêu bản có dầu Ở Vai x6 ding để lọc tiêu bản và làm nút bông ~ Giấy lọc - Giấy báo cũ để bao gói các dụng cụ ~ Bông thấm nước - Bông mỡ (không thấm nước) để làm nút bông cho ống nghiệm và bình tam giác
~ Các dụng cụ dùng để chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật : dao,
thớt, xoong nhôm, môi lớn và nhỏ
CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP
1 Xác định các loại dụng cụ chuyên dùng trong thực hành vi sinh học Nêu công dụng của chúng
2 Các thiết bị lớn cần được trang bị cho phòng thắ nghiệm vi sinh hoc là gì ? 3 Mỗi sinh viên tự tìm hiểu nguyên tắc hoạt động, cấu tạo và tắnh năng tác dụng
của một thiết bị dùng để khử trùng, một thiết bị dùng để nuôi cấy, một thiết bị dùng
để định lượng các yếu tố trong môi trường, một thiết bị dùng để quan sái mẫu vật thường được sử dụng trong phòng thắ nghiệm vì sinh học
Trang 14- BÀI 2Ợ
Ấ CHUẨN BỊ DỤNG CỤ NUÔI CẤY
I- MỤC ĐÍCH YÊU CẦU CUA BAI
1 Kiến thức lắ thuyết : Củng cố và khắc sâu các kiến thức sau : - Ảnh hưởng của các nhân tố vật lắ, hóa học đối với sự tên tại và phát triển của vi sinh vật
+ Nhân tố vật lắ bao gồm : các nhân tố nhiệt độ, độ ẩm, ánh
sáng, độ pH
+ Nhân tố hóa học bao gồm : các chất như axit, bazơ, muối kim loại, côn
- Nguyên nhân gây nên sự nhiễm trùng các dụng cụ là do sự tiếp
xúc với không khắ, với các dụng cụ hay vật phẩm có vi sinh vật
2 Kĩ năng thực hành : Hình thành và rèn luyện các kĩ năng sau :
- Làm trung tắnh và rửa dụng cụ - Bao gói và làm nút bông
- Khử trùng các loại dụng cụ và môi trường bằng nổi hấp khử trùng ở áp suất cao và tủ sấy
- Khử trùng môi trường bằng dụng cụ lọc vi khuẩn
II- HÓA CHẤT - NGUYÊN LIỆU VA DUNG CU CAN CHUAN BI
Trang 152 Dung cu
_Ở Hộp đựng phiến kắnh, lá kắnh, đĩa pétri
- Ống nghiệm, ống hút, ống đong các loại
- Đũa thủy tỉnh, que gạt, que cấy, đèn cổn, diém quet - Chéi, gié dé rita dung cu
~ Bình tam giác các loại
- Giấy dâu, giấy báo cũ, bông mỡ, bông thấm nước - Giá để ống nghiệm, ống hút
- Dao, kẹp Inox, kéo, đèn cồn, bếp điện
Quá trình chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật bao gồm các công việc sau : - Xử lắ dụng cụ ~ Bao gói dung cụ - Khử trùng dụng cụ IH - XỬ LÍ DỤNG CỤ 1 Nguyên tắc chung Các loại dụng cụ dùng để nuôi cấy vắ sinh vật phải đạt độ trung tắnh, thật sạch và trong, không bị nứt mẻ 2 Phương pháp xử lắ Để xử lắ các dụng cụ phải tiến hành qua 2 giai đoạn : - Trung tắnh dụng cụ - Rửa dụng cụ a) Phương pháp trung tắnh dụng cụ : - Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH = 7 (để kiểm tra độ trung tắnh)
- Hấp khử trùng dụng cụ ở 120` C trong 30 phút bằng nổi hấp điện - Lấy dụng cụ ra để nguội rồi kiểm tra pH của nước trong đụng cụ - - Nếu nước có pH kiểm thì tiếp tục ngâm dụng cụ vào dung dịch HƠI 2% cho đến khi kiếm tra lại và thấy nước có pH = 7 mới thôi
- Rửa kĩ bằng nước nhiều lần là dùng được
Trang 16b) Phương pháp rửa dụng cụ :
Nhìn chung các dụng cụ làm bằng thủy tỉnh có độ bên hóa học, chịu
được nhiệt độ cao, rất khác nhau về hình dạng và kắch thước Do vậy với
mỗi loại dụng cụ cần có phương pháp rửa khác nhau
* Phiến kắnh :
~ Với phiến kắnh cũ (đã dùng làm tiêu bản)
+ Chùi sạch mỡ hay vazơlin trên phiến kắnh bằng miếng vải
tẩm xilen hoặc ngâm tiêu bản vào dung dịch sunphôbicrômat trong 48h + Ngâm tiêu bản vào nước xà bông và đun sôi trong th + Rửa nước, để ráo
+ Ngâm tiêu bản vào cén 90ồ trong 12h + Lau khô chúng bằng vải mịn rồi sấy khô
- Với phiến kắnh mới cần kiểm tra độ pH và xử lắ để đạt độ trung tắnh (xem phần a)
YÊU CÂU : Các phiến kắnh sau khi rửa phải đạt tiêu chuẩn sạch mỡ
và trong Ổ
* Ong nghiém :
Chuẩn bị các loại chổi khác nhau (hình 18) để rửa các loại ống nghiệm - Với các ống nghiệm cũ đã bị nhiễm khuẩn :
+ Hấp khử trùng ở 120ồC trong 30 phút
+ Lấy ra và đổ các vật phẩm trong ống nghiệm đi + Ngâm ống nghiệm vào nước ấm
+ Rửa ống nghiệm bằng cách :
Ềồ Dùng chối chấm xà bông hay tro bếp cọ xát vào thành ống đêu khắp nhiễu lần
