Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương (Chương trình POHE)

10/21/2018 THỰC HÀNH Bài 1: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN SOI TƯƠI NỘI DUNG: Phương pháp làm tiêu soi tươi Vi sinh vật đại cương (Chương trình POHE) Quan sát tiêu nấm mốc MỤC ĐÍCH: Làm quen với cấu tạo kính hiển vi quang học Nắm cách sử dụng Học cách làm tiêu soi tươi (không nhuộm) Quan sát tiêu nấm mốc NỘI DUNG BÀI PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH VÀ NHUỘM MÀU GRAM BÀI QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT BÀI PHƯƠNG PHÁP LÀM MÔI TRƯỜNG BÀI NUÔI CẤY VI SINH VẬT BÀI ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CỦA VSV TRÊN CÁC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY BÀI CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯỢNG TB VSV II Phương pháp làm tiêu soi tươi - Tiêu soi tươi: Lấy trực tiếp mẫu đặt lên phiến kính để quan sát, khơng cần nhuộm màu - Tiêu bảo quản lâu dài - Thực hành: + Phương pháp làm tiêu giọt ép (quan sát nấm men) + Phương pháp làm tiêu nấm mốc 2.1 Các bước chuẩn bị: - Mẫu vi sinh vật cần quan sát: + Mẫu lỏng: Dung dịch nuôi cấy nấm men Saccharomyces sp + Mẫu rắn: Đĩa nuôi cấy nấm mốc: Aspergillus sp., Rhizopus/Niger, Penicillium - Các dụng cụ khác: Lam kính, que cấy, ống hút Pasteur, đèn cồn, bút viết kính, panh kẹp, lamen, dao cắt mẫu … - Dung dịch soi tươi: Dung dịch phenol 10/21/2018 2.2 Phương pháp làm tiêu giọt ép Bước 1: Tiệt trùng lam kính cách hơ lam kính lửa đèn cồn vài lần Sau đó, ghi tên mẫu lên tiêu Bước 2: Sử dụng ống hút Pasteur lấy giọt mẫu, đặt lên lam kính  nhỏ giọt phenol  trộn Bước 3: Đặt lamen nghiêng góc 45o, từ từ đậy lamen xuống cho lamen phủ kín giọt dung dịch mẫu khơng có bọt khí Bước 4: Quan sát kính hiển vi với vật kính 40x 2.3 Phương pháp làm tiêu nấm mốc (soi tươi) Bước 1: Tiệt trùng lam kính cách hơ lam kính lửa đèn cồn vài lần Sau đó, ghi tên mẫu lên tiêu Bước 2: Sử dụng que cấy đầu nhọn dao cắt mẫu cắt phần thạch có chứa mẫu  đặt lên lam kính Bước 3: Quan sát kính hiển vi với vật kính 4x 10x 10/21/2018 Yêu cầu báo cáo thực hành Quan sát tiêu làm sẵn + Tiêu nấm mốc (vật kính 4x, 10x) Quan sát tiêu tự làm + Tiêu nấm men với vật kính 40x + Tiêu nấm mốc với vật kính 10x Mơ tả hình thái (u cầu vẽ hình)  Hình thái: Cho biết hình thái nấm men nấm mốc  Đặc điểm sinh sản (nấm men, nấm mốc): nảy chồi ?, hình thành bào tử gì? Bài 2: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH VÀ NHUỘM MÀU GRAM NỘI DUNG: Phương pháp làm tiêu cố định Phương pháp nhuộm màu Gram MỤC ĐÍCH: Nắm thực hành cách làm tiêu cố định phương pháp nhuộm Gram I Phương pháp làm tiêu cố định - Tiêu cố định nhuộm màu dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái học vsv, kiểm tra độ khiết giống… - Tiêu bảo quản lâu dài - VSV quan sát giết chết trình