Bài giảng thí nghiệm vi sinh vật học (nguyễn thanh hòa)

15/11/2021 AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM Thí nghiệm vi sinh vật trải nghiệm lý thú vui vẻ, nhiên bạn cần phải ý nguy tiềm ẩn Một số nội quy phịng thí nghiệm bạn phải ý sau: ¢ ¢ ¢ THÍ NGHIỆM ¢ VI SINH VẬT HỌC GV: Nguyễn Thanh Hồ ¢ ¢ ¢ Giữ gìn trật tự, vệ sinh phịng Bảo đảm vơ trùng tuyệt đối cấy truyền vi sinh vật Tuyệt đối khơng ăn uống, hút thuốc phịng thí nghiệm Tuyệt đối khơng để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dây quần áo, sách vở, dụng cụ cá nhân Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm chưa phép chưa hướng dẫn Kết thúc thí nghiệm thực hành, dụng cụ, thiết bị, hoá chất vừa sử dụng xong phải vệ sinh theo quy trình xếp vào nơi quy định Ghi nhật ký sử dụng thiết bị đầy đủ theo u cầu Khi rời phịng thí nghiệm phải kiểm tra điện, nước, khoá cửa NHỮNG QUY ĐỊNH VỀ AN TỒN ¢ ¢ ¢ ¢ ¢ ¢ ¢ ¢ BÀI 1: Khi sử dụng hoá chất cần đọc kỹ hướng dẫn sử dụng tuân theo hướng dẫn kỹ thuật viên, cán phòng thí nghiệm Sinh viên sử dụng áo blouse thực thí nghiệm MƠI TRƯỜNG DINH DƯỠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT Những hoá chất độc hại phải xử lý riêng, tuân theo yêu cầu quản lý PTN Chất thải sinh học (vi sinh vật) phải xử lý nhiệt (thanh trùng 121oC 30 phút) trước thải ngồi mơi trường Chất thải lỏng cần phân loại (axit, bazơ, dung môi, dung dịch có kim loại nặng) chứa vào thùng đựng chất thải riêng biệt Chất thải rắn (hoá chất, lọ đựng hố chất) có tính chất độc hại phải để tủ hút xử lý theo lịch riêng nhà trường Các dung môi độc hại, dễ bay phải tiến hành tủ hút Trước rời phịng thí nghiệm phải rửa tay 15/11/2021 I KHÁI NIỆM CHUNG Mục đích, ý nghĩa: — Có ý nghĩa bảo tồn phát triển nòi giống vi sinh vật — Được sử dụng khâu phân lập, nhân giống, giữ giống nghiên cứu A MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG hoạt động sinh hóa vi sinh vật Yêu cầu môi trường dinh dưỡng: — Thành phần phải có : - Các nguyên tố tạo chất sống (Cacbon, Hydro, Oxi, Nitơ), - Các nguyên tố đa lượng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt, ), vài nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor, Molipden, ) - Các yếu tố sinh trưởng: — Phải cân đối thành phần để đảm bảo yêu cầu hóa lý độ ẩm, độ nhớt, áp suất thẩm thấu, pH thích hợp — Phải đảm bảo tuyệt đối vơ trùng II PHÂN LOẠI MƠI TRƯỜNG Môi trường tự nhiên Môi trường tổng hợp Môi trường bán tổng hợp Pha chế : — — — Theo mục đích sử dụng — — — III CÁCH LÀM MÔI TRƯỜNG Theo thành phần — — — — Môi trường phổ dụng Môi trường riêng biệt Mơi trường chuẩn đốn phân biệt Cân đong, pha chế xác theo đơn Thử pH mơi trường Đóng miệng bình nút bơng bọc giấy để tránh bị ướt lúc trùng Dán nhãn, ghi tên lên môi trường, pH, ngày người chuẩn bị Lọc : tách cặn bã, bụi bẩn phương pháp Theo tính chất lý học ¢ Mơi trường lỏng Mơi trường đặc Mơi trường xốp ¢ — — — Cách gọi tên : theo tên tác giả theo nguồn thức ăn N C ¢ Lọc qua bơng, vải màu, giấy lọc Lọc lòng trắng trứng Dùng phễu lọc nóng 15/11/2021 III CÁCH III CÁCH LÀM MÔI TRƯỜNG