Rửa nước 2 - 3 lần
Úp ống nghiệm cho thật ráo nước và khô
Sấy khô trong tủ ấm 37ồC
- Với các ống nghiệm không nhiễm khuẩn hay chứa các vi khuẩn không gây bệnh thì không phải hấp khử trùng và tiến hành rửa như trên
Trang 17Pye a ieatilt ep U Hình 18 Các loại chổi dùng để rửa các dụng cụ thủy tỉnh * Đĩa pêtri :
- Đặt ngửa đĩa pêtri trong lòng bàn tay trái,
~ Tay phải dùng giê chấm tro có xà bông xát vào 2 mặt của đĩa các khe ở chân đĩa và thành đĩa - Rửa nước 9 - 3 lần , - Úp nghiêng các đĩa trong giỏ nhựa cho thật khô * Ống hút : ~ Dùng que hoặc đây thép nhỏ rút nút bông ở đầu lớn ống hút ra ~ Khử trùng ống hút ở 120ồC trong 30 phút
~ Ngâm vào dung dich sunphébicrémat 24h
- Xát kĩ 2 đầu và phần ngoài ống hút bằng giẻ với nước xà bông - Rửa phần trong ống bằng chổi lông và nước xà bông
- Dùng nước xả ngược để thông cặn pipet - Cắm ống hút trên giá, đầu nhọn để lên trên
* Các dụng cụ thủy tỉnh khác : gồm phẫu, chai, lọ, bình cầu, bình tam giác - Dùng giẻ với nước xà bơng cọ rửa phần ngồi dụng cụ
~ Đùng bi thủy tỉnh cùng với nước xà bông đặc lắc kĩ để rửa phần
trong dụng cụ :
- Rửa nước nhiều lần cho sạch và để ráo
Trang 18* Nút và ống cao su :
- Phân loại các dụng cụ này theo' kắch thước to, nhỏ, tốt, xấu, sạch hay bẩn
~ Ngâm từng loại riêng vào nước ấm (50 - 80ồC) trong 3 - 4h
- Cọ rửa kĩ trong nước xà bông
~ Rứa nước lã nhiều lần
Ở Phoi nắng 2 - 3h rồi cất đi dùng dần
IV- BAO GÓI DỤNG CỤ, 1 Nguyên tắc
~ Dung cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô
- Việc bao gói phải thật kắn và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử
trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng 2 Phương pháp bao gói dụng cụ
Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu :
- Lèm nút bông : cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que gạt
~ Bao gói : cho hầu hết các dụng cụ thủy tỉnh
a) Cách làm nút bông :
~ Với các ống nghiệm :
+ Lấy 1 miếng bông mỡ cuộn lại
+ Dùng que tre ấn vào đoạn giữa cuộn bông
+ Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm + Yêu cầu :
Ấ Nút có kắch thước, độ chặt vừa phải
Ấ Đầu nút tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm ề Lấy nút ra hay đóng vào đễ dàng
- Với các chơi, lọ, bình tam giác có kắch thước lớn : Cách làm tương
tự (hình 19) nhưng lượng bông sử dụng phải nhiêu hơn và bọc nút bằng 1
lớp vải gạc
- Với cúc pipet , dùng 1 sợi đây thép nhỏ nhét 1 ắt bông vào đầu
lớn của pipet để hạn chế không khắ từ miệng người hút vào ống hút
Trang 19
Hình 19 Cach làm nút bông
b) Cách bao gói dụng cụ :
- Với các dụng cụ sau khi làm nút bông, cần được bao gói phan có nút bông bằng giấy dầu hay giấy báo để khi hấp khử trùng nút bông không bị ướt, đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn Cách làm như sau :
+ Cắt các băng giấy hình chữ nhật với kắch thước tùy theo dụng
cụ cân bao gói,
+ Quấn băng giấy quanh phần đầu có nút bông
+ Gập ống giấy sát vào nút bông ở mặt trước và 2 bên + Gập nốt phần giấy còn lại và cài sâu vào trong
- Yêu cầu :
+ Phần giấy bao ngoài phải chặt và kắn + Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt
+ Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng
~ Với các dụng cụ như pipet, đĩa pêtri, que gạt phải dùng giấy bao
kắn toàn bộ Có thể thay giấy bao bằng 1 hộp nhôm kắn đựng tất cả các dụng cụ trên để khử trùng
V-_ KHỬ TRÙNG DỤNG CỤ 1 Nguyên tắc
- Sau khi khử trùng cần bảo đảm :
+ Sự vô trùng tuyệt đối cho các vật phẩm và các dụng cụ + Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật
Trang 20gh
2 Các phương pháp khử trùng
Khi khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật có thể bị tiêu diệt dễ dàng trong khi các bào tử vẫn còn tôn tại ở ngay nhiệt độ đó
Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào :
- Tắnh chất môi trường - Sế lượng tế bào
~ Độ pH của vật định khử trùng
Do vậy, để khử trùng bằng nhiệt có hiệu quả cần xác định ngưỡng nhiệt