xử lý  an tồn cho người quan sát 1.1 Các bước chuẩn bị: - Chuẩn bị mẫu vật gồm: + Mẫu lỏng: dung dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic + Mẫu rắn: 01 ống thạch nghiêng nuôi cấy TB nấm men - Chuẩn bị dụng cụ gồm que cấy, đèn cồn, nước cất vơ trùng, bút viết kính, lam kính - Chuẩn bị lam kính: + chọn lam kính sạch, hơ qua lại lửa đèn cồn để làm + Sử dụng bút viết kính ghi ký hiệu mẫu tiêu cần nhuộm 1.2 Các bước làm tiêu cố định Bước 1: Chuẩn bị vết bơi: Lấy lam kính tiệt trùng; sử dụng bút viết kính vẽ lên vịng trịn  định vị vùng làm vết bôi Bước 2: Làm vết bôi + Đối với mẫu lỏng: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy giọt mẫu, đặt lên vòng tròn lam kính dàn mỏng + Đối với mẫu rắn: Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1-2 giọt nước cất đặt lên vòng tròn; Tiệt trùng que cấy tiếp tục lấy mẫu ống giống; hòa tan với giọt nước cất  dàn mỏng Bước 3:Làm khơ: để khơ tự nhiên nhiệt độ phịng Bước 4: Cố định vết bôi: kẹp chặt tiêu bản, hơ qua lại tiêu lửa đèn cồn vài lần Mục đích bước cố định tiêu bản: - Giết chết vsv an toàn cho người quan sát giúp cho vsv bắt màu tốt - Giúp cho vsv gắn chặt vào lam kính  rửa khơng bị trơi - Giữ ngun hình dạng kích thước nhuộm Lưu ý: + tránh đun tiêu ướt lửa đèn cồn + Tiệt trùng que cấy sau sử dụng 10/21/2018  Bước 1: Nhỏ dung dịch Tím gentian ngập vết bơi  để 1-2 phút Sau rửa thuốc nhuộm thừa với nước sạch: Nghiêng lam kính 45o, cho nước chảy từ đầu đến cuối lam kính, đến nước chảy khơng cịn màu tím  Bước 2: Cố định màu với dung dịch Lugol: nhỏ dung dịch ngập vết bôi, để phút  Rửa với nước  vẩy khô  Bước 3: Tẩy màu với cồn axeton: Nghiêng phiến kính 45o, để cồn chảy từ đầu đến cuối phiến kính khơng cịn màu tím Sau rửa lại nước sạch, vẩy khơ Cố định tiêu  Bước 4: Nhuộm màu với đỏ Fuchsin: Nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi, để phút  Rửa thuốc nhuộm thừa với nước sạch làm khô, sử dụng giấy thấm hơ qua lửa đèn cồn Tiêu sau cố định II Phương pháp nhuộm Gram 2.1 Lịch sử: - Là phương pháp nhuộm màu nhằm phân biệt vi khuẩn Gram âm Gram dương - Do Christian Gram (1853-1938), nhà vật lý người Đan mạch phát minh 2.2 Chuẩn bị thuốc nhuộm - Dung dịch thuốc nhuộm thứ nhất: Tím gentian/ Crystal violet - Dung dịch cố định màu: Dung dịch lugol - Dung dịch tẩy màu: Cồn axeton - Dung dịch thuốc nhuộm thứ hai: Đỏ phenol/ Fuchsin/ Safranin - Nước rửa: Nước 2.3 Các bước nhuộm Gram Gồm bước Pseudomonas (gram -) Lactobacillus sp (gram +) E coli (gram -) Staphylococcus aureus (gram +) Salmonella (gram -) Bacillus cereus (gram +) 10/21/2018 Bài 3: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT NỘI DUNG: Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi quang học Nấm men: giả khuẩn ty (mũi tên) Nấm men Saccharomyces Quan sát tiêu nhuộm MỤC ĐÍCH: Nắm thực hành