Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 69 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
69
Dung lượng
3,26 MB
Nội dung
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Lưu Minh Cúc,
người đã tận tình hướng dẫn, ủng hộ và trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, Chủ
nhiệm Bộ môn Di truyền học, trường ĐH KHTN Hà Nội, người thầy đã dạy dỗ,
hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em Bộ môn Sinh học phân tử, Viện
Di truyền Nông nghiệp, đã nhiệt tình hỗ trợ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt
quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, thầy cô trong nhóm thực hiện
đề tài “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước
biển dâng cho vùng đồng bằng ven biển Việt Nam” của Viện Di truyền Nông
nghiệp, những người đã tận tình hướng dẫn kỹ thuật, giúp đỡ vật chất và tinh thần
cho tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Di truyền học, trường Đại học
Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và cổ vũ tinh
thần để tôi hoàn thành đề tài của mình.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn từ đáy lòng tới gia đình, bạn bè, những
người luôn bên tôi, cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua.
Học viên
Trần Long
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và
Việt Nam..................................................................................................................... 3
1.1.1. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới ..........3
1.1.2. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam .....4
1.1.2.1. Các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam ...................................................................5
1.2. Những nghiên cứu về tính chống chịu mặn ở cây lúa ..................................... 8
1.2.1. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa ...............................................................8
1.2.2. Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn ..........................................................10
1.2.2.1. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn ...................................10
1.2.2.2. Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn .....................................11
1.2.2.3. Sự biểu hiện gen chống chịu mặn ................................................................11
1.3. Chỉ thị phân tử .................................................................................................12
1.3.1 Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử ...............................................................12
1.3.2. Một số chỉ thị phân tử thường dùng .............................................................13
1.3.2.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism- Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn) ....................................13
1.3.2.2. Chỉ thị phân tử dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: Chỉ thị
RAPD, chỉ thị AFLP, chỉ thị STS… ..........................................................................14
1.3.2.3. Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại ................................15
1.4. Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử..............................................................17
1.4.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền ........................................................................17
1.4.2. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền ....................................................................17
1.4.3. Trong chọn giống cây trồng ..........................................................................18
1.4.4. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại
(Marker Assited Backcrossing - MABC) ...............................................................20
1.5. Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn .......................................22
1.5.1. Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới.....22
1.5.2. Giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam và tình hình chọn giống lúa chịu mặn .. 25
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................27
2.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................27
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................27
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................28
2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số..........................................................28
2.3.1.2. Phương pháp PCR với mồi SSR ...................................................................28
2.3.1.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% ...............................................29
2.3.1.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide .............................................30
2.3.2. Phương pháp lai nhân tạo .............................................................................31
2.3.3. Quy trình MABC (Marker Assisted Backcrossing) trong chọn tạo giống lúa
chịu mặn ...................................................................................................................32
2.3.4. Phương pháp đánh giá mặn nhân tạo ..........................................................33
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................36
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...........................37
3.1. Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số ..............................................................37
3.2. Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ ..........................................................38
3.3. Phân tích các cá thể BC bằng phƣơng pháp MABC ...................................41
3.3.1. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC1F1
(AS996/FL478 x AS996) ..........................................................................................41
3.3.2. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC2F1
(AS996/FL478/AS996/ AS996) ................................................................................44
3.3.3. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC3F1
(AS996/FL478/AS996/ AS996/AS996 ) ...................................................................45
3.3.4. Kết quả đánh giá tính chịu mặn các dòng chọn lọc .....................................47
3.3.5. Đánh giá chỉ tiêu nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất
của các dòng chịu mặn ............................................................................................50
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
Acid Deoxyribonucleic
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphisms
APS
Ammonium Persulfate
BC
Backcross
BĐKH
Biến đổi khí hậu
CAPS
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
cM
centiMorgan
CTAB
Cetyl Trimethylammonium Bromide
ĐBSCL
Đồng bằng Sông Cửu Long
ĐBSH
Đồng bằng Sông Hồng
dNTP
Deoxynucleotide Triphosphate
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic Acid
FAO
Food and Agriculture Organization
GDP
Gross Domestic Product
GGT
Graphical Genotyper
IRRI
International Rice Research Institute
LD-MAS
Linkage Disequilibrium - MAS
MABC
Marker-assisted backcrossing
MAS
Marker-assisted selection
NST
Nhiễm Sắc Thể
PCR
Polymerase Chain Reaction
QTL
Quantitative trait loci
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
RNAse
Ribonuclease
SSR
Simple Sequence Repeat
STR
Short Tandem Repeats
STS
Sequence-Tagged Sites
TBE
Tris/Borate/EDTA
TE
Tris-EDTA
TEMED
Tetramethylethylenediamine
UV
Ultraviolet
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 ................4
Bảng 2. Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL tháng 4 (1991 – 2000) ............................6
Bảng 3. Sự tương quan giữa số thể hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng ưu tú
(nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1 ..............................................20
Bảng 4. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR ..............28
Bảng 5. Chương trình chạy của phản ứng PCR ......................................................29
Bảng 6. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida (Yoshida và ctv, 1976) .34
Bảng 7. Thang điểm Standard Evaluating Score (IRRI, 1997) .................................35
Bảng 8.. Tỷ lệ nền gen cây nhận ở 12 cây tái tổ hợp thế hệ BC1F1 .........................43
Bảng 9. Kết quả đánh giá mức chịu mặn của các dòng BC3F3 theo tiêu chuẩn IRRI,
1997 ...........................................................................................................................50
Bảng 10. Đặc tính nông sinh học của các dòng AS996-Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà
nội ..............................................................................................................................51
Bảng 11. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cúa các dòng AS996 – Saltol
(Vụ Xuân 2013) tại Hà nội ........................................................................................52
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Diện tích và nồng độ mặn vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng
thêm 1,0 m so với hiện nay ........................................................................................ 7
Hình 2. Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh ứng với
mực nước biển dâng cao 1m ..................................................................................... 7
Hình 3: Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết gen
kết hợp lai trở lại (MABC) ....................................................................................... 36
Hình 4: Kết quả điện di kiểm tra ADN của các giống trên gel agarose .................. 37
Hình 5. Các chỉ thị liên kết gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1................................ 38
Hình 6. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 6%................ 39
Hình 7. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 4.5%............. 39
Hình 8. Bản đồ di truyền các chỉ thị SSR được sử dụng cho phân tích các cá thể
quần thể AS996/FL478 ............................................................................................. 40
Hình 9. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị AP3206 ............... 41
Hình 10. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM10793 .......... 41
Hình 11. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM310 .............. 42
Hình 12. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM5639 ............ 42
Hình 13. Bản đồ của một số cây BC1F1 (AS996/FL478/AS996) trên NST1, 3, 4 và 10 ......43
Hình 14. Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị
RM3412 .................................................................................................................... 44
Hình 15. Sàng lọc cá thể BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị
RM10793, và RM10711 .......................................................................................... 44
Hình 16. Sàng lọc các thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996)sử dụng chỉ
thị RM3412, RM10711, RM10793, AP3206 và RM10694 ....................................... 45
Hình 17: Bản đồ của cây BC3F1 - P284-112-291 phân tích bằng phần mềm
GGT2.0 ..................................................................................................................... 46
Hình 18. Các dòng thí nghiệm BC3F3 trước khi thử mặn ....................................... 47
Hình 19. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm
(NaCl=60/00 ) .......................................................................................................... 48
Hình 20. Kết thúc thí nghiệm thử mặn các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm
(NaCl=60/00) ............................................................................................................. 49
MỞ ĐẦU
Lúa gạo cung cấp khoảng 32% tổng sản lượng lương thực Châu Á. Mỗi năm
toàn thế giới cung cấp khoảng 729 triệu tấn gạo, trong đó chỉ tính riêng khu vực
Châu Á là 661 triệu tấn [15]. Biến đổi khí hậu toàn cầu là mối đe dọa lớn đối với an
ninh lương thực thế giới. Với hơn 3000km bờ biển, hàng năm những vùng trồng lúa
ven biển Việt Nam chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực của biển. Theo thống
kê, diện tích đất ngập mặn năm 1992 là 494.000 ha, đến năm 2000 là 606.792 ha [1]
và năm 2013, chỉ tính riêng trên đồng bằng song Cửu Long là khoảng 740.000 ha.
Đồng bằng sông Cửu Long là vùng tạo ra 40% GDP nông nghiệp của cả nước. So với
cả nước, sản lượng lương thực vùng chiếm 50%, thủy sản chiến 70%. Tuy nhiên,
Đồng bằng sông Cửu Long lại được xem là vùng sẽ phải chịu tác động của biến đổi
khí hậu nhiều nhất và những tác động này sẽ ảnh hưởng rất lớn đến an ninh lương
thực. Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng băng tan ở
hai cực, và hệ lụy của nó là nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven
biển. Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho
chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảm bảo an
ninh lương thực sẽ khó hoàn thành. Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm
mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu.