LÀM MÔI TRƯỜNG Khử trùng môi trường : tất môi trường phải vô trùng, tùy loại mơi trường, tùy u cầu thí nghiệm mà chọn chế độ trùng — Phương pháp Pasteur : đun nóng phân đoạn nhiệt độ 60-75oC 15 đến 30 phút hay 80oC thời gian 10-15 phút — Phương pháp Tinđan : trùng nhiệt độ cao liên tục 3-4 ngày liền, ngày lần, lần cách 24 — Phương pháp trùng nước bão hòa áp suất Phân phối mơi trường ¢ ¢ ¢ ¢ Mơi trường phân phối vào bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm, sau trùng vào ống nghiệm hộp petri Thạch nghiêng khoảng 5ml Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm Hộp petri tráng dầy 3mm Bảo quản kiểm tra môi trường 10 B 11 CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT 12 15/11/2021 CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY ĐỊNH ¢ ¢ NGHĨA a Gieo cấy trình đưa vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mục đích phát loại vi sinh vật có mặt thu nhận canh trường cần thiết cho nghiên cứu Cấy chuyền trình chuyển canh trường vi sinh vật từ môi trường sang mơi trường khác với mục đích nhận giống giữ giống Cấy chuyền từ ống nghiệm sang ống nghiệm khác: tiến hành từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng) Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối Các dụng cụ cần thiết: que cấy nhọn vòng, pipet, que trang, 13 14 CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY b — — — — c d CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY Gieo cấy mặt thạch nghiêng Theo hình chữ chi Theo hình vịng xoắn Theo đường song song Theo đường thẳng Dùng que cấy đâm sâu thạch đứng Cấy thạch hộp — — — — Hình chữ chi toàn mặt thạch Theo bốn đường zich-zac bốn góc hộp Theo đường song song Chấm điểm Phương pháp cấy hộp thạch 15 16 15/11/2021 CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY e Dùng pipet Pasteur hay pipet chia độ — — Dùng pipet lấy lượng canh trường thả mặt thạch dung que trang dàn giọt canh trường mặt thạch Cấy bề sau ü ü Giống – ống nghiệm – hộp thạch Giống – hộp thạch – ống nghiệm môi trường Phương pháp cấy thạch hộp 17 18 CÁC DỤNG CỤ TRONG THÍ NGHIỆM CÁC DỤNG CỤ TRONG THÍ NGHIỆM Hộp petri (wikipedia.org) Que cấy Pipet (raylab.co.nz) Cốc đong (clarelibrary.ie) 19 Chổi rửa Giá đựng ống nghiệm Cốc đong, ống nghiệm Đèn cồn 20 15/11/2021 CÁC THIẾT BỊ TRONG THÍ NGHIỆM BÀI : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT 21 22 I CANH TRƯỜNG TẬP TRUNG ¢ Canh trường tập trung : canh trường lồi (có vài lồi) vi sinh vật xác định chiếm tỷ lệ cao hẳn số lượng A PHÂN LẬP VI SINH VẬT 23 ¢ Sử dụng mơi trường chọn lọc điều kiện chọn lọc để phân lập canh trường tập trung (môi trường điều kiện thích hợp cho lồi vi sinh vật định, cịn lồi khác khơng thể khó phát triển) 24 15/11/2021 A PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG MÔI TRƯỜNG LỎNG II CANH TRƯỜNG THUẦN KHIẾT Cách thực : ¢ Canh trường khiết : canh trường mà tất vi sinh vật sinh từ tế bào ban đầu ¢ Việc phân lập canh trường khiết thường thực từ canh trường tập trung ¢ Các phương pháp phân lập canh trường khiết : 1.Lấy số ống nghiệm chứa môi trường lỏng vô khuẩn 2.Dùng que cấy pipette cấy vật phẩm nghiên cứu vào ống nghiệm thứ 3.