độ thấp nhất và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ
vi sinh vật và các bào tử của chúng có trong dụng cụ cần khử trùng
Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt a) Khử trùng bằng sức nóng khô (nhiệt khô)
Dưới tác dụng của sức nóng khô, các cấu tử của tế bào vi sinh vật bị ôxi hóa, tế bào bị khơ hồn tồn và chết * Khử trùng bằng tủ sấy : - Phương pháp khử trùng này được thực hiện trong tủ sấy (xem lại bài 1) - Cách tiến hành : + Các dụng cụ khử trùng cần được bao gói cẩn thận và xếp vào tủ sấy + Bật công tắc để tủ hoạt động
+ Xoay các núm để điều chỉnh kim chắ trên đồng hổ nhiệt độ và kim chỉ trên đồng hồ thời gian tới các chỉ số mong muốn (160ồC trong 2h hay 180ồC trong 30 phút)
+ Nhiệt độ và thời gian mong muốn sẽ được duy trì nhờ bộ phận điều khiển tự động
+ Tắt tủ sấy, để nguội tới 60ồC mới mở tủ lấy dụng cụ Tránh
mở tủ lấy dụng cụ khi nhiệt độ tủ còn đang cao sẽ làm các dụng cụ thủy
Ộtinh dé bị nứt vỡ
+ Các dụng cụ sau khi sấy mà giấy bao có màu hơi vàng là đạt yêu cầu Nếu giấy bao có màu nâu chứng tỏ nhiệt độ khử trùng cao làm bông và giấy biến thành gondron (là hợp chất có tắnh sát trùng) thì không thể sử dụng dụng cụ này để nuôi cấy vi sinh vật được
Trang 21* Khử trùng bằng đốt qua lửa nung đô :
~ Phương pháp này dùng để khử trùng ống hút, que cấy, đầu các
ống nghiệm, miệng các bình tam giác sau khi lấy nút bông ra - Cách khử trùng :
+ Hơ dụng cụ trên ngọn đèn cồn, đưa qua đưa lại 3 - 4 lần Với các dây mayxo ở đầu que cấy phải nung cho thật đồ hết chiều dai phần dây cấy
+ Đợi cho dụng cụ nguội mới được dùng để tránh vỡ dụng cụ và
vi khuẩn không bị tiêu diệt khi lấy giống Cũng có thể nhúng dụng cụ vào côn 90Ợ rồi đốt nhiều lần để khử trùng
b) Khử trùng bằng sức nóng ướt
* Dun sdéi trong nude :
- Phương pháp này dùng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ : kim tiêm, kéo, kẹp, dao, cốc thủy tỉnh, chai, lọ v.v
- Cách khử trùng :
+ Dùng nước máy sạch đổ ngập dụng cụ + Đun sôi từ 30 phút đến ih
Phương pháp này chỉ có tác dụng diệt tế bào sinh dưỡng mà không
diệt được bào tử vi sinh vật Để khắc phục hạn chế này người ta pha thêm
vào nước axit phênic 5%
* Đun cách thủy ở nhiệt độ thấp (Phương pháp khử trùng Pasteur) :
~ Phương pháp này dùng để khử trùng các thực phẩm dễ biến tắnh
ở nhiệt độ cao như sữa, bia, rượu - Cách khử trùng :
+ Dun nóng môi trường lên 60 - 7đồC trong 15 - 30 phút hoặc ' đun nóng lên 80ồC trong 10 - 15 phút
~ Phương pháp này chỉ có khả năng ức chế các vi khuẩn không
có bào tử,
* Hấp cách quãng 100ồC (Phương pháp Tyndal) :
~ Phương pháp này dùng để hấp khử trùng một số loại môi trường
nuôi cấy men bánh mì, men gia súc, mốc làm nước chấm v.v - Cách khử trùng :
+ Hấp môi trường ở 100ồC từ 30 - 40 phút
Trang 22
+ Lấy ra để tủ ấm 24h cho các bào tử của vi sinh vật nảy mầm
+ Hấp môi trường lần thứ hai ở 100ồC trong 30 - 40 phút để tiêu diệt các bào tử vừa nảy mầm
+ Lặp lại quá trình này từ 3 - 4 lần
- Kết quả : Môi trường vừa được vô trùng vừa đảm bảo chất lượng không bị biến đổi
* Khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao :
Phương pháp này thực hiện trong nổi hấp vô trùng ở áp suất cao
(autoclave) Đó là thiết bị làm bằng kim loại, chịu được nhiệt độ và áp suất:
cao (xem hình ở bài 1), có khả năng tự động điều chỉnh áp suất và thời gian
khử trùng theo yêu cầu của người sử dụng ~ Nguyên tắc hoạt động :
+ Làm gia tăng nhiệt để khử trùng các vật bằng hơi nước bảo hòa dưới áp suất lớn hơn áp suất bình thường của khắ quyển Khi áp suất hơi nước tăng thì nhiệt độ trong nổi cũng tăng theo nhờ hệ thống van rất
chặt chẽ
+ Mối quan hệ giữa áp suất ghi trên áp kế với nhiệt độ trong nổi biểu hiện qua bảng dưới đây Áp suất (atm) | Nhiệt độ (0ồC) 0 100 Ẽ 0,5 112 1,0 121 1,5 128 2,0 134 - Cách sit dung :
+ Chuẩn bị các dụng cụ chứa môi trường (ống nghiệm, bình tam giác đã được bao gói phần nút bông để tránh làm ướt nút bông)
Trang 23+ Điều chỉnh kim déng hồ thời gian khử trùng về chỉ số mong muốn