Theo kịch bản biến đổi khí hậu năm 2012, nếu mực nước biển dâng 1m, sẽ
có khoảng 39% diện tích đồng bằng sông Cửu Long, trên 10% diện tích vùng đồng
bằng sông Hồng và Quảng Ninh, trên 2,5% diện tích thuộc các tỉnh ven biển miền
Trung và trên 20% diện tích Thành phố Hồ Chí Minh có nguy cơ bị ngập; gần 35%
dân số thuộc các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long, trên 9% dân số vùng đồng
bằng sông Hồng và Quảng Ninh, gần 9% dân số các tỉnh ven biển miền Trung và
khoảng 7% dân số Thành phố Hồ Chí Minh bị ảnh hưởng trực tiếp; trên 4% hệ
thống đường sắt, trên 9% hệ thống quốc lộ và khoảng 12% hệ thống tỉnh lộ của Việt
Nam sẽ bị ảnh hưởng [2].
Để giải quyết những khó khăn này, việc chọn tạo các giống lúa chịu mặn là
rất cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng
phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn”.
1
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ
thị phân tử kết hợp với lai trở lại trong quy tụ gen chịu mặn Saltol đã được xác định
trước trong giống lúa FL478 vào giống lúa AS996 đang được trồng phổ biến tại
Việt Nam để tạo ra dòng AS996 – Saltol đáp ứng nhu cầu về giống chịu mặn trong
sản xuất lúa gạo.
2
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và
Việt Nam
1.1.1. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới
Biến đổi khí hậu (BĐKH) là sự biến động trạng thái trung bình của khí hậu
toàn cầu hay khu vực theo thời gian từ vài thập kỷ đến hàng triệu năm. Nguyên
nhân của những biến đổi này là do quá trình động lực của trái đất, bức xạ mặt trời,
và gần đây có thêm hoạt động tác động của con người.
Biến đổi khí hậu ngày nay không còn là vấn đề của một quốc gia hay của
một khu vực mà là vấn đề toàn cầu. Biến đổi khí hậu sẽ tác động nghiêm trọng đến
sản xuất, đời sống và môi trường trên phạm vi toàn thế giới. Nhiệt độ tăng, mực
nước biển dâng cao, sẽ gây hiện tượng ngập lụt, gây nhiễm mặn nguồn nước, ảnh
hưởng đến nông nghiệp, gây rủi ro lớn đối với công nghiệp và các hệ thống kinh tế xã hội trong tương lai (Ứng phó với biến đổi khí hậu và biển dâng, 2009).
Những thách thức của biến đổi khí hậu đối với sản xuất lúa gạo là vô cùng
quan trọng. Phần lớn lúa gạo mà thế giới sử dụng được trồng ở các vùng đất thấp
hoặc vùng đồng bằng ở các quốc gia như Việt Nam, Thái lan, Bangladesh, Ấn Độ...
Những khu vực này lại có nguy cơ bị xâm nhập mặn khi mực nước biển dâng cao,
cho thấy sự cần thiết của các giống lúa có khả năng chịu đựng được cả tình trạng
ngập nước lẫn độ mặn cao. Theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu ha đất trên
toàn thế giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi muối và khoảng 20% diện tích tưới
(khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị vấn đề xâm nhập mặn theo mức độ khác nhau
[15]. Điều này là nghiêm trọng hơn kể từ khi các khu vực tưới tiêu có trách nhiệm
bảo đảm một phần ba sản xuất lương thực thế giới.
Ở Châu Á nếu nước biển dâng lên 1m, khoảng 25.000km2 rừng đước sẽ bị
ngập, 10.000km2 đất canh tác và diện tích nuôi trồng thủy sản trở thành đầm lầy
ngập mặn, 21,5 triệu ha đât canh tác phải đối mặt với vấn đề nhiễm mặn, và ước
tính gây thiệt hại lên tới 50% đất trồng trọt toàn cầu vào khoảng giữa thế kỷ 21 [28].
Ở hạ lưu sông Nil (Ai Cập), 6 triệu người phải di dời và 4.500km2 đất nông nghiệp
bị ngập và nhiễm mặn. Ở Bangladesh 18% diện tích đất nông nghiệp bị ngập, ảnh
3
hưởng đến 11% dân số. Theo ước tính của Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) mỗi
năm nông dân Ấn Độ và Bangladesh bị thiệt hại tới 4 triệu tấn thóc do lũ lụt, do
nhiều giống lúa chỉ chịu ngập trong vòng chưa đầy một tuần. Còn ở Maldives hơn
80% diện tích đất thấp hơn mực nước biển và có thể bị ngập, mặn khi nước biển
dâng cao [39].
1.1.2. Ảnh hƣởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam
Việt Nam là một trong những nước chịu ảnh hưởng nặng nề do mực nước biển
dâng. Nước biển dâng thì phần lớn đất màu mỡ nhất của Việt Nam sẽ bị ngập mặn.
Theo đó, sản lượng lúa có thể giảm đáng kể do mực nước biển dâng cao và sự thay
đổi lượng mưa làm thay đổi thủy văn ở các vùng đồng bằng. Do chúng ta có bờ biển
dài hơn 3.620 km, 28 tỉnh, thành phố giáp biển nên mực nước biển dâng cao sẽ làm
giảm lưu lượng dòng chảy của các con sông, thậm chí ngay cả tại các nơi xa bờ biển.
Bảng 1. Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999
(Đơn vị tính: cm)
Kịch bản
nƣớc biển
dâng
2020
Thấp (B1)
8-9
11-13 16-18 28-21 27-33 33-40 39-48 44-56 49-64
Trung bình
(B2)
8-9
12-13 17-19 23-26 29-34 36-43 43-52 50-62 57-73
Cao (A1F1)
8-9
13-14 18-20 25-29 34-40 44-52 55-65 66-80 78-95
Các mốc thời gian của thế kỷ 21
2030
2040
2050
2060
2070
2080
2090
2100
(Kịch bản BĐKH nước biển dâng cho Việt Nam)- nguồn Bộ Tài nguyên Môi
trường - 2012.
Các nhà khoa học chỉ ra rằng, khi nước biển dâng, tùy mức độ sẽ có những
phần diện tích canh tác ở Đồng bằng Sông Cửu Long, Đồng bằng Sông Hồng, các
đồng bằng duyên hải khác bị ngập mặn. Theo kịch bản A1FI, lũ sẽ gây ngập 90%
diện tích trong 4,5 – 5 tháng/năm, vào mùa kiệt nước mặn (nồng độ muối 4%) xâm
nhập trên 70% diện tích…Đây lại là những vựa lúa của cả nước nên khi đó chắc
chắn an ninh lương thực bị đe dọa. Việt Nam là một trong những nước bị ảnh hưởng
4
nghiêm trọng nhất bởi mực nước biển dâng, dẫn đến sự xâm nhiễm mặn ngày càng gia
tăng, chủ yếu là Đồng bằng Sông Hồng và Đồng bằng Sông Cửu Long. Mặn là hiện
tượng liên kết với nước biển dâng mang nước mặn tiến sâu vào đất liền, biến nhiều
vùng đất trồng lúa bị mặn hóa [3].
1.1.2.1. Các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam
Đất nhiễm mặn là loại đất có chứa nhiều cation Na+ hấp phụ trên bề mặt keo
đất và trong dung dịch đất [1;2]. Đất chứa nhiều Na+ dưới dạng muối tan NaCl,
Na2SO4 nên áp suất thẩm thấu dung dịch đất lớn làm ảnh hưởng tới quá trình hút
nước và dinh dưỡng cây trồng. Hoạt động của vi sinh vật đất yếu
Sự hình thành đất nhiễm mặn do 2 nguyên nhân chủ yếu là ảnh hưởng của
nước ngầm hay do ảnh hưởng của nước biển mặn theo trủy triều tràn vào.
Ở Việt Nam, các vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu ở 2 vùng châu thổ lớn là
ĐBSH và ĐBSCL. Ảnh hưởng của nước biển ở vùng cửa sông vào đất liền ở ĐBSH
chỉ khoảng 15km, nhưng ở vùng ĐBSCL lại có thể xâm nhập tới 40 – 50 km (FAO,
2012) [16].
Vùng đất nhiễm mặn Đồng bằng sông Cửu Long:
Theo kịch bản biến đổi khí hậu năm 2012 [2] dự báo khoảng
7.600km2 (tương đương 20% diện tích) ĐBSCL sẽ chìm khi nước biển dâng 75cm
và ở mức 100cm thì phạm vi ngập trải rộng trên diện tích 15.116km 2, tương đương
37,8% diện tích tự nhiên toàn vùng. Dự báo vào năm 2030, khoảng 45% đất của
ĐBSCL có nguy cơ nhiễm mặn cục bộ. Nhiễm mặn gây hại rất lớn cho sự sinh
trưởng và phát triển của cây lúa, trung bình năng suất lúa có thể giảm 20-25%, thậm
chí tới 50%, ảnh hưởng nghiêm trọng đến canh tác 3 vụ mùa, sản lượng lương thực
bị mất đi đáng kể, đe dọa an ninh lương thực quốc gia.