Đánh tan lắc cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai v Phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng 4.Lặp lại với ống nghiệm thứ hai, ba, bốn v Phương pháp gieo cấy môi trường đặc v Phương pháp tách tế bào 5.Cuối ta thu ống nghiệm chứa tế bào Tế bào tổ tiên cho canh trường khiết Ví dụ : Pha lỗng Pasteur 25 B 26 PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VSV ¢ Nguyên tắc : tách khuẩn lạc mọc riêng lẻ môi trường đặc ¢ Cách tiến hành : ¢ 27 Phương pháp tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính cao — Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính protease cao — Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính amylase cao — Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính cellulase cao Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hoà tan pha loãng ống nghiệm chứa nước cất nước muối sinh lý (0.85%) vô trùng Đem vật phẩm pha lỗng cấy mơi trường thạch hộp vơ khuẩn Ni điều kiện thích hợp Sau - ngày, quan sát chọn khuẩn lạc đứng riêng biệt, dùng que cấy lấy vi sinh vật khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền lên ống thạch Ni nhiệt độ thích hợp ta canh trường khiết — Tuyển chọn chủng VSV có khả chịu mặn — Nghiên cứu khả đối kháng chủng VSV 28 15/11/2021 ¢ ¢ C PHƯƠNG PHÁP TÁCH TỪNG TẾ BÀO Thường dùng để tách vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương đối lớn (nấm men, bào tử nấm mốc) Cách tiến hành : có cách Tách giọt chứa tế bào có kiểm tra kính hiển vi Tách tế bào nhờ dụng cụ vi thao tác (micromanipulateur) TÁCH TỪNG GIỌT CHỈ CHỨA MỘT TẾ BÀO CÓ KIỂM TRA BẰNG KÍNH HIỂN VI Pha lỗng Pasteur ( đến mức giọt nhỏ có hai tế bào vi sinh vật) Dùng que cấy nhọn chấm giọt nhỏ canh trường pha loãng lên kính vơ khuẩn Chấm thành ba bốn hàng giọt cách xa vừa phải để dễ quan sát Nhanh chóng xoay kính cho giọt xuống đặt lên phiến kính lõm, bơi vazơlin quanh mép kính, giữ khơng cho giọt bị khơ Quan sát kính hiển vi đánh dấu giọt có tế bào Đặt phiến kính vào hộp petri có lót bơng giấy lọc tẩm nước, đem ni nhiệt độ thích hợp Micromanipulateur (www.lavallab.com) 29 30 III PHÂN LẬP VI SINH VẬT YẾM KHÍ DÙNG HỘP PETRI LỘN NGƯỢC III Phân lập vi sinh vật yếm khí Dùng pipet Pasteur Pha loãng cho vào ống thạch Pha loãng vật phẩm nghiên cứu, lấy giọt cho vào ống thạch, lắc Hút mơi trường trộn vi sinh vật nói vào pipet Pasteur dùng đèn cồn hàn kín đầu nhỏ pipet Nuôi tủ ấm – ngày Lấy pipet ra, đánh vỡ lấy cục thạch có khuẩn lạc riêng biệt cho vào mơi trường ni cấy thích hợp 31 Lắc đổ hộp petri đậy ngược đáy nhỏ hộp lên lớp thạch, sau dùng paraphin bơi xung quanh mép hộp (Hộp petri vô trùng đặt lộn ngược trước) Đặt vào tủ ấm, sau - ngày lấy tách thạch có khuẩn lạc đem cấy vào mơi trường thích hợp 32 15/11/2021 I ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIẾP ¢ ¢ ¢ B ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT ¢ 33 34 P HƯƠNG PHÁP DÙNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU PHƯƠNG PHÁP DÙNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU ¢ Định nghĩa: phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có tiêu làm từ vật phẩm nghiên cứu Ưu điểm: Cho kết nhanh chóng Nhược điểm: Kém xác đếm ta đếm tế bào chết trước lúc làm tiêu Các phương pháp định lượng trực tiếp : Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu Phương pháp Brit Phương pháp Vinogratxki - Sungina Phạm vi sử dụng: thường dùng để đếm vi sinh vật mà tế bào có kích thước lớn nấm men, bào tử nấm mốc ¢ ¢ ¢ ¢ Buồng đếm hồng cầu (Hemocytometer) (wikipedia.org) Lắc canh trường, dùng pipet chia độ pha lỗng canh trường Dùng bơng tẩm nước cất phết nhẹ lên hai khoang bên buồng đếm, đặt kính lên dùng ngón tay ấn nhẹ cho kính dính chặt vào phiến kính Dùng pipet lấy canh trường pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng trống lưới đếm kính (nên bỏ vài giọt đầu) Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên - phút tiến hành đếm ô lớn chéo tức 80 vng nhỏ Hoặc đếm vuông lớn tức 100 ô vuông nhỏ (chú ý chọn vị trí khác nhau) Tính số tế bào trung bình a.1000.f h.S a số tế bào trung bình có f hệ số pha loãng canh trường h bề sâu lưới đếm S diện tích ô 1000 hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm đó: Ơ màu Đỏ Xanh lục Vàng Da trời 35 Kích cỡ x mm 0.25 x 0.25 mm 0.20 x 0.20 mm 0.05 x 0.05 mm Diện tích mm2 0.0625 mm2 0.04 mm2 0.0025 mm2 36 15/11/2021 PHƯƠNG PHÁP VINOGRATXKI - SUNGINA PHƯƠNG PHÁP BRIT ¢ Phạm vi sử dụng : dùng để định lượng vi sinh vật có sữa hay số vật phẩm lỏng ¢ Cách 1) 2) 3) 4) tiến hành: Đo đường kính kính trường hệ thống kính định dùng quan sát Dùng micropipet vơ trùng lấy xác 0,01 ml vật phẩm nghiên cứu Cho dàn lên phiến kính với diện tích định (2 - cm2) Để khô, cố định nhuộm đơn xanh metylen Để khô quan sát kính hiển vi đếm 37 ¢ ¢ Phạm vi sử dụng: dùng để định lượng vi sinh vật đất hay vật phẩm đặc, rắn Cách tiến hành: 1) Cân lượng định (1g hay 5g) vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ cối thủy tinh chuyển tất vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch Lắc phút để yên - giây 2) Dùng micropipet vơ trùng lấy xác 0,01 ml hỗn dịch chuẩn bị dàn diện tích định phiến kính (4 - cm 2) 3) Để khô đổ lên vết bôi lớp thạch mỏng, lỗng (0,1%) Lại để khơ cố định cồn tuyệt đối phút 4) Nhuộm dung dịch eritrozinphenol từ 0,5 - Trong trình nhuộm phải theo dõi để thuốc nhuộm vết bôi không bị khô 5) Rửa sạch, để khô đem quan sát vật kính dầu Cách đếm tính kết gần giống phương pháp Brit 38 II ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ KHUẨN LẠC PHÁT TRIỂN TRÊN MƠI TRƯỜNG THẠCH ¢ Định nghĩa: phương pháp định lượng vi sinh vật cách gieo cấy lượng ¢ định vật phẩm nghiên cứu lên mơi trường thức ăn thích hợp, ni 36 - 48 giờ, sau đếm số khuẩn lạc suy số tế bào có đơn vị vật phẩm ban đầu ¢ ¢ Ưu điểm: Chỉ đếm tế bào vi sinh vật sống nên kết xác Nhược điểm: — Tốn thời gian, công sức — Khi cấy từ vật phẩm pha lỗng chênh 10 lần khơng thấy số khuẩn lạc chênh 10 lần — Đối với vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với