cách làm tiêu cố định phương pháp nhuộm Gram nảy chồi (mũi tên) Quan sát số hình thái nấm mốc, vi khuẩn nấm men Nấm men nảy chồi (mũi tên) Yêu cầu báo cáo thực hành Mô tả thực hành phương pháp làm tiêu cố định + Tiêu vi khuẩn lactic + Tiêu nấm men Thực hành phương pháp nhuộm Gram với tiêu tự làm + Trình bày trình tự bước nhuộm Gram + Cho biết nhuộm màu vi khuẩn lại có tính chất bắt màu Gram khác nhau? + Trong trường hợp nào, nhuộm Gram cần sử dụng loại thuốc nhuộm? I Sử dụng kính hiển vi quang học (light microscope) 1.1 Cấu tạo kính hiển vi quang học 10/21/2018 a Phần học  Thân kính: dịch chuyển lên xuống nhờ núm điều chỉnh lớn để đưa ảnh vật quan sát vào tiêu điểm - Bàn xoay (mâm kính): gắn phía thân kính, nơi gắn vật kính - Ống kính: Gắn phía thân kính, xoay quanh trục thẳng đứng tùy theo vị trí quan sát Phía ống kính có gắn thị kính - Bàn kính/khay kính: nơi để tiêu quan sát Trên bàn kính có kẹp giữ tiêu Dưới bàn kính có giá giữ tụ quang kính - Đế kính (chân kính): cấu tạo vững đỡ toàn KHV - Ốc điều chỉnh: gồm + Ốc điều chỉnh tiêu bản; + Ốc điều chỉnh vĩ cấp (điều chỉnh thô/điều chỉnh lớn); + Ốc điều chỉnh vi cấp (điều chỉnh tinh/điều chỉnh nhỏ) b Phần quang học  Bộ phận chiếu sáng: Tụ quang kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại với nhau hội tụ tia sáng xuất phát từ nguồn sáng vào tiêu Có loại tụ quang kính: Tụ quang kính sáng tụ quang kính đen Vật kính  gồm hệ thống thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn khoảng vài mm, đặt vỏ bọc kim loại  Chức năng: Tạo ảnh thực ngược chiều với vật quan sát  Độ phóng đại vật nghiên cứu phụ thuộc vào tiêu cự độ cong thấu kính ngồi Độ cong lớn, tiêu cự ngắn độ phóng đại vật kính lớn  Các vật kính: 8x, 10x, 40x, 60x (vật kính khơ), 90x, 100x (vật kính dầu) d Thị kính - Gồm thấu kính: thấu kính mắt phía trên, thấu kính tụ phía Giữa hai thấu kính có chắn giữ lại tia sáng xung quanh, để tia sáng gần với trục quang qua  hình rõ nét - Vai trị: Phóng đại ảnh vật kính thu được-vai trị giống kính lúp - Các loại thị kính: 7x, 10x, 15x, 20x  Độ phóng đại mẫu quan sát tích số độ phóng đại vật kính với độ phóng đại thị kính 10/21/2018 Giới thiệu số loại kính hiển vi khác Kính HV điện tử truyền qua (TEM) Kính hiển vi điện tử - KHV điện tử truyền qua (Transmission electron microscope – TEM): sử dụng chùm điện tử có lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng sử dụng thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (1x106 lần) Ảnh tạo huỳnh quang, hay film quang học, hay ghi nhận máy chụp kỹ thuật số - KHV điện tử quét (Scanning electron microscope – SEM): loại kính hiển vi điện tử truyền qua khác với TEM: chùm điện tử không truyền qua mẫu mà hội tụ thành chùm hẹp quét mẫu, cho phép ghi ảnh với độ phân giải cao Nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, nguyên