Nước ta có khoảng 1 triệu ha đất nhiễm mặn, trong đó có 2 vùng nhiễm mặn
lớn là vùng châu thổ sông Hồng và vùng lúa ĐBSCL. ĐBSCL có diện tích tự nhiên
là 3,96 triệu ha, chiếm 12% diện tích cả nước, trong đó diện tích đất sản xuất nông
nghiệp khoảng 2,9 triệu ha, đất sản xuất lâm nghiệp là 430.770 ha, đất khác chiếm
277.000 ha và đất chuyên dùng khoảng 262.682 ha [3].
ĐBSCL bị chia cắt bởi hệ thống sông tự nhiên kết hợp với hệ thống sông
ngòi chằng chịt đã tạo thành hệ thống thủy lợi cung cấp nước cho sản xuất nông
5
nghiệp, thau chua rửa mặn và cũng là hệ thống vận chuyển đường thủy tốt, rất thuận
lợi cho vận chuyển hàng hóa, nông sản. Mùa lũ thường kéo dài 5 tháng với lượng
nước chiếm khoảng 3/4 tổng lượng nước cả năm, và 7 tháng mùa khô cạn, lượng
nước còn lại rất ít. Do đó, thủy triều có ảnh hưởng rất lớn đến phần lớn vùng hạ lưu
sông Mekong, toàn bộ ĐBSCL vào mùa khô. Các vùng lúa ven biển ĐBSCL thuộc
các tỉnh: Sóc Trăng, Bến Tre, Tiền Giang, Trà Vinh, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang
đều bị nhiễm mặn, nhiều hay ít phụ thuộc vào ảnh hưởng của thủy triều và hệ thống
kênh ngòi, đê ngăn mặn của từng vùng. Độ mặn lớn nhất trong sông theo quy luật
thường xuất hiện cùng với kỳ triều cường trong tháng, nước biển càng mặn, càng
vào sâu trong đất liền ở các vùng triều mạnh và ít có nước thượng nguồn đổ về [3].
Mức độ xâm nhập mặn tùy thuộc vào sự xâm nhập của nước biển, và tùy vào
mùa trong năm, cao điểm vào các tháng có lượng mưa thấp, khoảng tháng 3 – 4
dương lịch. Qua chuỗi số lượng thực đo 10 năm (1991 – 2000) ở ĐBSCL [4] đã
phân tích diễn biến nồng độ mặn, xác định đường đẳng trị mặn ứng với các trị số:
0,4 g/l; 2 g/l; 4 g/l; 16 g/l theo thời gian từng tháng trong mùa khô, tìm ra diễn biến
mặn trung bình tháng 4 (tháng có nồng độ mặn cao nhất trong năm) của thời đoạn
10 năm trên ĐBSCL diện tích bị xâm nhập mặn >0,4 g/l chiếm 2.126.635 ha (Bảng
1.2).
Bảng 2. Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL tháng 4 (1991 – 2000)
STT
Khu vực
1
Không ảnh hưởng mặn
2
Xâm nhập mặn
3
Độ mặn (g/l)
Diện tích (ha)
Tỷ lệ (%)
1.773.365
45,5
0,0 – 0,4
107.025
2,8
Xâm nhập mặn
0,4 – 2,0
232.816
6,0
4
Xâm nhập mặn
2,0 – 4,0
148.244
3,8
5
Xâm nhập mặn
4,0 – 16,0
1.378.550
35,3
6
Xâm nhập mặn
>16,0
260.000
6,6
3.900.000
100
Tổng cộng (làm tròn)
(Lê Sâm, 2003)
6
ĐBSCL có khoảng 1,8 – 2,1 triệu ha đất tự nhiên chịu ảnh hưởng mặn tập
trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Kiên Giang, Tiền Giang, Trà Vinh và
Sóc Trăng, phần lớn là đất bị nhiễm mặn kết hợp với phèn, ngập nước [3].
Hình 1. Diện tích và nồng độ mă ̣n vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng
thêm 1,0 m so với hiện nay
Vùng đất nhiễm mặn Đồng bằng Sông Hồng
Hình 2. Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh
ứng với mực nước biển dâng cao 1m
7
Nước biển dâng là một quá trình liên tục, nếu chúng ta không có biện pháp
ngăn chặn quyết liệt thì quá trình càng ngày càng nhanh. Ảnh hưởng của nó là khôn
lường, cần có sự chuẩn bị ứng phó đúng mức và ngay từ bây giờ.
Các vùng lúa nhiễm mặn ở vùng ĐBSH thuộc các tỉnh như: Thái Bình, Hải
Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa,… Một số vùng ven biển thuộc Hải
Phòng bị nhiễm mặn khoảng 20.000ha ở hai dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm
mặn xâm nhiễm từ 0,3 – 0,5%, chủ yếu tập trung tại các huyện như: Kiến Thụy,
Tiên Lãng, Thủy Nguyên, Vinh Bảo,… Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000ha nhiễm
mặn chủ yếu ở các huyện Thái Thụy, Tiền Hải, Kiến Xương,… Tỉnh Nam Định có
khoảng 10.000ha chủ yếu ở các huyện như Nghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thủy,
… Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000ha đất nhiễm mặn ở các huyện như Hậu Lộc,
Nga Sơn, Hoằng Hóa, Hà Trung, … riêng huyện Hậu Lộc có 8.000 ha do nước biển
tràn vào sau mùa lũ năm 2005. Các giống lúa mùa địa phương trước đây thường
được gieo trồng là: Cườm, Nhộng, Tẻ Tép, Tẻ Đỏ, Chiêm Bầu, Cút Hương...năng
suất thấp, chỉ đạt 18 - 20 tạ /ha. Gần đây một số giống lúa chịu mặn trung bình như:
Mộc Tuyền, X21, Xỉ, X19, VD97, VD920... cho năng suất khá cao nhưng có dạng
hình yếu, ít chịu phân, cao cây, lá lướt [6].
1.2. Những nghiên cứu về tính chống chịu mặn ở cây lúa
1.2.1. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa
Lúa là cây lương thực thích hợp nhất trên đất mặn, dù nó luôn được đánh giá
là cây nhiễm trung bình với mặn. Vì đất mặn luôn ở dưới điều kiện bị ngập nước,
những cây trồng khác không thể sinh trưởng được ngoại trừ lúa [9]. Nhiễm mặn gây
tổn hại đến cây lúa là do mất cân bằng thẩm thấu và tích luỹ quá nhiều ion Cl [11].
Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, nguyên nhân gây tổn hại cho cây
lúa trong môi trường mặn là do tích luỹ quá nhiều ion Na+ và ion này trực tiếp gây
độc trên cây trồng, làm cho Cl- trở thành ion trơ nên phổ kháng của cây tương đối
rộng (Yeo và Flower, 1996). Như vậy, sự tổn hại ở cây lúa trên đất mặn là do cây
hấp thu quá dư cả ion Na+ và Cl- [42].
8
Ảnh hưởng của Na+ là phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất.
Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na - K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt. Cây lúa
chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na+ và gia tăng hấp thu K+ để
duy trì sự cân bằng Na - K tốt trong chồi. Ion K+ có vai trò quan trọng làm kích hoạt
enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn [36]. Tuy thế việc khám
phá ra cơ chế và những tổn hại trên cây lúa do mặn thì rất phức tạp, ngay cả dưới
những điều kiện ngoại cảnh kiểm soát được.
Mặn gây hại trên cây trồng bắt đầu bằng triệu chứng giảm diện tích lá, những
lá già nhất bắt đầu cuộn tròn và chết, theo sau đó là những lá già kế tiếp và cứ thế
tiếp diễn. Cuối cùng, những cây sống sót có những lá già bị mất, những lá non duy
trì sự sống và xanh. Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có xu hướng
tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do giảm diện tích lá. Trong
điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rễ suy giảm tương ứng với
mức độ thiệt hại [20].
Nhiều nghiên cứu còn cho thấy rằng, cây lúa chống chịu mặn trong suốt thời
gian nảy mầm, trở nên rất nhiễm ở giai đoạn mạ non (giai đoạn 2-3 lá), tiếp tục
chống chịu trong giai đoạn sinh sản dinh dưỡng, kế đến nhiễm suốt trong giai đoạn
thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng trở nên chống chịu hơn trong giai đoạn chín [36].
Tuy thế, một nghiên cứu khác cho rằng, tại giai đoạn trổ, cây lúa không mẫn cảm
với mặn [9]. Do đó, sinh trưởng và phát triển của cây lúa phải được chia ra nhiều
giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chế chống chịu mặn của lúa.
Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình
nghiên cứu rất nổi tiếng [11], [28]. Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của
cây lúa dưới những mức độ thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trưởng phát
triển khác nhau (Maas và Hoffman 1977) Yeo và Flower (1984) đã tổng kết cơ chế
chống chịu mặn của cây lúa theo từng nội dung như sau:
+ Hiện tượng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lượng muối dư thừa
nhờ hiện tượng hấp thu có chọn lọc
+ Hiện tượng tái hấp thu - Cây hấp thu một lượng muối thừa nhưng được tái
hấp thu trong mô libe. Na+ không chuyển vị đến chồi thân
9
+ Chuyển vị từ rễ đến chồi - Tính trạng chống chịu mặn được phối hợp với
một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở chồi, làm cho
sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi
+ Hiện tượng ngăn cách từ lá đến lá - Lượng muối dư thừa được chuyển từ lá
non sang lá già, muối được định vị tại lá già không có chức năng, không thể chuyển
ngược lại
+ Chống chịu ở mô: Cây hấp thu muối và được ngăn cách trong các không
bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hưởng độc hại của muối đối với hoạt động
sinh trưởng của cây
+ Ảnh hưởng pha loãng - Cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng nồng độ muối nhờ
tăng cường tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi.