thành chuỗi, đôi, khối phát triển mơi trường, chuỗi, khối tạo thành khuẩn lạc Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh xác số tế bào vi sinh vật có vật phẩm nghiên cứu — 39 Nguyên tắc: Gieo cấy lượng vật phẩm định lên môi trường đặc hộp petri, ni nhiệt độ thích hợp Sau đếm số khuẩn lạc mọc lên suy kết ¢ Cách tiến hành: 1) 2) 3) 4) Khơng có loại môi trường dinh dưỡng cho phép tất nhóm vi sinh vật phát triển 5) Đối với vật phẩm nghiên cứu lỏng : pha loãng Pasteur ( tỷ lệ 1:10) Đối với vật phẩm nghiên cứu đặc rắn trước tiên cần chuyển thành dạng lỏng cách: Cân g vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ chuyển tất vào bình tam giác dung tích 250 ml chứa sẵn 99 ml nước vô trùng Lắc phút, để lắng 30 giây tiếp tục pha loãng Gieo cấy lượng vật phẩm nghiên cứu định (0,1 ml) từ ống nghiệm pha loãng cuối lên hộp petri chứa sẵn môi trường vô trùng Nuôi nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc Đọc kết 40 10 15/11/2021 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TRONG KHƠNG KHÍ ¢ ¢ Ngun tắc: Theo Omelianxki ước tính: diện tích rộng 100 cm2, mở phút lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương với lượng vi sinh vật có 10 lít khơng khí Cách tiến hành: B ÀI : KÍNH HIỂN VI CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT SỐNG QUAN SÁT NẤM MEN 1) Đặt hộp petri có mơi trường đặc vơ trùng chỗ khơng khí định nghiên cứu 2) Mở nắp hộp thời gian xác đinh (thường phút) đậy nắp hộp để vào tủ ấm 3) Sau 24 – 48 đem ra, đếm số khuẩn lạc ¢ Tính tốn: đo đường kính hộp petri để tính điện tích suy lượng vi sinh vật lít hay m3 khơng khí theo ước tính Omelianxki 41 42 Cấu tạo kính hiển vi Cách sử dụng : Dùng kính tụ quang điều chỉnh ánh sáng Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng cách vật kính khay kính Xoay vật kính định sử dụng vào trục Đặt tiêu lên khay kính mắt nhìn bên ngồi, điều chỉnh tiêu để chọn vùng định quan sát Nếu dùng vật kính dầu nhỏ giọt dầu lên tiêu Từ từ đưa vật kính lại gần sát tiêu Không làm nhanh quá, tránh vỡ tiêu vật kính Nhìn qua thị kính, dùng ốc di chuyển nhanh từ từ đưa vật kính đến khoảng làm việc tương ứng, thấy ảnh vật dừng lại dùng ốc di chuyển chậm điều chỉnh cho ảnh rõ nét A KÍNH HIỂN VI 43 44 11 15/11/2021 CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI Bảo quản sau sử dụng kính ¢ ¢ ¢ ¢ ¢ Nâng vật kính lên, lấy tiêu ra, đưa khay kính vị trí cũ Nếu dùng vật kính dầu dùng bơng tẩm dung mơi hữu xilen hay toluen lau nhẹ đầu vật kính cho thật Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu B CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT SỐNG Xoay điểm hai vật kính gần vào trục Xếp khăn lại, đặt lên khay kính hạ vật kính chạm sát khăn Cho kính vào hộp phủ kính bao nilon Chuyển kính vào tủ lớn có hệ thống đèn bật thường xuyên để chống mốc bụi bẩn Bảo quản thông thường định kỳ ¢ ¢ ¢ ¢ ¢ Giữ kính nơi khơ Trong thời gian khơng dùng tháo thị kính đậy nắp ống kính Làm kính thị kính khăn mềm, chổi lông Hàng năm cần định kỳ mời thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính Chỉ di chuyển kính thật cần thiết thao tác di chuyển phải thận trọng: tay cầm thân kính, tay đỡ đế kính 45 46 I TIÊU BẢN GIỌT ÉP Phạm vi sử dụng : cho phép quan sát hình dạng, xác định kích thước tế bào vi sinh vật Hình 1: Cách lấy giống vi sinh vật Cách làm : 47 48 12 15/11/2021 II TIÊU BẢN GIỌT TREO III TIÊU BẢN VẾT Phạm vi sử dụng : dùng để nghiên cứu phân bố tự nhiên tế bào khuẩn lạc vi sinh vật phổ biến để nghiên cứu hình thái chuỗi bào tử cách xếp cuống sinh bào tử xạ khuẩn, nấm mốc Cách làm : ¢ ¢ ¢ Dùng dao mổ cắt lấy khối nhỏ môi trường thạch có cấy vi sinh vật mọc dày đặc hay mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ, đặt lên phiến kính cho phía có vi sinh vật nằm bên Lấy kính mỏng dặt lên, dùng que cấy vòng hay kẹp sắt (pince) ép nhẹ kính xuống rút que cấy hay kẹp sắt giữ vị trí kính Đặt tiêu nhận lên phiến kính có nhỏ sẵn giọt nước hay giọt dung dịch xanh metylen pha loãng 1/40, cho phần vết nằm phía dưới, ta thu tiêu "vết" Cũng dùng phiến kính ép nhẹ lên bề mặt khuẩn lạc hay bề mặt đám vi sinh vật lấy làm tiêu "vết" Phạm vi sử dụng: dùng để theo dõi sinh sản, hình thành bào tử, khả di động phản ứng tế bào vi sinh vật với chất kích thích hóa học 49 50 IV NHUỘM MÀU VI SINH VẬT SỐNG Nguyên tắc : sử dụng thuốc nhuộm khơng độc độc với vi sinh vật pha loãng nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật sống hoạt động sau nhuộm màu Các loại thuốc nhuộm : xanh metylen hay fuchsin (1/1000), đỏ công C QUAN SÁT NẤM MEN gơ 3%, đỏ trung tính từ 0,001 đến 0,00001% Cách làm: có hai cách ¢ Cách 1 Nhỏ giọt thuốc nhuộm (không lớn) lên phiến kính Lấy giọt canh trường vi sinh vật, hòa với thuốc nhuộm Đậy kính lên đem quan sát ¢ Cách Nhỏ giọt thuốc nhuộm lên phiến kính Dùng que cấy dàn thành vùng nhỏ để khô tự nhiên Nhỏ giọt canh trường vi sinh vật lên vùng màu khô Đặt tiêu lên khay kính quan sát 51 52 13 15/11/2021 Đặc điểm hình thái Đ ẶC ĐIỂM HÌNH THÁI Nấm men có dạng : — Hình cầu (Torulopsis utilis) ¢ — — — — — — — (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus) Hình trụ (Pichia), Hình dưa chuột (Saccharomyces pasteurianus) Hình chanh yên (Kloekera) Hình bình (Pityrosporum) Hình đầu nhọn(Brettanomyces) Hình tam giác (Trigonopsis) Một số hình dạng đặc biệt khác Hình thái nấm men thay đổi trình phát triển : — Nấm men trẻ (qua 12 - 16 nuôi cấy) màng mỏng, căng, nguyên sinh chất — Hình trứng hay hình bầu dục đồng nhất, khơng bào chưa có bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao — Nấm men trưởng thành (24 -48 ni cấy) kích thước vng, khơng bào lớn, số khơng bào đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm 10 -15% — Nấm men già (nuôi cấy từ 72 trở lên) màng dầy, nhăn, nguyên sinh chất không đồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế bào không sinh sản nữa, khơng có glycogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ lớn Torulopsis utilis (ageless.co.za) Pityrosporum ovale (med.sc.edu) ¢ Saccharomyces cerevisiae (chemistrydaily.com) Trong số điều kiện môi trường mà số nấm men có tế bào hình dài xếp nối