tử, virus… Scanning transmission electron microscope (STEM) KHV huỳnh quang (fluorescence microscope) SIGMA Advanced Analytical Scanning Electron Microscope SEM Kính hiển soi (stereoscopic microscope) 10/21/2018 c Quan sát với vật kính dầu (100x)  Kính hiển vi phản pha (Phase contrast microscopy-Nobel prize 1953): Ánh sáng xuyên qua vật thể suốt, không màutiêu không cần nhuộm C A B D A Nấm men quan sát vơi KHV quang học B Nấm men quan sát KHV đen C Nấm men quan sát KHV phản pha D Nấm men quan sát KHV huỳnh quang - Nếu dùng vật kính dầu ý: + Nhỏ giọt dầu soi kính vào vị trí vùng định quan sát tiêu (Hình A) + Hạ từ từ vật kính chạm nhẹ vào giọt dầu (Hình B) + Nhìn vào thị kính, nhẹ nhàng điều chỉnh ốc điều chỉnh vĩ cấp nâng vật kính lên thấy chớp ảnh vi trường  Khi nâng vật kính lên phải đảm bảo đầu vật kính ngập dầu soi (Hình C) + Điều chỉnh thêm ốc chỉnh vi cấp cho rõ nét 1.2 Cách sử dụng kính hiển vi quang học a.Chuẩn bị: - Kính hiển vi, dầu soi, dầu lau, sổ ghi chép, bút… - Chuẩn bị tiêu quan sát - Tư ngồi quan sát kính HV: ngồi ngắn, đặt sổ ghi chép bên tay phải (nếu thuận tay phải) b Quan sát với vật kính khơ: - Cắm điện bật cơng tắc đèn - Điều khiển kính tụ quang bàn tay trái: Nâng lên mức hợp lý; + Mở hệ thống chắn sáng tối đa điều chỉnh có tiêu để ảnh mẩu vật đẹp theo ý muốn - Đặt tiêu quan sát lên khay kính, điều chỉnh vị trí cần quan sát tiêu - Chọn vật kính quan sát: Ví dụ Nấm mốc 4x, 10x; Nấm men 40x - Sử dụng ốc điều chỉnh vĩ cấp để nâng tiêu lên sát với vật kính; Mắt nhìn vào thị kính, từ từ hạ vật kính xuống đến nhìn thấy chớp ảnh sử dụng ốc điều chỉnh vi cấp để chỉnh độ nét ảnh d Bảo quản sau sử dụng kính - Nâng vật kính lên lấy tiêu - Nếu vật kính dầu dùng khăn vải/giấy mềm tẩm dầu lau kính xylene lau nhẹ vào đầu vật kính cho thật - Đưa vật kính nhỏ vào vị trí tiêu - Tắt cơng tắc đèn, rút phích cắm khỏi ổ điện - Cho kính vào hộp hay đậy kính bao nilon - Chuyển kính vào tủ lớn có hệ thống đèn bật thường xuyên để chống mốc bụi bẩn 10/21/2018 Quan sát tiêu 2.1 Quan sát tiêu nấm mốc - Sử dụng vật kính 4x 10x - Quan sát vật kính 4x: cho biết đặc điểm hình thái nấm mốc, vẽ hình - Quan sát vật kính 10x: Cho biết đặc điểm bào tử nấm mốc, vẽ hình 2.2 Quan sát tiêu nấm men - Sử dụng vật kính dầu 100x: Cho biết đặc điểm hình thái hình thức sinh sản Bài 4: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Nội dung: 3.1 Chuẩn bị dụng cụ 3.2 Phương pháp làm môi trường nuôi cấy VSV Mục đích nấm men Vẽ hình Biết cách bao gói, hấp sấy dụng cụ thí nghiệm 2.3 Quan sát tiêu vi khuẩn lactic Nắm thao tác kỹ thuật pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật - Sử dụng vật kính dầu 100x: Cho biết đặc điểm hình thái tính chất xếp vi khuẩn lactic Vẽ hình Yêu cầu báo cáo thực hành Quan sát tiêu tự làm + Tiêu nấm men với vật kính 