1.2.2. Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn
1.2.2.1. Nghiên cứu di truyền số lƣợng tính chống chịu mặn
Phần lớn những tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi do môi trường là tính
trạng di truyền số lượng. Tính trạng số lượng được định nghĩa một cách kinh điển là
tính trạng có phân bố liên tục (Continuous distribution), tính trạng này được điều khiển
bởi nhiều QTL, mỗi QTL có một ảnh hưởng nhỏ đối với tính trạng mục tiêu.
Cho đến nay trên thế giới đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu sự di
truyền của tính chống chịu mặn. Theo Mishra và ctv, 1998: Tính trạng chống chịu
mặn là một tính trạng di truyền đa gen, không di truyền theo dòng mẹ (không do các
gen trong tế bào chất quy định) [29].
Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến
động rất khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu
mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó
loại bỏ ở ngay từ những thế hệ đầu, những dòng không đáp ứng được yêu cầu của
người chọn giống. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả
hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa
trong di truyền tính chống chịu mặn (Gregorio và Senadrina, 2002)[19]. Trong giai
đoạn trưởng thành của cây lúa tính trạng chiều cao cây, năng suất trong điều kiện
mặn được điều khiển bởi những gen cộng tính (Mishra và ctv, 1990)[30].
10
1.2.2.2. Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn
Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhưng công trình nghiên cứu kinh điển
về sự di truyền phân tử tính chống chịu mặn.
Dựa vào bản đồ QTL trên cơ sở tính chống chịu mặn là tính trạng mục tiêu
do đa gen điều khiển, sử dụng chỉ thị AFLP và STS các nhà khoa học đã cho thấy
gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn được định vị trên Nhiễm sắc thể
số 1 và được gọi là gen Saltol.
Bản đồ QTL được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa
gen điều khiển (thí dụ như tính chống chịu mặn). Di truyền số lượng truyền thống
không thể phát hiện QTL trên những Locut riêng biệt gắn với tính trạng số lượng
đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen
khác. Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng chỉ thị phủ trên toàn bộ
nhiễm thể trong hệ gen cây trồng sẽ cung cấp cho chúng ta công cụ có khả năng
nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gen trên những nhiễm thể
và xác định các gen mục tiêu [7].
Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của những tính
trạng số lượng bằng cách xác định số lượng, các vị trí, những ảnh hưởng của gen và
hoạt động của những Locut bao gồm tương tác gen (Epistasis) và tương tác QTL x
E (môi trường). Một mục đích khác của bản đồ QTL là xác định những chỉ thị mang
tính chẩn đoán đối với những kiểu hình đặc thù nào đó, sao cho việc ứng dụng trở
nên có hiệu quả, phục vụ yêu cầu chọn dòng (giống) chống chịu khô hạn, chống
chịu mặn, v.v.. Mục tiêu lâu dài của thí nghiệm về bản đồ QTL là “tách dòng” các
gen điều khiển tính trạng số lượng vô cùng phức tạp, thông qua tiếp cận kỹ thuật
“map-based cloning”. [6]
1.2.2.3. Sự biểu hiện gen chống chịu mặn
Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh lý thực vật, hàng loạt ảnh hưởng ức chế do
mặn cho thấy rằng thực vật tự bảo vệ mình khỏi những thiệt hại do mặn gây ra theo
mô hình phản ứng oxy hóa, tránh thiếu hụt nước, tăng cường hấp thụ ion trong chu
trình quang hợp [13]. Sự thể hiện gen chống chịu mặn xét về lĩnh vực sinh học phân
tử là một khám phá vô cùng thú vị. Tín hiệu được truyền vào tế bào, các gen có
chức năng chuyên môn được khởi động và hàng loạt các qúa trình phiên mã, dịch
mã xảy ra [1].
11
Các biểu hiện của cây khi gặp điều kiện mặn bao gồm những triệu chứng
chính là: Trắng đầu lá sau đó cháy. Lá vàng và chết hoặc sinh trưởng còi cọc, đẻ
nhánh kém, lép hạt, rễ phát triển kém…
1.3. Chỉ thị phân tử
1.3.1 Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử
Hiện nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc sử dụng
các chỉ thị phân tử để nghiên cứu, đánh giá sự có mặt của gen kháng làm cơ sở chính
xác cho chọn lọc các cá thể mang tính trạng mong muốn đã trở nên đơn giản hơn.
Chỉ thị phân tử (hay chỉ thị phân tử ADN) là những chỉ thị có bản chất là đa
hình ADN. Nó có thể là những dòng phân tử ADN có sẵn hay dưới dạng thông tin
về trình tự được lưu giữ và chuyển tải trong những tệp dữ liệu được lưu trữ trong
máy tính hay trên mạng internet (ví dụ như trình tự các mồi SSR, STS, RAPD,
AFLP...).
Đặc điểm chung của chỉ thị phân tử là, cho nhiều đa hình, là chỉ thị trội hoặc
đồng trội. Nhiều chỉ thị phân tử thuộc loại “đơn Locut–nhiều alen”, biểu hiện đa
hình 1 cách trung tính, không phụ thuộc vào mô, cơ quan (hay bộ phận cần tách
chiết ADN ra để khảo sát), không bị ảnh hưởng bởi áp lực môi trường. Bên cạnh đó,
chỉ thị phân tử có số lượng vô cùng lớn.
Việc sử dụng chỉ thị phân tử ADN có ưu điểm hơn nhiều so với chỉ thị hình
thái và chỉ thị hóa sinh, dễ dàng tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất
định nào đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một chỉ thị
ADN liên kết chặt với gen đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó. Chỉ thị
phân tử còn có thể đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kì giai đoạn sinh
trưởng nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong bất kì điều kiện môi trường đánh
giá nào, cùng một lúc đánh giá được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh
vật. Ngoài việc loại trừ được ảnh hưởng của mối tương tác giữa các alen khác nhau
của một Locut hoặc giữa các Locut khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng, tăng hiệu
quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu hiện ra
kiểu hình, số lượng các chỉ thị phân tử còn cực kỳ lớn, giúp cho nhà chọn giống
phân biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau,
thậm chí khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc do tái tổ hợp, phân biệt được giữa các
12
alen, các chủng sinh lý gây bệnh. Đây là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả
đối với các loại giống cây trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát
hiện tội phạm...
Chỉ thị phân tử được chia làm 3 loại chính:
Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN
Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR
Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại. Thực chất nhóm chỉ thị
này cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do có bản chất là chuỗi lặp lại nên
được xếp vào 1 nhóm riêng.
Các chỉ thị phân tử ADN thường có tên gọi theo tên kỹ thuật tương ứng như:
RFLP, STS, AFLP, CAPS, RAPD, SSR… Tuỳ vào mục đích nghiên cứu mà chỉ thị
nào sẽ được sử dụng. Về cơ bản, chúng ta có thể sử dụng bất cứ chỉ thị phân tử nào
trong nghiên cứu đa hình và lập bản đồ phân tử. Ngoài ra, cũng có thể sử dụng
những thông tin về trình tự ADN trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các
sinh vật. Tuy nhiên một chỉ thị tối ưu cần đảm bảo sự gắn kết chặt giữa chỉ thị và
tính trạng hay vùng quyết định tính trạng, phải có đa hình, có khả năng lặp lại được,
phải dễ sử dụng và phải có khả năng phân tích hàng loạt số lượng lớn.
1.3.2. Một số chỉ thị phân tử thƣờng dùng
1.3.2.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism- Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn)
Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên
cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người. Các đa hình RFLP sinh ra bởi
các đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen, ví dụ
như đảo đoạn, thêm đoạn, mất đoạn, hoặc bởi sự mất đi hay thêm vào của một hay
nhiều nucleotide khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm riêng biệt của mỗi giống, loài,
thậm chí mỗi cá thể.
Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN hệ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy
khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể
nhận biết được những đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với
những mẫu dò.
Như vậy nguyên lý cơ bản của chỉ thị RFLP dựa trên kỹ thuật lai Southern
13
(cắt ADN hệ gen bằng enzym giới hạn, điện di ADN trên gel agarose, biến tính
ADN, trung hòa, chuyển ADN lên màng lai, cố định ADN trên màng lai, lai với
mẫu dò đã được đánh dấu)
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen
của cùng một Locut gen. Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử (AA hoặc
aa) và các cá thể dị hợp tử Aa. Đây là đặc điểm ưu việt của loại chỉ thị RFLP.
Chỉ thị RFLP cho kết quả rất chính xác, do đó người ta sử dụng nó để kiểm
tra các loại chỉ thị phân tử khác.
Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, lượng
công việc cồng kềnh.