thành đạng sợi gọi khuẩn ty (mycelium) khuẩn ty giả (pseudomycelium) Pichia farinosa (anathenature.com) 53 54 ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP 1)Dinh dưỡng: dị dưỡng cacbon, sống hoại sinh ký sinh 2)Hô hấp: nấm men hô hấp tuỳ tiện 3)Sinh sản: sinh sản theo lối nảy chồi hay tạo bào tử vơ tính sinh sản hữu tính ¢ nhờ kết hợp bào tử trái dấu ¢ 4)Khả tạo bào tử: ¢ Chỉ số nấm men điều kiện nuôi cấy định có khả hình thành bào tử — Nang bào tử hình thành canh trường nghèo chất dinh dưỡng, nguồn cacbon — — ¢ Nang bào tử thường chứa 1- bào tử Một số loại có tới bào tử Đóng vai trị quan trọng q trình chuyển hóa vật chất tự nhiên, vơ hóa chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường sinh thái Sản xuất dung môi hữu ( sử dụng nấm men để nấu rượu, nấu bia, sản xuất cồn, glyxerin ) Sản xuất chất có hoạt tính sinh học cao enzim, protein, vitamin, axit amin … Nấm men làm nở bột mỳ, gây hương nước chấm, sản xuất số dược phẩm gần nghiên cứu sử dụng để sản xuất lipit 5)Khả chuyển động: Nấm men không chuyển động 55 56 14 15/11/2021 II.C ÁC CHỈ TIÊU ĐỂ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CANH TRƯỜNG NẤM MEN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ¢ ĐỘ THUẦN KHIẾT Người ta dựa tiêu để đánh giá chất lượng canh trường nấm men : Độ khiết Tỷ lệ tế bào sống tổng số tế bào Tỷ lệ tế bào nảy chồi tổng số tế bào Số lượng tế bào ml canh trường Chỉ tiêu công nghệ 57 Làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi Nếu thấy tất tế bào canh trường có đặc tính hình thái sơ kết luận độ canh trường ¢ Nếu khơng, đếm số tế bào lạ năm đến bảy kính trường, lấy trung bình suy độ khiết canh trường ¢ ¢ 58 TỶ LỆ TẾ BÀO SỐNG TRÊN TỔNG SỐ TẾ BÀO TỶ LỆ TẾ BÀO NẢY CHỒI TRÊN TỔNG SỐ TẾ BÀO Nguyên tắc: ¢ Thuốc nhuộm qua màng tế bào chết dễ dàng qua màng tế bào sống ¢ Nguyên sinh chất tế bào chết dễ bắt màu Cách tiến hành: Cho giọt canh trường nấm men giọt NaOH H 2SO 10% lên phiến kính trộn Đậy kính lại, đặt lên khay kính quan sát Đếm số tế bào chung số tế bào nảy chồi suy phần trăm ¢ Tế bào xem nảy chồi tế bào có tế bào bé 1/2 tế bào mẹ ¢ Cách tiến hành: Cho vài giọt canh trường nấm men giọt thuốc nhuộm (đã pha lỗng 10 lần) lên phiến kính, nhẹ nhàng trộn đều, đậy kính lại, để yên - phút đem quan sát Tế bào chết bắt màu xanh cịn tế bào sống khơng màu ¢ Yêu cầu : canh trường nấm men giống đem lên men, lượng tế bào nảy chồi phải chiếm từ 10 đến 15% Nếu canh trường giai đoạn sinh trưởng mạnh, số tế bào nảy chồi đạt tới 70 - 80% Yêu cầu : nấm men giai đoạn sinh trưởng lượng tế bào chết không - 4% 59 60 15 15/11/2021 SỐ LƯỢNG TẾ BÀO TRONG ML CANH TRƯỜNG l l l l CHỈ TIÊU CÔNG NGHỆ Lắc canh trường, dùng pipet chia độ pha lỗng canh trường Dùng bơng tẩm nước cất phết nhẹ lên hai khoang bên buồng đếm hồng cầu, đặt kính lên dùng ngón tay ấn nhẹ cho kính dính chặt vào phiến kính Dùng pipet lấy canh trường pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng trống lưới đếm kính (nên bỏ vài giọt đầu) Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên - phút tiến