+ Cắm phắch điện (cung cấp điện cho nổi) + Bật công tắc khử trùng của nổi hấp
+ Nhờ sự điều khiến của hệ thống tự động, quá trình hấp khử trùng diễn ra và kết thúc bằng còi báo hiệu
+ Rút hết nước trong nổi hấp ra bằng cách hạ ống dẫn xuống + Gat cong tắc từ khử trùng sang sấy khô
+ Chờ kim áp kế trở về số 0 mới mở nắp nổi lấy dụng cụ, vật
liệu đã khử trùng ra
+ Rút phắch điện (ngưng cung cấp điện cho nổi hấp)
+ Dán nhãn ghi ngày - tháng - năm khử trùng vào dụng cụ hay
nguyên liệu vừa khử trùng để tiện việc sử dụng
- Chú ý : Để đảm bảo an toàn và hiệu quả của việc hấp khử trùng, người làm thắ nghiệm cần phải :
+ Kiểm tra lại nổi hấp trước khi sử dụng
+ Thận trọng thực hiện đúng quy trình được chỉ dẫn
+ Tránh cung cấp điện đột ngột để không gây vỡ dụng cụ, nguyên
liệu hoặc gây nổ nguy hiểm
+ Truc tiếp theo đõi quá trình hấp khử trùng cho đến khi kết thúc và ngắt điện
+ Định kì kiểm tra chất lượng đồng hồ áp kế và van an toàn Tóm lại, phương pháp hấp khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suấc cao là phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất trong các phương pháp khử trùng nhờ khả năng tiêu diệt được cả tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử của
vi sinh vật
Gần đây, một số phòng thắ nghiệm vi sinh vật học của các viện và trường đã được trang bị mới loại nổi hấp áp suất cao dưới dạng tủ hình
khối chữ nhật gọn, đẹp và tiện sử dụng hơn nhưng nguyên tắc hoạt động
vẫn giữ nguyên
Trang 24
Hình 20- Tủ hấp áp suất cao c) Khử trùng bằng cách lọc :
Phương pháp này dùng để khử trùng các loại môi trường không thắch
hợp với phương pháp khử trùng ở nhiệt độ cao (như môi trường huyết thanh, dung dịch anbumin đôi khi cả môi trường đường) Ngoài ra có thể dùng biện pháp này để tách các vi sinh vật với các sản phẩm trao đổi chất của chúng trong dung dịch nuôi cấy
* Nguyên tắc :
Cho dung dịch đi qua màng lọc (của dụng cụ lọc) mà kắch thước lỗ màng nhỏ hơn kắch thước vi sinh vật cân lọc Nhờ đó dịch qua lọc được
vô trùng
* Cấu tạo bình lọc :
Có rất nhiều loại dụng cụ lọc khác nhau nhưng phổ biến nhất là bình lọc Seilz Cấu tạo của nó gồm 3 bộ phận :
- Bộ phận trên có hình trụ để chứa dịch lọc (ống lọc) - Bộ phận ở dưới để chứa dịch đã qua lọc
- Bộ phận ở giữa là màng lọc (quan trọng nhất)
Trang 25Màng lọc bằng amiăng, hình tròn, dày khoảng 3 - 5 mm Cả 3 bộ phận trên liên kết với nhau nhờ các ốc vắt
Bình lọc này có thể được nối với 1 bình tam giác có vòi hút chân không để tạo nên sự chênh lệch áp suất giữa trên và dưới màng lọc do đó làm tăng tốc độ lọc Hình 21 Dụng cụ lọc vi khuẩn a) Binh đựng dịch qua lọc b) Bình trung gian c) Bình đựng dịch để lọc (ống lọc) d) Bộ phận hút chân không * Cách tiến hành lọc : - Hấp khử trùng ống lọc, bình chứa dịch lọc và các phụ tùng kèm
theo ở 1 atm trong 30 phút
- Đặt màng lọc vào giữa ống lọc và bình đựng địch lọc rồi cố định 3 bộ phận này nhờ các ốc vắt
{
- Đổ dịch lọc vào ống lọc
- Nối bình đựng dịch lọc với bình tam giác được gắn với bình hút chân không Trong đoạn vòi nối có bông để hạn chế sự nhiễm trùng dịch lọc - Cho máy hút chân không hoạt động để đưa độ chênh lệch áp suất lên từ từ và dịch lọc chảy thành từng giọt Áp suất tạo ra không quá
3ã - 40 cm thủy ngân
- Thời gian lọc không được kéo dài quá 30 phút
- Lọc xong, lấy một ắt dịch lọc cấy vào môi trường thạch - nước
thịt peptôn, để trong tủ ấm 37C Kiểm tra độ vô trùng của dịch đã lọc - Bỏ màng lọc đi vì màng này chỉ được sử dụng 1 lần
Trang 26d) Tủ cấy vô trùng :
Thiết bị này dùng để thực hiện các thao tác phân phối môi trường vào các dụng cụ, cấy truyền, nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn vi sinh vật
(xem hình 10 bài 1) * Nguyên tắc :
Bầu không khắ bên trong tủ cấy (nơi diễn ra các thao tác cấy truyền, phân lập .) luôn được bảo đảm về sự vô trùng hay ắt nhất cũng hạn chế tối đa sự tổn tại của các vi sinh vật không mong muốn cũng như các