1.3.2.2. Chỉ thị phân tử dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: Chỉ thị
RAPD, chỉ thị AFLP, chỉ thị STS…
Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADNs)
Loại chỉ thị này được sinh ra bởi phản ứng PCR để nhân những đoạn ADN
hệ gen. Chỉ thị RAPD sử dụng những đoạn mồi ngẫu nhiên (random primers), dài
khoảng 10 nucleotide với nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 37o C). Lưu ý là phản ứng
PCR trong trường hợp RAPD chỉ sử dụng mồi đơn lẻ, nghĩa là mỗi phản ứng chỉ sử
dụng 1 mồi (vừa là mồi thuận vừa là mồi nghịch). Do mồi ngẫu nhiên có chiều dài
10 nucleotide, nên trên suốt chiều dài của hệ gen, trung bình cứ khoảng 410 (≈106)
nucleotide lại bắt gặp 1 vị trí mà mồi ngẫu nhiên xác định có thể kết cặp được.
Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Kỹ thuật AFLP (Zabeau và ctv, 1993) có thể phát hiện được sự có mặt của
những đoạn cắt giới hạn thuộc bất kỳ loại ADN nào [38]. Vì thế, loại chỉ thị này
được sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản đồ gen và
xác định chỉ thị phân tử liên kết gen. Nguyên lý của kỹ thuật dựa trên cơ sở nhân
bội có chọn lọc những mảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen. Nghĩa là AFLP có 2 công
đoạn chính:
Cắt ADN hệ gen thành những đoạn ngắn bằng enzym giới hạn
Nhân bội các đoạn ADN chọn lọc bằng kỹ thuật PCR.
Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị nhiều nhất so với các kỹ thuật
khác, có thể áp dụng cho tất cả các thực vật, động vật. Lượng ADN tổng số tiêu tốn
14
cho kỹ thuật này lại rất ít. Đây là một phương pháp có hiệu quả rất cao trong nghiên
cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen. Tuy nhiên, mặt hạn chế
của loại chỉ thị di truyền này là ở chỗ nó thuộc loại chỉ thị trội, không có khả năng
phân biệt giữa thể đồng hợp và thể dị hợp. Ngoài ra nó có giá thành tương đối cao.
Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Vị trí đƣợc xác định bởi trình tự)
Chỉ thị STS do M. Olson và cộng sự đề xuất năm 1989. STS là một đoạn
ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó
cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự
nucleotide đã biết trước của ADN trong hệ gen [27].
STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những Locut đã biết bằng việc sử dụng cặp
mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locut đặc
trưng này. Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao
với PCR. Ở cây lúa, các STS được coi như là mốc chuẩn và người ta đã xác lập
được các STS liên kết với một số gen kháng sâu bệnh, sử dụng để phát hiện tính đa
hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết như STS liên kết với gen kháng stress, chịu
lạnh ở lúa. Nhờ đó việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một
tính trạng di truyền nào đó có thể được tiến hành dễ dàng. Sử dụng trong lĩnh vực
chọn giống dựa vào các dấu phân tử STS để tìm kiếm các gen quan tâm trong quần
thể và phân tích nguồn gen, nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài.
1.3.2.3. Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại
Trình tự lặp lại có kế tiếp (Tandemly Repeated Sequence) là những trình tự
lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thường được gọi là
ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lượng bản sao của chúng
trong hệ gen và tính chất của chuỗi. Thực ra, một số chuỗi lặp lại cũng thuộc loại
chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội ADN như chỉ thị vi vệ tinh. Tuy nhiên, do chúng có
bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp chung vào một nhóm riêng.
Tiểu vệ tinh (Minisatellite)
Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6
nucleotid trở lên (thường vào khoảng 15bp), bao phủ một vùng từ 0,5-3kb. Không
giống như ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và
thường thay đổi rất nhiều về kích thước (Armour và Jeffreys). Có 2 loại ADN tiểu
15
vệ tinh. Đó là ADN đầu mút NST và ADN tiểu vệ tinh siêu biến. ADN đầu mút
NST nằm ở tận cùng của vai NST, gồm một vài kilobase. ADN tiểu vệ tinh siêu
biến nằm ở vùng cận đầu mút NST (subtelomeric regions) (Napvi N.I và ctv,
1995)[32].
Chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates = SSR)
Vi vệ tinh, hay ở thực vật còn gọi là Simple Sequence Repeates – SSR (ở
người và động vật, người ta gọi “vi vệ tinh” là “Short Tandem Repeats” - STR) là
những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại gồm từ 2 đến
6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn vài chục lần. SSR đã được nghiên cứu lần đầu tiên
trên người và cho đến nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của tất cả các
Eukaryota khác.
Các “vi vệ tinh” rất phổ biến trong hệ gen của tất cả các sinh vật. Những kết
quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở thực vật, vi vệ tinh mang trình tự lặp lại (AT)n
nhiều hơn so với ở động vật, trong khi ở những loài động vật thì lại giàu vi vệ tinh
kiểu (GT)n hơn. Vùng có ADN lặp lại thường kém ổn định hơn so với các vùng
khác, do đó ở các cá thể khác nhau, trình tự đó được lặp lại với số lần khác nhau.
Như vậy vùng “vi vệ tinh” thường có độ đa hình cao hơn so với các vùng khác.
Người ta lợi dụng đặc điểm này để thiết kế mồi SSR nằm ở 2 đầu gần kề với đoạn
lặp lại.
Ưu điểm của chỉ thị SSR:
Rất nhiều đa hình
Là chỉ thị đồng trội (có thể phân biệt đồng hợp tử AA, hay BB, hoặc dị hợp
tử AB)
Kỹ thuật đơn giản, tiện lợi
Nhược điểm:
Quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một
loài.
Những marker phân tử nói trên đều có thể áp dụng đánh giá sự có mặt của
gen liên quan đến tính chống chịu mặn của cây lúa. Hướng ưu tiên hiện nay được
người ta quan tâm là sử dụng microsatellite (SSR).
16
1.4. Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử
1.4.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong
cùng một loài và giữa các loài khác nhau; sự đa dạng về gen có thể di truyền được
trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. Nghiên cứu đa dạng di truyền còn giúp
đánh giá nguồn tài nguyên di truyền của tập đoàn giống cây trồng, vật nuôi, giúp
cho việc sử dụng nguồn tài nguyên di truyền hiệu quả hơn. Đặc biệt, nghiên cứu đa
dạng di truyền có thể giúp tiên đoán khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố mẹ
(cặp bố mẹ nào có khoảng cách di truyền xa hơn thường sẽ cho ưu thế lai lớn hơn).
Một số chương trình phân tích đa dạng di truyền
NTSYS: Rất phổ biến. Sử dụng các thông số “1” hay “+” (có mặt), và “0”
hay “-“ (vắng mặt). Có thể dùng chương trình NTSYS cho các chỉ thị phân tử
RAPD, AFLP hay các chỉ thị “trội’ khác.
PopGene: Tương đối phổ biến. Sử dụng các thông số “1” (có mặt) và “0”
(vắng mặt) trong trường hợp chỉ thị di truyền là “trội”, hoặc các thông số AA, BB,
CC, AB, AC, BC... trong trường hợp chỉ thị di truyền là “đồng trội”. Ngoài ra,
PopGene còn được sử dụng trong trường hợp cần đánh giá những mẫu vật của nhiều
quần thể hoặc nhóm các quần thể.
1.4.2. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền
Bản đồ di truyền phân tử được thiết lập dựa trên cơ sở các loại chỉ thị phân tử
ADN (các chỉ thị RFLP, STS, SSR, RAPD, AFLP...). Trong quá trình giảm phân,
các gen trên cùng NST thường được phân ly cùng nhau như một nhóm liên kết gen.
Tuy nhiên, sự liên kết này không hoàn toàn do kết quả của quá trình trao đổi chéo
giữa các NST tương đồng. Kết quả của hiện tượng này là sự tái tổ hợp giữa các gen
trong một cặp NST hay giữa các nhiễm sắc thể. Tần số trao đổi chéo giữa hai gen
nào đó phản ánh khoảng cách di truyền giữa chúng và cho phép lập bản đồ di truyền
của NST biểu thị vị trí tương đối của các gen [7]. Sự liên kết của những gen nằm
trên cùng một NST được trình bày thành một bản đồ liên kết hay bản đồ NST thể
hiện trình tự tuyến tính của các gen dọc theo NST với khoảng cách giữa các gen liền
kề tỉ lệ thuận với tần số tái tổ hợp giữa chúng. Đơn vị khoảng cách trong bản đồ liên
kết được coi là đơn vị bản đồ, nó được xác định bằng phần trăm (%) tần số tái tổ
17
hợp, trong đó 1 centiMorgan (cM) tương đương với 1% tái tổ hợp. Bản đồ di truyền
phân tử được lập trên cơ sở sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các gen kiểm
soát các tính trạng nghiên cứu. Sự có mặt của gen quan tâm trong các cá thể nghiên
cứu thể hiện ở kiểu hình. Các chỉ thị ADN đồng phân ly với các gen là những chỉ
thị liên kết gen. Khoảng cách di truyền giữa các chỉ thị và gen được thể hiện bằng tần số
tái tổ hợp giữa chúng.
1.4.3. Trong chọn giống cây trồng
Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với
một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu
ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu hình của
cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ
cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó.
Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, còn những chỉ thị
“may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của
chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của
công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm mạnh mẽ hơn tới
vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection - MAS) với mục
đích sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo
giống mới. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ưu thế sau:
Kiểu gen của các Locut chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai
đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu hình
của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai đoạn
nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể.
Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các chỉ thị hình
thái rất hạn chế.
Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các hiệu
ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với
những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn.
Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân
biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái
thường tương tác theo kiểu trội - lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai.
18
Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh
giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân
tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp.
Bert Collard & David Mackill đưa ra khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên
chỉ thị phân tử (Marker assisted selection - MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặt
với Locut mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị ADN
(ADN markers) có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy [14].
MAS ứng dụng trong chọn tạo giống lúa có những ưu điểm nổi bật là: đặc
biệt với những tính trạng khó đánh giá thanh lọc dựa trên kiểu hình; tiết kiệm thời
gian và nguồn lực trong quá trình chọn lọc; rất quan trọng với một số tính trạng như
chất lượng hạt; có thể chọn lọc sớm, trước khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ
phân ly F2 hoặc F3; không bị ảnh hưởng của môi trường; có thể phân biệt giữa
đồng hợp và dị hợp và chọn lọc từng cây. Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi
khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của
mình [6].
Theo E. Francia, 2005, sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS
phụ thuộc vào các yếu tố: bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa
hình tại các vùng tương đồng để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm; mối
liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen kháng hay các QTLs; sự tái tổ hợp thích hợp
giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen; khả năng đánh giá một số lượng lớn cá
thể trong một thời gian và giá thành hiệu quả.
Có 2 kiểu chỉ thị có thể ứng dụng trong MAS. Một là chỉ thị phân tử được định
vị ngay trong phạm vi gen quan tâm. Đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS,
nhưng rất khó tìm thấy loại chỉ thị này. Hai là nhóm chỉ thị có khuynh hướng di
truyền cùng với gen quan tâm. Mối quan hệ này tìm thấy khi gen và chỉ thị có khoảng
cách vật lý gần nhau. Chọn lọc dựa trên chỉ thị này gọi là LD-MAS (Linkage
Disequilibrium -MAS).
Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương
trình chọn giống với nhiều ưu điểm:
Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều
dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong
19
quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả
và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang).
Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó
khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối với các
dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng những điều
kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc).
Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do vậy
có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa vào cùng một
lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau. Trong trường hợp này, các phương pháp
sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần
lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt được kết quả. Nhưng
nếu áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của
từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt.
1.4.4. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assited
Backcrossing - MABC)
Trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có
tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp lai trở lại liên tục qua 56 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ
tiếp theo. Bằng phương pháp này việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai hoặc du nhập cùng
một lúc vài gen mong muốn vào một dòng ưu việt thường gặp rất nhiều khó khăn
hoặc đôi khi không thể thực hiện được [31].
Trong trường hợp có một giống cây trồng ưu tú nhưng cần đưa thêm một vài gen
mong muốn vào giống đó, người ta sử dụng quy trình lai trở lại (trở lại) nhiều lần với
giống ưu tú nhằm thu được một giống cây trồng mới mang gen mong muốn nhưng vẫn
giữ nguyên nền di truyền của giống ưu tú. Theo quy trình chọn giống lai trở lại truyền
thống, phải ít nhất 6-8 thế hệ trở lại mới thu được cây mang gen mong muốn nhưng giữ
được gần 100% nền gen di truyền của giống ưu tú (bảng 3).
Bảng 3. Sự tương quan giữa số thể hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen
của dòng ưu tú (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1
20
Số thế hệ
backcross (n)
Tỷ lệ % kiểu gen của dòng nhận gen
1
75
2
87,5
3
93,8
4
96,9
5
98,4
6
99,2
Gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị
phân tử, các nhà khoa học đã đưa ra một phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân
tử mới – đó là “Chọn giống trên cơ sở chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assisted
BackCrossing – MABC).
MABC là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc đưa Locut gen quy
định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen mong muốn vào giống ưu tú nhằm
chọn tạo giống mới mang gen/QTL mong muốn nhưng vẫn giữ nguyên (gần 100%)
nền gen di truyền của giống ưu tú với thời gian chọn giống rất ngắn: quy trình chọn
giống kết thúc ở thế hệ BC3, thậm chí BC2.
Nguyên lý của phương pháp MABC là chuyển một QTL/gen từ dòng cho
gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc nền di truyền của dòng cho thông qua
phân tích toàn bộ hệ gen bằng chỉ thị phân tử. (Thomson và ctv., 2010)[40]. Việc sử
dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy
nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cường nền di truyền qua mỗi thế hệ.
Ưu điểm chính của phương pháp MABC là:
(1) Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với Locut gen đích
(2) Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố mẹ tái tổ hợp
(3) Tiến gần đến Locut quan tâm trên bản đồ liên kết
(4) Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm.
Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng [38]. Ngoài ra,
thông qua phương pháp này, tốc độ của quá trình chọn lọc được đẩy nhanh lên gấp
21
đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế hệ BC2 hoặc BC3 là đạt kết quả tương đương
với BC6 theo phương pháp thông thường.
Chọn giống trở lại nhờ chỉ thị phân tử còn giúp khắc phục được những trở
ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ loại bỏ được các
tác động gây nhiễu do các tương tác trong cùng một alen hay giữa các alen gây ra.
Những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng cách phân tích kiểu
hình. Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa nhiều gen
khác nhau vào một nền gen ưu việt.
1.5. Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn
1.5.1. Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới
Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến
đổi di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng về năng suất, chất lượng gạo
tốt, kháng một số sâu bệnh chính và chống chịu với những điều kiện bất lợi như khô
hạn, ngập úng, mặn. Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, viện
Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), từ năm 1977 - 1980 đã tiến hành chọn được những
dòng lúa chống chịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-1, IR463-22-2,
IR9884-54-3. Năng suất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm. Những
giống lúa cải tiến này cho năng suất cao hơn những giống lúa cổ truyền 2 tấn/ha.
Tác giả Gregorio và cộng sự (2002), báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào soma
lúa để tạo ra các biến dị soma chống chịu mặn. Từ giống lúa Pokkali (lúa mùa cao
cây, cảm quang, yếu rạ, lá dài to bản và rũ, đẻ chồi ít, gạo màu đỏ, phẩm chất gạo
xấu), tác giả đã thu được dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao
sản, thấp cây, sinh trưởng mạnh, chống chịu mặn cao như Pokkali, gạo có màu trắng
và phẩm chất gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn nhiều so với Pokkali.
Giống lúa TCCP226-2-49-B-B-3 đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống
lúa chịu mặn tại nhiều Trung tâm nghiên cứu lúa trên thế giới [19].
Cho tới nay, rất nhiều nghiên cứu đánh giá và xác định về tính chịu mặn của
các giống lúa bản địa và giống lúa cải tiến (Gregorio và cs, 2002; Negrao và cs,
2011). Một số giống lúa địa phương có nguồn gốc từ các vùng duyên hải Đông Á có
tính kháng mặn cao như giống Nona Bokra (Ấn độ), Pokkali (Sri Lanka), Getu (Ấn
độ), SR26B, Damodar, Cheriviruppu, Pat và Solla (Ấn độ), Ketumbar (In đô nê xi a),
22
Khao Seetha (Thái Lan), các giống thể hiện tính kháng mặn trên đều thuộc nhóm
Indica. Hơn nữa theo số liệu cập nhật mới nhất, một số dòng giống thuộc nhóm
Indica có nguồn gốc từ Saudi Arabia, Hawashi thể hiện tính chịu mặn vượt trội cao
hơn cả các giống lúa Pokkali và Nona Bokra [19, 33]
Đối với nhóm Japonica, ít dòng giống thể hiện tính kháng mặn hơn nhóm
Indica. Một số giống thuộc các nước ôn đới có tính chịu mặn khá như giống Harra
(Tây ban Nha), Agami (Ai cập), và Daeyabyeo (Hàn quốc). Các giống Japonica
nhiệt đới như giống Moroberekan mang tính kháng mặn cao, có nguồn gốc ở
Guinea nơi đất canh tác ảnh hưởng ngập mặn. Giống này đã được nghiên cứu và sử
dụng làm cây cho gen kháng mặn và lập bản đồ quần thể [24]. Các giống lúa thuộc
họ Oryza glaberrima, phần lớn được trồng ở Tây Phi thể hiện tính kháng mặn ít hơn
các giống lúa thuộc họ Oryza sativa [8].
Để hiểu sâu hơn về các tính di truyền kiểm soát khả năng chịu mặn của các
giống lúa, việc xác định các QTLs liên quan đến tính kháng mặn là rất cần thiết.