100x (vật kính dầu) + Tiêu vi khuẩn lactic với vật kính 100x (vật kính dầu) Báo cáo: - Cho biết tính chất bắt màu vi sinh vật mẫu nhuộm -Mơ tả đặc điểm hình thái vi khuẩn lactic nấm men Vẽ hình minh họa -Mơ tả tính chất xếp vi khuẩn lactic: đứng riêng rẽ, nối đôi, nối chuỗi? -Mô tả đặc điểm sinh sản nấm men: tìm tế bào nảy chồi Vẽ hình 3.1 Chuẩn bị dụng cụ, môi trường nuôi cấy vi sinh vật 3.1.1 Chuẩn bị dụng cụ Các dụng cụ thường sử dụng để làm môi trường nuôi cấy VSV - Hộp lồng (đĩa Petri), ống nghiệm, bình tam giác, pipet, cốc đong, đũa thủy tinh, ống hút Pasteur … Vệ sinh dụng cụ:  Dụng cụ thuỷ tinh chưa sử dụng: ngâm nước lã dung dịch H2SO4 lỗng/ 24 Rửa lại xà phịng nước nhiều lần dung dịch rửa có pH trung tính  Các dụng cụ qua sử dụng (VSV gây bệnh): trước rửa phải khử trùng nước cao áp giết chết VSV  đảm bảo an tồn cho người rửa, khơng cho mầm bệnh cũ nhiễm vào môi trường  Sử dụng dung dịch sunfocromat để ngâm tẩy vết bẩn dụng cụ thuỷ tinh  Dụng cụ sau rửa, cần làm khơ trước bao gói 10/21/2018 Tủ sấy Bao gói dụng cụ để khử trùng: Nồi hấp nước cao áp  Dụng cụ trước khử trùng phải rửa sạch, làm khô bao gói bảo đảm vơ trùng sau sấy Khử trùng dụng cụ  Dụng cụ thủy tinh sau bao gói khử trùng phương pháp sấy nhiệt độ 160-180oC/2h  Các dụng cụ khử trùng bảo quản tủ chuyên dụng đựng dụng cụ bảo quản túi nilon kín Chỉ bóc giấy bao gói trước sử dụng  Sau khử trùng, que gạt, que cấy nên sử dụng vòng 24 giờ, hộp petri vòng ngày, ống nghiệm, bình nón khoảng 7-10 ngày bảo quản tốt Nếu để lâu, dụng cụ phải khử trùng lại trước sử dụng  Một số dụng cụ que gạt, que cấy, ống hút Pasteur, chày cối, hộp đựng đầu pipet… khử trùng phương pháp hấp nước cao áp 121oC/1atm/30 phút Làm nút bơng cho ống nghiệm, bình tam giác Bao gói dụng cụ thí nghiệm để khử trùng 3.2 Giới thiệu môi trường nuôi cấy vsv 3.2.1 Môi trường đặc (rắn) Mơi trường có sử dụng chất làm đông đặc môi trường: 1,5-2% thạch (agar) Một số loại mơi trường chủ yếu:  Mơi trường dinh dưỡng: • Môi trường đơn giản/MT sở  peptone + agar; mơi trường nước thịt peptone • Mơi trường phức tạp: có bổ sung chất dinh dưỡng cao thịt, cao nấm men, casein… + chất khoáng chất đặc hiệu  Mơi trường chọn lọc: MT có chứa thành phần ưu tiên sinh trưởng số VSV ức chế VSV khác (ví dụ Mt chọn lọc VK sinh protease có bổ sung gelatin/casein…)  Mơi trường chẩn đốn/ phân biệt: Có thành phần hóa chất giúp phân biệt vsv mắt thường (Ví dụ: mơi trường MacConkey phân biệt E coli Salmonella) 10/21/2018 Một số loại môi trường chọn lọc 3.2.2 Môi trường dịch thể (lỏng)  Là môi trường không bổ sung thêm chất đông đặc (thạch) Mannitol salt agar MT dinh dưỡng MacConkey agar Sabouraud agar: MT chọn lọc cho nấm Casein media: chọn lọc Protease Môi trường thạch nghiêng Một số mơi trường chẩn đốn, phân biệt 43 3.3 Phương pháp làm môi trường