hành đếm ô lớn chéo tức 80 vng nhỏ Hoặc đếm ô vuông lớn tức 100 ô vng nhỏ (chú ý chọn vị trí khác nhau) Tính số tế bào trung bình ô Chỉ tiêu thường đánh giá thông qua khả nấm men chuyển hóa nguyên liệu đầu vào hay tạo thành sản phẩm sau thời gian định Việc xác định lượng sản phẩm tạo thành giúp đánh giá xác dễ thực a.1000.f h.S đó: a số tế bào trung bình có f hệ số pha loãng canh trường h bề sâu lưới đếm S diện tích 1000 hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm 61 62 LÀM VẾT BÔI VÀ CỐ ĐỊNH VẾT BÔI B ÀI : LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH QUAN SÁT VI KHUẨN Escherichia coli 63 Staphylococcus epidermidis 64 16 15/11/2021 N HUỘM MÀU PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Nguyên tắc : Người ta cho nguyên sinh chất tế bào số lồi vi sinh vật có chứa phức chất protein đặc biệt mà thành phần có muối ribonucleat magie, nhuộm phức chất kết hợp với loại thuốc nhuộm triphenylmetan (như gential violet, crystal violet, metyl violet ) iơt cho màu tím vững chịu tác dụng cồn Những vi sinh vật có tính chất gọi vi sinh vật Gram dương (+) không gọi vi sinh vật Gram âm (-) Nguyên tắc: ¢ ¢ Sử dụng thuốc nhuộm có khả thẩm thấu qua màng tế bào kết hợp với thành phần khác tế bào thành hợp chất màu đặc trưng, bền vững Thuốc nhuộm thường dùng chất màu anilin, chủ yếu loại kiềm trung tinh Vì thành phần hóa học tế bào lồi vi sinh vật phận tế bào khác nên khả mức độ bắt màu khơng giống Tùy theo mục đích nghiên cứu mà chọn loại thuốc nhuộm cách nhuộm cho phù hợp Các phương pháp : nhuộm màu đơn giản nhuộm màu phức tạp Dựa vào khả bắt màu gram người ta chia vi sinh vật thành hai nhóm: ¢ ¢ 65 Gram dương (+): gồm hầu hết loại cầu khuẩn, trực khuẩn hiếu khí có bào tử (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus mycoides), nấm men, xạ khuẩn Gram âm (-): gồm nhóm vi khuẩn đường ruột Bacterium coli, Bacterium typhi, Bacterium aerogenes, Bacterium proteus, vi khuẩn axetic Biến đổi màu tế bào trình nhuộm Gram 66 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM B QUAN SÁT VI KHUẨN 67 68 17 15/11/2021 Q UAN SÁT VÀ PHÂN BIỆT BỐN LOÀI NẤM MỐC ĐIỂN HÌNH : M UCOR, R HIZOPUS, A SPERGILUS VÀ P ENICILLIUM C QUAN SÁT NẤM MỐC 69 70 MUCOR VÀ RHIZOPUS ASPERGILUS VÀ PENICILLIUM Sợi nấm đa bào, đầu sợi nấm mang bào tử phình to , tạo thành tế bào hình chai (hay thể bình) hình thành chuỗi đính bào tử (bào tử ngoại sinh) Sợi nấm đơn bào, chúng có khả tạo thành bào tử nang (bào tử nội sinh) Sợi màu trắng, bào tử nang vàng Mucor Cuống bào tử nang phân nhánh mọc lên vị trí sợi nấm 71 Aspergilus Rhizopus Cuống bào tử nang không phân nhánh, mọc lên chỗ sợi nấm ăn sâu vào môi trường, cuống bào tử mọc thành cụm ba bốn chân cụm có mọc nhiều sợi nhỏ ăn sâu vào môi trường trông giống rễ bụi lúa gọi rễ giả Cuống đính bào tử đơn bào tế bào hình chai đính bào tử tỏa đầu sợi nấm sinh sản tia nước đầu vịi tưới Penicillium Cuống đính bào tử đa bào, đầu cuống phân nhánh nhiều lần thành đốt song song hình thành đính bào tử Các tế bào hình chai đính bào tử hướng lên phía giống chổi 72 18