Danh sách các QTL liên quan đến tính chịu mặn ở lúa có thể tìm được trên trang
web Gramene (http://www.gramene.org). Đặc biệt các thông tin chi tiết về các
QTLs liên quan đến tính kháng mặn ở lúa có thể tra cứu tại trang dữ liệu TropGene
(http://tropenesdb,cirad.fr). Phần lớn các quần thể được sử dụng để lập bản đồ QTL
là sử dụng quần thể indica lai với Japonica chẳng hạn như IR64 lai với Azucena
hoặc Co29 x Moroberekan. Hơn nữa phần lớn các nghiên cứu đều lập bản đồ quần
thể RIL, DH hoặc F2:3. Tuy nhiên gần đây Kim và cs.. đã sử dụng quần thể lai trở
lại thì quy tụ được QTL chịu mặn nhanh chóng hơn [24]. Các tính trạng liên quan
đến khả năng chịu mặn ở lúa thể hiện do các gen phức hợp kiểm soát. Các QTL liên
quan đã được xác định trên các nhiễm sắc thể 1, 4, 6 và 7. Hiện vẫn chưa có QTL
thể hiện tính chịu mặn được tìm thấy trên nhiễm sắc thể 8 và 11, và một số ít QTL
đã xác định trên nhiễm sắc thể 2, 3, 5, 9, 10 và 12 [21,37,39]. Nhờ ứng dụng các
công nghệ, kỹ thuật tiên tiến như phương pháp MAS và MABC các nhà khoa học
đã chuyển được các QTLs/gen liên quan đến tính chịu mặn vào các giống lúa cải
tiến.[23,37].
Trong các năm từ 1969-1984, riêng các nhà khoa hoc thuộc viện nghiên cứu
lúa quốc tế (IRRI) đã sàng lọc và đánh giá khả năng kháng mặn của hơn 100.000
giống lúa thu thập từ nhiều khu vực khác nhau trên thế giới. Trong đó trên 20%
23
giống có khả năng chịu mặn khá. Các giống lúa bản địa thu thập ở khu vực vùng
duyên hải Nam Á có tính chịu mặn cao chẳng hạn giống Nona Bokra, Cheriviruppu,
SR26B, Solla (Ấn độ), Ketumbar (Indonesia), Khao Seetha (Thái lan), hay giống
Sóc nâu (Việt nam). Đặc biệt giống Hawasi nguồn gôc từ Saudi Arabia có khả năng
chịu mặn lớn hơn cả các giống chịu mặn Pokkali và Nona Bokra [17, 33].
Năm 1993, IRRI phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chống chịu
mặn khá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29. Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai
chuyển gen chống chịu mặn từ Pokkali vào một số giống lúa mùa địa phương có
tính chống chịu mặn bằng phương pháp trở lại vào các nguồn giống lúa cao sản
thích nghi với từng vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt. Tuy nhiên, nhược điểm chính
của phương pháp lai tạo truyền thống là cần nhiều thời gian để tạo ra một giống lúa
chống chịu mặn tốt. Thông thường thì 6 – 8 lần trở lại cần được thực hiện, tương
đương với 3 – 4 năm lai tạo. Một khó khăn khác thường gặp trong lai tạo giống mới
là đôi khi có mối quan hệ khá chặt chẽ giữa tính trạng chống chịu mặn với các tính
trạng xấu, không mong muốn, thường được lai chuyển vào con lai cùng lúc. Các
gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của
con lai. Do đó, lai tạo cho tính trạng chống chịu mặn trong vài trường hợp kéo dài
10 – 15 năm để phát triển một giống lúa mới (Collard và Mackill, 2008)[12]. Việc
lai tạo giống lúa chống chịu mặn còn gặp khó khăn do bản chất đa gen (QTL) của
tính trạng chống chịu mặn. Biểu hiện tính chống chịu mặn của một giống lúa bị ảnh
hưởng rất lớn bởi điều kiện môi trường ngoại cảnh. Theo Islam (2011) thì do hệ số
di truyền của tính chống chịu mặn thấp (nhỏ hơn 19,18%), nên tính chống chịu mặn
của các dòng con lai không cao như bố mẹ có gen chống chịu mặn như trường hợp
của giống Pokkali [22].
Sự phát triển của chỉ thị phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần
đây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu
mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Các nghiên cứu của
Gregorio (1997); Bonille và ctv (2002) và Niones (2004) đã lập được bản đồ gen rất
chi tiết cho QTL “Saltol” hiện diện trên nhiễm sắc thể số 1, quyết định tới khoảng
40 – 65% tính chống chịu mặn của lúa [20, 10, 35].
24
Trong số các chỉ thị phân tử thì SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực
hiện, nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế. Sự phát triển của marker phân tử
và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần đây đã được ứng dụng vào mục đích
xác định các QTL điều khiển tính chống chịu mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm
sắc thể khác nhau. Các nghiên cứu của Gregorio (1997) và Niones (2004) đã lập
được bản đồ gen rất chi tiết cho QTL “Saltol” nằm trên nhiễm sắc thể số 1, quyết
định tới khoảng 40 - 65% tính chống chịu mặn của lúa [20, 35].
1.5.2. Giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam và tình hình chọn giống lúa chịu
mặn
Việt Nam mới có rất ít nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn. Một số
giống lúa chịu mặn trồng ở các vùng ven biển Việt Nam như Cườm, Nhộng, Tẻ
Tép, Tẻ Đỏ, Chiêm Bầu, Cút Hương... năng suất thấp, chỉ đạt 18 - 20 tạ /ha. Là
những giống địa phương cho năng suất thấp.
Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo
một số giống lúa địa phương vùng Đồng bằng ven biển Bắc Bộ. Kết quả gây đột biến
nguồn Coban (Co 60) đã tạo ra những biến dị có lợi cho chọn giống. Các giống lúa CM1,
CM5, ... là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những đặc tính chống chịu
mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao [1].
Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2009 đến nay đã bước đầu tìm
được 30 dòng lúa có triển vọng chịu mặn là những dòng lúa kế thừa, được phát hiện
tính chịu mặn qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lưới. Một số
giống lúa mới của Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long xác định có khả năng kháng
mặn khá cao như: OM5629, OM5891, OM4900 đã được phát triển năng suất có thể
đạt từ 5-6 tấn/ha dưới điều kiện bất lợi do nhiễm mặn từ 6.0 đến 9.0 dS/m, các
giống này hiện đang được phát triển và mở rộng qui mô. Kết quả đã tạo ra các dạng
thử nghiệm tại nhiều địa điểm khác nhau trên cánh đồng trong 3 năm từ 2009 đến
2011 và những tác động ban đầu của chúng đã đang được tiếp tục khảo nghiệm, xác
định biện pháp kỹ thuật thích hợp để tăng tính chịu mặn và năng suất [34].
Lã Hoàng Anh và cộng sự đã tìm ra 10 QTL liên quan đến tính chống chịu
mặn trên giống Chành Trụi, nằm trên nhiễm sắc thể số 1, 3, 4, 6, 7, 9. Trong đó
25
QTL trên nhiễm sắc thể số 4 được xác định là QTL chính quy định tính chống chịu
mặn của giống [25].
Đề tài “Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu
mặn” của tôi được tiến hành trong khuôn khổ của dự án hợp tác quốc tế VN-Đan
Mạch nhằm “tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện
nước biển dâng cho vùng đồng bằng ven biển Việt Nam”, được thực hiện chính tại
Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp.
26
CHƢƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Giống nhận gen: là giống AS996 hạt dài, ngắn ngày, chất lượng gạo trung
bình, năng suất khá cao được trồng phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long.
Giống cho gen là: giống FL478 được nhập nội từ Viện Nghiên cứu Lúa Quốc
tế, mang Locut gen chịu mặn Saltol. Vùng Locut gen Saltol ở giống FL478 với vị trí
từ 10,6 đến 11,5 Mb trên NST số một gồm một số QTL quy định 45%-60% tính
chống chịu mặn ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng của cây lúa, chúng đóng vai trò
đặc biệt trong việc điều khiển tính nội cân bằng giữa tỉ lệ Na+/K+ cùng với sự có mặt
của các allen khác của giống gốc Pokkali trong vùng Locut gen Saltol đã được các
nhà khoa học tại IRRI chứng minh là sẽ mang phần lớn tính chống chịu mặn có thể
dùng được cho các chương trình chọn tạo giống bằng sinh học phân tử [3].
Giống lúa đối chứng nhiễm (giống mẫn cảm với điều kiện mặn) trong thí
nghiệm đánh giá tính chịu mặn là giống IR29 nhập nội từ IRRI.
Hóa chất: 500 chỉ thị SSR trải đều trên 12 NST của lúa (Hãng Bioneer – Hàn
Quốc); các hóa chất cho PCR (Hãng Fermentas – Mỹ); hóa chất tách chiết AND
(Hãng Sigma – Mỹ); hóa chất chạy gel (Hãng Merk – Đức)
Thiết bị máy móc sử dụng thuộc bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Di truyền
Nông nghiệp.
Phần mềm GGT2.0 để phân tính gen của các cá thể tái tổ hợp.
Thời gian thực hiện: năm 2012 -2014.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Sàng lọc chỉ thị đa hình giữa hai giống bố mẹ trên 12 nhiễm sắc thể.
Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết gen chịu mặn Saltol để chọn lọc các dòng
mang gen chịu mặn Saltol trong các thế hệ quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1.
Sử dụng chỉ thị phân tử nằm về hai phía gen Saltol để chọn lọc dòng tái tổ
hợp trong các thế hệ quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1.