dịch thể a Môi trường dinh dưỡng dịch thể (Nutrient broth) Sử dụng để nuôi cấy vsv dị dưỡng Chuẩn bị: - 500g thịt, loại bỏ xương, mỡ, gân, Thành phần: xay nhỏ Thêm 1000ml nước cất, để nhiệt độ Thịt bị (lợn): 500g phịng 12h Sau đem đun sôi 30 phút Đợi Peptone: 10g nguội lọc qua bông/giấy lọc NaCl: 5g - Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1lit, thêm Nước cất: 1000ml 0,5% NaCl 1% pepton Điều chỉnh pH pH: 7.5±0.2 (25 °C) - Hấp khử trùng 121o/1atm/20 phút Thạch máu: blood agar MT phân biệt Salmonella Shigella với E coli Sau hấp tiệt trùng, chia vào ơng nghiệm bình tam giác để sử dụng b Môi trường peptone dịch thể (Peptone Water) • Hịa tan Peptone 1% NaCl 0.5% với lít nước • Mơi trường sử cho MT lên men đường (bổ sung thêm 1% đường) MT kiểm tra phản ứng indole 10/21/2018 3.4 Phương pháp làm môi trường rắn Môi trường Hansen: Sử dụng để nuôi cấy nấm men Thành phần: Chuẩn bị: - Cân xác thành phần mơi trường, hịa tan với nước cất cách đun sơi - Chỉnh pH từ 5-6; Hấp tiệt trùng 121o/1atm/20 phút - MT có màu vàng nhạt - Khi sử dụng, nuôi cấy 30-35oC/24-48h Glucose: 50g Pepton: 10g K2HPO4: 3g MgSO4.7H2O: 2-5g Agar: 15-18g Nước cất: 1000ml Môi trường Sabouraud: Sử dụng để nuôi cấy nấm mốc, nấm men Thành phần: Chuẩn bị: Glucose: 40g/l - Cân xác thành phần môi trường, đun cho tan thành phần Chỉnh pH từ 5,6±0,2 25oC; Peptone: 10g/l Hấp tiệt trùng 121o/1atm/15 phút Thạch: 15g/l - MT có màu kem vàng nhạt a Môi trường thạch nghiêng (thạch ống) Bước 1: Đổ ống nghiệm - MT thạch Hansen sau chuẩn bị xong, tiến hành đổ ống nghiệm - Lượng MT từ 8-10ml/ống tùy vào đường kính ống - Đậy nút bơng, bao gói, ghi tên mơi trường thời gian làm bên Bước 2: Hấp tiệt trùng - Cho môi trường vào nồi hấp, hấp 121oC/1atm/15-20 phút Bước 3: Nghiêng môi trường - Lấy mơi trường từ nồi hấp ra, bỏ bao gói nghiêng mặt bàn đến thạch đơng hồn tồn Để MT vào tủ ấm 37oC/24h để kiểm tra tạp nhiễm b Môi trường thạch đĩa Bước 1: Hấp tiệt trùng - MT thạch Hansen sau chuẩn bị xong, tiến hành đổ vào bình tam giác loại 100ml - Lượng MT từ 50-80ml/bình, khơng đổ đầy bình để tránh trào ngồi hấp - Đậy nút bơng, bao gói, ghi tên mơi trường thời gian làm bên ngồi - Cho mơi trường vào nồi hấp, hấp 121oC/1atm/15-20 phút Bước 2: Đổ môi trường đĩa - Lấy bình mơi trường từ nồi hấp ra, để nguội đến 45-50oC tiến hành đổ vào đĩa - Mỗi đĩa đổ từ 15-20ml tùy theo đường kính đĩa Tuy nhiên cần phải đảm bảo môi trường phủ kín đĩa - Lưu ý: +Q trình đổ đĩa phải tiến hành buồng cấy khử trùng + Thao tác nhanh đảm bảo vô trùng - Các đĩa môi trường sau đổ xong thạch đơng hồn tồn, sau bao gói để vào tủ ấm 37oC/24h để kiểm tra tạp nhiễm 10/21/2018 Yêu cầu báo cáo thực hành Thực hành phương pháp làm nút bơng, bao gói, sấy dụng cụ thí nghiệm Thực hành làm mơi trường Hansen dịch thể Hansen rắn - MT thạch nghiêng - MT thạch đĩa Đánh giá chất lượng môi trường: - Màu sắc, trạng thái - Độ tạp nhiễm I Kỹ thuật ria cấy 1.1 Kỹ thuật ria cấy thạch ống (Agar slant culture) Mục đích: sử dụng kỹ thuật cấy truyền giống, nhân giống, giữ giống, phân lập/chọn lọc giống a Chuẩn bị - Môi trường thạch nghiêng Hansen - Dụng cụ: que cấy, đèn cồn, bút viết kính… - Ống giống: Nấm men Saccharomyces sp - Tiệt trùng buồng cấy, tay, dụng cụ trước tiến hành - Ghi tên giống, thời gian nuôi cấy lên ống môi trường Bài 5: Kỹ thuật ria cấy vi sinh vật Nội dung: Kỹ thuật ria cấy thạch đĩa thạch ống Quan sát hình thái khuẩn lạc Đánh giá sinh trưởng vi sinh vật mơi trường dịch thể Mục đích: - Nắm thực tốt kỹ thuật ria cấy sử dụng nuôi cấy vi sinh vật - Nắm tiêu chí đánh giá sinh trưởng vi sinh vật môi trường dịch thể môi trường rắn b Các bước tiến hành: Bước 1: Lấy giống cần cấy + Đốt đèn cồn  tiệt trùng que cấy cách hơ que cấy thẳng đứng lửa đèn cồn đến đầu que cấy nóng đỏ  để nguội + Lấy ống giống cần cấy: sử dụng ngón tay út + má lịng bàn tay lấy nút bông, tiệt trùng miệng ống  Lấy lượng giống cần cấy  tiệt trùng miệng ống, đậy nút Bước 2: Cấy truyền sang môi trường mới: + Đưa que cấy lấy giống xuống đáy ống môi trường Ria que cấy từ trái sang phải theo đường zich zắc chữ chi phía miệng ống + Tiệt trùng miệng ống  đậy nút đem nuôi cấy Lưu ý: + Tiến hành ria cấy giống buồng cấy/phịng vơ trùng + Mọi thao tác kỹ thuật cần tiến hành xung quanh lửa đèn cồn 10/21/2018 Các bước ria cấy thạch ống Ria zic zắc Ria Xoắn ốc Các bước kỹ thuật ria thạch đĩa (ria lần đốt que cấy) Ria ngang 1.2 Kỹ thuật ria cấy thạch đĩa (Streaking culture plates) Mục đích: sử dụng kỹ thuật nghiên cứu phân lập, chọn lọc giống nhằm tách khuẩn lạc a Chuẩn bị Các bước chuẩn bị phương pháp ria ống Chỉ khác phần kỹ thuật ria b Kỹ thuật ria 2-3 lần đốt que cấy: Ria kỹ thuật Bước 1: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy giống cần cấy - Vơ trùng miệng đĩa, mở nắp hộp lồng, đưa que cấy lấy giống vào, ria 1/3 đĩa  dừng lại, đốt que cấy lần Bước 2: Đợi que cấy nguội; Xoay đĩa sang trái1 góc 45o; Đặt que cấy vào đường ria cuối lần ria thứ ria ngang tiếp 1/3 đĩa  đốt que cấy lần Bước 3: Làm tiếp tục bước 2, ria nốt 1/3 đĩa cịn lại  vơ trùng miệng đĩa, nuôi cấy tủ ấm trạng thái úp ngược Ria bị tạp Ria không kỹ thuật 10/21/2018 II Đánh giá sinh trưởng VSV 2.1 Trên môi trường rắn Một số dạng khuẩn lạc vsv  VSV sinh trưởng mơi trường đặc (rắn) hình thành khuẩn lạc  Khuẩn lạc tập trung số lượng lớn tế bào nơi, hình thành từ tế bào ban đầu  Sự sinh trưởng đánh giá thông qua tiêu chí: - Số lượng khuẩn lạc (đếm phương pháp pha lỗng nồng độ) - Hình thái, kích thước khuẩn lạc - Rìa, bề mặt, trạng thái, kết cấu khuân lạc - Màu sắc khuẩn lạc; - Mùi môi trường  Hai dạng khuẩn lạc thường gặp: - Khuẩn lạc láng bóng (dạng