bào tử của chúng
* Cấu tạo : gồm 3 bộ phận chắnh
- Tủ kắnh có cửa để đưa vào hay lấy ra các dụng cụ
- Phắa trước tủ (nơi người tiến hành thắ nghiệm đứng thao tác) có đôi găng tay bằng chất dẻo tống hợp, mềm được gắn với 2 lỗ tròn giúp cho người thắ nghiệm tiến hành các thao tác dễ dàng mà vẫn đảm bảo sự
vô trùng cho không khắ trong tủ cũng như sự an toàn cho họ khi tiếp xúc với vi sinh vật gây bệnh
- Hệ thống bơm và lọc không khắ bên ngồi thành khơng khắ vô
trùng thổi vào tủ đồng thời với bộ phận hút khắ ra để đảm bảo sự cân bằng áp suất trong và ngoài tủ
* Chú ý: khi tiến hành xong các thao tác thực hành trong tủ cân
chuyển ngay các hóa chất, dụng cụ, nguyên vật liệu ra khỏi tủ, vô trùng lại
rồi mới tắt hệ thống bơm lọc khắ của tủ
CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP
1 Trình bày những nguyên tắc cơ bản của việc xử lắ, bao gói các dụng cụ - 2, Thực hành rửa và bao gói các loại dụng cụ : ống nghiệm, ống hút, que gạt, đĩa pêtri, bình tam giác, phiến kắnh
3 Phân tắch cơ sở vắ sinh học của các phương pháp khử trùng Pasteur, phương pháp khử trùng Tyndai và khử trùng bằng tủ sấy
4 Tóm tắt cách sử dụng nồi hấp áp suất cao
5 Thực hành lọc khử trùng môi trường bằng bình lọc Seilz và kiểm tra độ vô trùng của dịch lọc
6 Trình bày nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của tỦ cấy vô trùng
Trang 27ỔBAL BÀI 3-
_THỰC HANH CHẾ: TẠO Mor TRƯỜNG
độ _ DINE DUONG ẹ Tek
- MỤC ĐÍCH VA YEU CAU CUA BAI
1 Kiến thức lắ thuyết : Củng cố và hình thành mới các kiến thức sau : ~ Khái niệm về môi trường dinh dưỡng
- Yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng
~ Cơ sở phân loại môi trường dinh dưỡng
- Nguyên tắc cơ bản của việc chế tạo môi trường dinh dưỡng 2 Kĩ năng thực hành : Củng cế và hình thành mới các kĩ năng sau :
- ỉ năng sử dụng các dụng cụ : cân phân tắch, ống đong, pipet, giấy
- do pH, nổi hấp áp suất cao, tủ ấm - Cân đong và pha chế hóa chất
- Làm trong môi trường
- Điều chỉnh pH và khử trùng môi trường - Kiểm tra kết quả khử trùng
- Bảo quản môi trường
II- HÓA CHẤT - NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC DỤNG CỤ CAN CHUAN BI
1 Hóa chất - nguyên liệu
Tùy theo yêu cầu và điều kiện thực tế của phòng thắ nghiệm ta chuẩn bị các nguyên liệu, hóa chất của một số loại môi trường để sinh viên thực hành
2 Dụng cụ
~ Chuẩn bị số lượng các dụng cụ đủ dùng cho số sinh viên trong một nhóm
- Các dụng cụ này gồm các loại sau : + Ống nghiệm, giá để ống nghiệm + Đĩa pétri
Trang 28+ Bình tam giác 250 mì
+ Cốc thủy tinh 250 ml
+ Ống đong, pipet các loại, đũa thủy tỉnh
+ Phẫu thủy tỉnh lớn, nhỏ + Vải lọc, giấy lọc, giấy bao gói + Bông mỡ, bông thấm nước, đèn cền
+ Aoong nhôm, đao, thớt
Iil- MOI TRUONG DINH DUONG
1, Khái niệm
- Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào
- Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế ôxi hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường
2 Các yêu cầu cơ bắn của môi trường dinh dưỡng ~ Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết
- Có độ pH thắch hợp - Có độ nhớt nhất định
~ Không chứa các yếu tố độc hại
- Hồn tồn vơ trùng
3 Phân loại môi trường đỉnh dưỡng
Người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường
a) Căn cứ theo thành phần và nguồn gốc : Có 3 loại môi trường là : Ở Môi trường tự nhiên : Có thành phân môi trường là các sản phẩm
tự nhiên như sữa, trứng, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám Thành
phần hóa học của loại môi trường này không được xác định chắnh xác do
tắnh chất không ổn định của sản phẩm tự nhiên
Ở Môi trường tổng hợp : Là môi trường gỗm các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và định lượng một cách cụ thể và
Trang 29Ở Môi trường bán tổng hẹp : Là môi trường mà thành phần gồm cả hóa chất lẫn các chất hữu cơ tự nhiên
b) Căn cứ vào tắnh chất lắ học : Có thể chia môi trường thành 8 loại Ở Môi trường lỏng (dịch thể) :
Thành phần môi trường này không chứa thạch (agar) và thường
được dùng để nghiên cứu quá trình vi tổng hợp của vi sinh vật
Ở Môi trường đặc :
Trong thành phẩn môi trường này chứa 1,5 - 2% agar hoặc 10 - 20% gêlatin và dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh H
của vi sinh vật,
Ở Môi trường bán lỗng -
Môi trường này chứa 0,35 - 0,7% agar
c) Căn cứ vào công dụng : Có thể gồm các loại môi trường sau :
Ở Môi trường cơ bản : Thắch hợp cho nhiều loại vi sinh vật khác nhau Ở Môi trường chọn lọc : Là môi trường đảm bảo cho sự phát triển ưu
thé cia 1 loài hay 1 nhóm loài vi sinh vật xác định nào đó
+ Vắ dụ : môi trường dùng để phân lập, nuôi cấy vi khuẩn cố dịnh đạm, vi khuẩn nitrat hóa
Ở Môi trường kiểm định : Là môi trường cho phép phân biệt được một
số đặc điểm của một số loài vi khuẩn cẩn xác định Thường người ta hay cho vào các môi trường kiểm định một số chất chỉ thị màu hay một số hóa chất để tạo ra những phản ứng màu đặc trưng
+ Vắ dụ : môi trường kiếm định kháng sinh, môi trường lên
men các loại đường
4 Phương pháp làm môi trường
Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng
a) Nguyên tắc của việc chế tạo môi trường :
- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất đinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loài vi sinh vật,
- Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường
và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỉ lệ và néng dé cdc chat trong
thành phần môi trường
Trang 30- Đảm bảo các điểu kiện hóa lắ cần thiết cho các hoạt động trao đổi
chất của vi sinh vật
b) Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng : ể Pha chế :
Cân, đong thật chắnh xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự hướng dẫn trong tài liệu
+ Môi trường lỏng : Cân, đong các chất rồi cho hòa tan vào nước
+ Môi trường đặc -
+ Can agar réi ngâm vào nước
+ Cân hóa chất rồi hòa tan trong nước
+ Vớt agar ra, vắt khô, bỏ vào xoong môi trường để dun
~ kàm trong môi trường :
Việc làm trong môi trường sẽ giúp ta dễ dàng quan sát sự phát
triển của vi sinh vật Có thể làm bằng một trong các cách sau :'
+ Cách 1 : Lọc bằng bông, vải thưa hay giấy lọc + Cách 2 : Lọc bằng lòng trắng trứng gà
ề+ Cứ 1 lắt môi trường dùng lòng trắng của 1 quả trứng Lấy lòng trắng trứng + lượng nước bằng lượng lòng trắng, đánh tan cho sui bot
Đổ hỗn dịch trứng và nước trên vào môi trường
Trộn đều, đun sôi 10 - 15 phút
+ Để lắng rồi mới lọc
- Ở Điều chỉnh độ pH của môi trường :`
+ Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường người ta dùng HƠI 10% hay NaCl 10% Ngoài ra có thể dùng một số hóa chất khác như : HạPOƯ,
HạSOƯ, KOH, NaHCO;, NaeCO3
+ Muốn kiểm tra độ pH của môi trường ta nên dùng máy đo pH
(pH-metre) Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chắnh xác cao Trong phòng
thắ nghiệm có thể dùng chỉ thị màu xanh bromotimol hay giấy quỳ để đo pH
Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng không cho độ chắnh xác cao ~ Phân phốt môi trường vào dụng cụ :
Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa pêtri, bình tam giác Trình tự phân phối gồm các bước sau :
Trang 31+ Môi trường cần được đun cho hóa lỏng rồi đổ qua phẫu thủy
tỉnh vào các dụng cụ
+ Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường + Tay phải kẹp nút bông và kéo ra
+ Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại + Chú ý :
+ Đối với ống nghiệm : Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường cần được phân phối chiếm 1⁄4 thể tắch của ống nghiệm
Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cẩn được phân phối từ 1⁄2 - 1⁄3 thể tắch ống nghiệm
ề Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm 1⁄2 - 2⁄3 thể tắch của bình
ềỔ Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi
trường không dắnh lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và
việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc Ở Khử trùng môi trường : Tùy theo tắnh chất và điểu kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau Các phương pháp khử trùng thường được sử dụng là : + Phương pháp Pasteur + Phương pháp Tyndal + Phương pháp lọc bằng dụng cụ lọc vi khuẩn,
Trang 32ể-
ể Làm thạch nghiêng, thạch đúng, để thạch vào đĩa pêtri :
+ Làm thạch nghiêng : Cân tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc
- Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng nhưng không được để môi trường chạm vào nút bông
Ấ Để yên chơ đến khi mặt thạch đông đặc Yêu cầu mặt thạch - phải phẳng, nhãn, liên tục (hình 22-a)
Hình 22 Đặt thạch nghiêng (a)
Đặt thạch đứng (b)
- _ + Lam thạch đứng : Đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá (hình 22-b), để yên cho đến khi môi trường nguội và
đông đặc ,
+ Đổ thạch uào đĩa pêtri :
" Toàn bộ quy trình đổ thạch vào đĩa pêtri đều thực hiện trong
tủ cấy vô trùng và gồm các thao tác sau :
ềỔ Mở bao giấy gói các đĩa pêtri
+ Tay phải cẩm dụng cụ (bình tam giác) chứa môi trường
of Mu trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn
cồn
ềỔ Nghiêng bình và rót nhẹ một chút môi trường vào đĩa pêtri
sau khi tay trái mở hé nắp trên của đĩa
Trang 33ềỔ Đậy nắp trên lại, xoay tròn đĩa pêtri để môi trường được phân phối đều trên mặt đĩa
Ấ Để yên cho môi trường nguội và đông đặc
Lật ngược cho đáy dưới của đĩa pêtri lên trên để hơi nước bốc ra và khô dần đi
+ Chú ý :
Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn
Mặt thạch phải phẳng, nhẫn, có độ dày khoảng 2 mm.Thông thường cứ 1⁄4 lắt môi trường có thể phân phối được 22 - 25
đĩa pêtri
Sau khi đổ môi trường vào đĩa pêtri, lL - 2 ngày sau khi
kiểm tra lại xem môi trường có bị nhiễm khuẩn không rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập
Nhớ viết vào nhãn : Tên môi trường
Khử trùng ngày tháng năm
Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện cho việc theo dõi, sử
dụng và bảo quản Ở Bảo quản và kiểm tra môi trường :
+ Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ O - đỢC và không để môi trường bị khô + Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 37ồC , trong 48 - 72h Sau lấy ra quan sát, loại bổ các ống có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa pêtri có môi trường đạt yêu cầu
IV - CÔNG THỨC VÀ CÁCH CHẾ TẠO MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THƠNG DỤNG 1 Mơi trường ni cấy vắ khuẩn
Trang 34- Cách chế nước chiết thịt :
+ Thịt bò tươi lọc sạch gân, mỡ, bạc nhạc đem xay hoặc thái nhỏ Cứ 500 g thịt thêm 1000 mÌ nước
+ Đưn nóng từ từ, giữ ở 50ỢC trong 1h Sau đó đưn sôi 30 phút + Để nguội và lắng trong dung địch vừa đun
+ Lọc bằng vải hay giấy lọc
+ Phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng b) Môi trường nước mắm - peptôn : ~ Công thúc : Nước mắm 35ồ đạm 30ml Peptôn 10g Nước cất bổ sung đến 1000ml pH = 7, khử trùng 1 atm / 30 phút ẹ) Môi trường thạch - nước thịt - peptôn : - Công thức : Nước thịt 1000ml Peptôn l0g Thạch (agar) 20g pH = 7, khử trùng 1 atm / 30 phút
~ Cách chế tạo hỗn dịch (thạch + nước thịt + peptôn)
+ Cho 10 g peptôn vào nước thịt
+ Thạch cân xong, ngâm nước, rửa kĩ, để ráo
+ Cho thạch vào dung dịch nước thịt - peptôn
+ Bun séi cho tan và để nguội 45ồC + Điều chỉnh độ pH rồi mới lọc
Trang 35- Cách chế tạo dịch chiết nấm men :
+ Lấy 70 - 100 g nấm men ép hay 7 - 10 g nấm men khô + Thêm 1000 mì nước rồi đun sôi 30 phút và khuấy thường xuyên + Để lắng rồi gạn lấy phần trong
+ Thêm nước cho đủ 1000 ml rổi lại đun sôi 20 phút + Để nguội rồi lọc lấy phần trong
+ Khử trùng bằng phương pháp Tyndal
e) Môi trường Ashby :
Dùng để nuôi cấy vi khuẩn Azotobacter Mannit 20g K;HPO, 0,2g MgSO,.7HạO 0,2g NaCl 0,2g RạSO, 0,1g CaCO, 5g Nước cất 1000m] Thạch (agar) 20g pH = 7 > 7,5
2 Môi trường nuôi cấy nấm men a) Môi trường mầm lúa :
- Cách chế tạo :
+ Lấy lúa hay đại mạch ủ cho nảy mắm + Lấy mâm đem phơi khô, xay thành bột + Cân 1kg bột mâm + 3000 mÌ nước
+ Đun cách thủy 60ồC để đường hóa tỉnh bột