S): thường có bề mặt cong lồi, rìa gọn mịn, mặt láng bóng, nhẵn - Khuẩn lạc nhám (dạng R): bề mặt nhám xù xì, rìa nhọn hay có góc cạnh Mơ tả đặc điểm khuẩn lạc Bề mặt khuẩn lạc trực khuẩn Bacillus khuẩn lạc Staphylococcus khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae Rìa/ bờ viền TS Nguyễn Thị Tuyết Lê khuẩn lạc nấm mốc khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus khuẩn lạc nấm men 10/21/2018 2.2 Đánh giá sinh trưởng VSV môi trường dịch thể (lỏng) Đánh giá sinh trưởng qua tiêu chí:  Đếm số lượng tế bào qua phương pháp so màu pha loãng nồng độ  Độ đục môi trường (so màu): đục hay dạng bông, dạng vẩn mây  Sự lắng hay kết tủa: dày hay mỏng, xốp hay kết chặt, dạng hạt hay keo  Hình thành màng: màng trịn hay màng kín, bề mặt màng thơ hay mịn, dày hay mỏng  Sự đổi màu môi trường  Sinh khí; Mùi Bài ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT MỤC ĐÍCH Nắm vận dụng tốt phương pháp xác định số lượng TB vi sinh vật qua phương pháp đếm trực tiếp kính hiển vi buồng đếm hồng cầu đếm gián tiếp phương pháp pha loãng nồng độ NỘI DUNG Tạo màng - Thực hành phương pháp đếm số lượng nấm men buồng đếm hồng cầu Neubauer - Đếm số lượng TB phương pháp pha loãng nồng độ Đục, đổi màu Sinh khí (CO2) Yêu cầu báo cáo Thực hành phương pháp ria cấy thạch đĩa thạch nghiêng Đánh giá sinh trưởng nấm men môi trường Hansen dịch thể Quan sát mô tả đặc điểm khuẩn lạc đĩa ni cấy: - Hình thái khuẩn lạc - Màu sắc, mùi - Trạng thái - Rìa - Bề mặt - Kích thước: sử dụng thước đo (đơn vị tính mm) I Phương pháp đếm trực tiếp kính hiển vi  Là phương pháp đếm trực tiếp kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer Ứng dụng cho vi sinh vật có kích thước lớn nấm men, vi tảo, vi khuẩn lam Còn gọi phương pháp đếm nhanh  Ưu điểm: Cho phép xác đinh nhanh chóng số lượng tế bào có mẫu  Nhược điểm: không phân biệt tế bào sống chết; độ xác khơng cao với mật độ 6 tùy thuộc vào mẫu cần đếm Cho vào tất ống 9ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% vô trùng Hút 1ml dung dịch mẫu cho vào ống thứ nhất, trộn tiếp tục hút 1ml cho sang ống thứ Làm đến hết Nồng độ pha loãng mẫu 10-1, 10-2, 10-3 … 10-6 Yêu cầu báo cáo Thực hành phương pháp đếm số lượng TB nấm men buồng đếm hồng cầu Neubauer - Tính số lượng tế bào nấm men có 1ml dung dịch ni cấy - Tính số lượng tế bào nảy chồi/tổng số tế bào nấm men Đếm số lượng khuẩn lạc đĩa thạch tính số lượng TB vi sinh vật có 1g mẫu ban đầu trước nuôi cấy Biết rằng: - Nồng độ pha lỗng ni cấy 10-4, 10-5, 10-6 - Lượng mẫu cấy vào đĩa 0,1ml Cấy mẫu: Cấy mẫu nồng độ pha loãng cuối Mỗi nồng độ cấy đĩa thạch, đĩa 0,1ml dung dịch pha lỗng Ni cấy đĩa thạch tủ ấm từ 24-48 giờ, sau đếm số lượng khuẩn lạc đĩa có số lượng khuẩn lạc dao động từ 30-200 Các đĩa có số lượng >200 dễ dẫn đến sai sót đếm Các đĩa có số lượng khuẩn lạc