+ Thử với iôt không thấy dung dịch có màu xanh nữa thì kết thúc + Lọc lấy dịch đường trong
+ Thêm nước tới nồng độ 10ồ Brix
+ Phân vào dụng cụ và khử trùng
Trang 36b) Môi trường khoai tây - đường cám : Khoai tây 300g Cám 100g Đường kắnh 50g Nước 1000ml - Cách chế tạo :
+ Khoai tây gọt vỏ, rửa, cân 300 g, thái nhỏ hạt lựu Thêm
500 ml nước rồi đưn sôi 30 phút + Lọc lấy nước trong
+ Cân 100 g cám đưn sôi với đ00 ml nước trong 30 phút rỗi
lọc trong
+ Trộn 2 dịch lọc trên với nhau và thêm 50 g đường
+ Bổ sung nước cho đủ 1000 ml
+ Nếu làm môi trường đặc thêm 20 g thạch Chú ý : Cũng có thể không cần dùng cám,
c) Môi trường giá đậu - đường :
Cân 100 g giá đậu Thêm 1000 mì nước Đun sôi 30 phút Lọc layỢ dịch trong Bổ sung nước cho đủ 1000 ml và thêm 50 g đường Nếu làm môi
trường đặc thì thêm 20 g thạch Phân phối môi trường rồi khử trùng
Trang 373 Môi trường nuôi cấy nấm mốc
a) Môi trường khoai tây : - Cách chế tạo :
+ Khoai tây gọt vỏ, cắt thành đoạn hình trụ có đường kắnh gần bằng đường kắnh ống nghiệm và chiểu dài bằng 1⁄4 - 1⁄2 chiểu dài ống
nghiệm
+ Cat vat để chia hình trụ này thành 2 phân đều nhau
+ Dưới đáy ống nghiệm để 1 ắt bông thấm nước: + Thêm 1 mÌ nước vào mỗi ống nghiệm
+ Đưa thôi khoai tây vào ống nghiệm + Đậy nút bông và khử trùng
Trang 38Ụ 40 Glucéza Peptôn KyHPO, MgS0,4.7H,O0 Nước cất Thạch (agar) 10g 5g 1g 0,5g 1000ml 20g pH = 4, sau khi khử trùng e) Môi trường cơm rượu : Cơm Axit lactic (1%) Nước cất Rugu (50%) - Cách chế tạo : 10g 40ml 15m] 12,5ml + Cho cơm, axit lactic, nước cất vào bình tam giác + Khử trùng ở 1 atm / 15 phút
+ Lấy ra để nguội mới cho rượu 4 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Trang 39Nước máy 1000ml Thach (agar) 20g pH = 7,2 c) Môi trường tỉnh bột - kali nitrat : KNOsa 1g faHPO, 3g NaCl 0,2g MgCO3 0,3g Tinh bét tan 10g FeSO, 0,001g CaCO, 0,5g Nước máy 1000ml Thạch (agar) 20g pH = 6,8`- 7,2 đ) Môi trường cao ngô : Cao ngô lỗg Peptén 5g NaCl 5g Glucéza 10g Nước cất 1000ml Thạch (agar) 20g
CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP
1 Trình bày những nguyên tắc cơ bản của việc chế tạo môi trường dinh dưỡng 2 Nêu các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng
3 Mỗi nhóm sinh viên thực hành chế tạo 3 loại môi trường sau đây :
~ Môi trường tự nhiên cho vi khuẩn ~ Môi trường bán tổng hợp cho nấm men ~ Môi trường tổng hợp cho xạ khuẩn
4 Mỗi nhóm sinh viên thực hành khử trùng 1 trong 3 loại môi trường vừa chế tạo
bằng nổi hấp áp suất cao và phân phối vào ống nghiệm, đĩa pêtri
5 Kiểm tra kết quả khử trùng bằng cách để các ống nghiệm hay đĩa pêtri vào tủ ấm từ 2 - 3 ngày, ở 37ồC để xác định xem có vi sinh vật phát triển trong đó không ?
Nếu có hãy giải thắch nguyên nhân của hiện tượng này
Trang 40
I MUC DICH VA YEU CAU CUA BAI
1 Kiến thức lắ thuyết : Hình thành mới các kiến thức sau :
- Ý nghĩa của việc phân lập, nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật trong công tác nghiên cứu vi sinh vật học
- Các nguyên tắc cơ bản của quá trình phân lập - nuôi cấy - bảo
quản vi sinh vật
2 Kĩ năng thực hành : Củng cố và hình thành mới các kĩ năng sau : ~ Ki nang phan lap vi sinh vat hiéu khi va ki khi :
+ Tao ra những khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thé vi sinh vật:
+ Tách các khuẩn lạc riêng biệt trên môi trường thạch ở đĩa pêtri
để cấy truyền
+ Kiểm tra độ tỉnh khiết của giống mới phân lập - ỉ năng nuôi cấy vi sinh vật hiếu khắ và kị khắ :
+ Các thao tác cấy truyền từ ống giống sang các lối mơi trường
thạch nghiêng, thạch đứng, thạch đĩa
+ Các kiểu cấy khác nhau trên các kiểu môi trường trên - Ki năng bảo quản các chủng vi sinh vật thuần khiết :
+ Bảo quản trên môi trường thạch + Bảo quản trên cát, trên hạt
+ Bảo quản bằng phương pháp đông khô
II- HÓA CHẤT - NGUYÊN LIỆU VÀ DỤNG CỤ CẨN CHUẨN BỊ
1 Hóa chất - nguyên liệu
- Môi trường thạch đĩa, thạch đứng, thạch nghiêng để nuôi cấy các vi sinh vật kị khắ và hiếu khắ,
- Các ống giống nấm men, nấm mốc, vi khuẩn