Chọn lọc các dòng mang gen chịu mặn và chứa phần lớn nền di truyền của
giống nhận gen AS996 bằng chỉ thị phân tử.
27
Bước đầ u đánh giá khả năng chiụ
mặn nhân tạo và đặc tính nông sinh học
của các dòng chọn lọc.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số
ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến
(Shagai – Maroof - 1984) [26]. Lá lúa sau khi cấy 2 - 3 tuần được nghiền trong nitơ
lỏng thành dạng bột mịn. Mẫu được cho vào eppendorf 2ml và thêm 1ml đệm chiết
(100mM Tris; 500mM NaCl; 50mM EDTA; 0,07% - Mercaptol ethanol) sau đó
thêm 50l SDS 10% rồi ủ trong 30 phút ở 650C. Hỗn hợp trên mang ly tâm ở 13500
vòng/phút trong 20 phút, sau đó lấy dịch nổi rồi thêm 1ml isopropanol alcohol, để
vào tủ 40C 30 phút, ly tâm tiếp ở 13500 vòng/phút trong 25 phút. Đổ hết dịch nổi,
thêm 400l đệm TE (10mM Tris; 0,5 mM EDTA pH=8,0) rồi ủ trong 5 phút ở
65oC. Cho 3l RNAse (10mg/ml) vào mỗi ống và ủ ở 37oC 60 phút. Thêm 400l
đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2%
CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút. Thêm vào 800l chloroform/isoamyl
alcohol (24:1) sau đó ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi được tách
riêng, thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong -200C 60 phút. Ly tâm 13500
vòng/phút trong 30 phút. Thu tủa, rửa tiếp bằng 400l cồn 70%, ly tâm 13500
vòng/phút trong 5 phút. Hòa tan tủa trong TE và giữ trong -20oC để sử dụng cho các
bước nghiên cứu tiếp theo.
2.3.1.2. Phƣơng pháp PCR [5] với mồi SSR
Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR được chuẩn bị trong tấm PCR
plate 96 giếng. Thành phần, hàm lượng của các chất trong mỗi phản ứng như trong
bảng 4.
Bảng 4. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR
TT
Thành phần
Thể tích (l)
1
H2O cất khử trùng
8.95
2
Buffer 10X
1,5
3
MgCl2 (50mM)
0,45
28
TT
Thành phần
Thể tích (l)
4
dNTP (1mM)
1,0
5
Taq ADN polymeraza (5U)
0,1
6
Mồi xuôi (5M)
0,5
7
Mồi ngược (5M)
0,5
8
ADN (35ng/ l)
2,0
Tổng thể tích:
15
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt
chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 5. Điều kiện của phản ứng PCR
Bƣớc
Nhiệt độ (oC)
Thời gian
Số chu kỳ
1
94
5 phút
1
94
30 giây
55*
30 giây
72
45 giây
72
5 phút
2
3
35
1
10
∞
4
1
(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể
2.3.1.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%
Các bước tiến hành
0.8g agarose hòa vào 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml
0,5M EDTA, pH = 8,0). Đun nóng đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất. Để
nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều.
Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí.
Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông. Rút lược, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE
29
ngập mặt gel. Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ
5l Xylen cyanol /15l mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng để điện di phụ thuộc
vào kích thước của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp. Soi
gel trên máy soi cực tím, đo ̣c và ghi nhâ ̣n kế t quả .
2.3.1.4. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide
Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính
Lau kỹ bề mặt hai tấm kính rồi lắp ghép lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma
0,4mm. Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml
acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào cốc đong. Thêm 300l 10% APS
(ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine),
trộn đều. Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí. Cài
lược vào giữa hai tấm kính rồi dùng kẹp cố định lược. Để gel polyme hóa trong 1 2 giờ.
Sau khi tháo lược, thực hiện lắp ráp bộ điện di, cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng
đệm trên và dưới. Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện là 50 - 60A,
công suất 92 - 100W. Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi trộn với
4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol;
0,05% xylene cyanol), làm lạnh nhanh trong 5 phút. 5l sản phẩm PCR được tra
vào các giếng, các mẫu chạy với ladder 50 bp. Tiến hành điện di với công suất 60W
và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước từng mồi sử dụng.
Phƣơng pháp nhuộm bạc
Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành cố định gel. Đặt tấm
kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản
ứng (glacial acetic 10%), để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch.
Rửa gel bằng nước cất rồi cho vào dung dịch nhuộm (1g bạc nitrat (AgNO3) trong 1
lít nước cất, bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37%.), lắc nhẹ trong 30 phút.
Gel sau đó được lấy ra rửa sạch bằng nước cất rồi đưa vào dung dịch hiện (Hòa tan
30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nước cất) lắc nhẹ đến khi băng xuất hiện.
Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng trong 3 - 6 phút rửa lạivbằng nước
cất, để khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.
30
Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide không biến tính
Lau kỹ 2 tấm kính sau đó đặt tấm kính ngắn lên trên tấm kính dài sao cho
không bị hở và dùng kẹp kẹp chặt hai tấm kính với nhau. Chuẩn bị dung dịch 6%
acrylamide, thêm các thành phần 50l TEMED và 250l APS 20%, 2,5ml TBE
10X, 7,5ml 40% acrylamide, 39,44 ml H2O, khuấy đều. Đổ từ một góc cho đến khi
gel đầy tấm kính ngắn, cài lược sao cho để răng lược hướng vào trong. Sau 15 phút
gel đông lại, lắp vào bể điện di sao cho không để lại bọt khí dưới tấm kính, thêm
đệm TBE 0,5x ngập mặt gel khoảng 0,5cm. Rút lược ra và tra khoảng 7l mẫu cho
mỗi giếng. các mẫu chạy với marker chuẩn 25bp. Điện di từ 1,5 – 5h ở 100V tùy
từng kích thước cặp mồi PCR và tùy từng nồng độ gel.
Sau khi điện di xong, tháo kính, lấy gel ra cho vào một hộp kín có chứa TBE
0,5X. Cho dung dịch nhuộm Syber Safe ngâm trong 30 phút. Sau đó chụp ảnh bằng
máy soi UV.
2.3.2. Phƣơng pháp lai nhân tạo
Phương pháp này được sử dụng trong trở lại, qui tụ gen chịu mặn từ
dòng/giống cho gen vào giống lúa ưu việt.
Cặp lai được lựa chọn là dòng /giống cho gen chịu mặn (donor) mang gen
kháng và có đặc tính kháng cao, dòng hoặc giống nhận gen là những dòng/giống có
các đặc điểm ưu việt như chất lượng gạo ngon, năng suất cao, các đặc điểm nông
sinh học đáp ứng nhu cầu sản xuất. Khi gieo hạt phải tính toán thời gian sinh trưởng
của các dòng/giống cho và nhận gen sao cho thời gian ra hoa phải trùng nhau. Tiến
hành theo những bước sau:
Gieo hạt cây bố mẹ, chăm sóc cây đến khi ra hoa. Chọn những hoa phát triển
tốt, có khả năng cho hạt bình thường. Tiến hành khử đực cây mẹ khi lúa bắt đầu trổ
bông. Khử đực phải tiến hành khi vách bao phấn chưa mở, nếu khử quá sớm sẽ gây
tổn thương hoa, nếu khử quá muộn hạt đã được thụ phấn. Khi khử đực, cắt vát vỏ
phần nửa trên của hoa, chú ý không cắt vào vòi nhị cái, sau đó dùng panh nhỏ hoặc
máy thổi để loại bỏ hết nhị đực trong hạt lúa.
Sau khi khử đực xong tiến hành cách ly các hoa để tránh giao phấn từ những
cây khác trong quần thể bằng cách bao giấy bóng mờ hay những bao nilon để tránh
31
mưa, vừa tạo cho cây và hoa quang hợp được. Sau khi khử đực 1-2 ngày có thể cho
thụ phấn. Chuẩn bị phấn của cây bố để thụ phấn cho cây mẹ, cần phải chuẩn bị
luợng phấn đủ để thụ phấn cho hoa của những cây mẹ đã khử đực.
Thông thường, tiến hành khử đực chiều hôm trước và cho thụ phấn vào 1012 giờ ngày hôm sau vì đó là thời gian vòi nhụy dễ dàng tiếp nhận và hạt phấn dễ
nẩy mầm ở trên đầu nhụy. Cũng có thể để cây bố và mẹ cạnh nhau hay có thể rũ
phấn cây bố vào cây mẹ hoặc dùng panh nhỏ gắp bao phấn đặt lên vòi nhụy. Khi thụ
phấn nên dùng những hạt phấn ở trên những cây bố khoẻ, hoa tươi mới. Sau thụ
phấn, tiến hành chăm sóc cây và các biện pháp chống côn trùng phá hoại hạt lai.
Sau 25- 30 ngày có thể thu hạt lai.
Các hạt lai F1 được trồng đến khi được 20 ngày tuổi thì tiến hành tách chiết
ADN, kiểm tra sự có mặt của gen chịu mặn bằng chỉ thị phân tử. Chọn lọc các cá
thể dị hợp tử mang gen chịu mặn để lai trở lại với giống AS996 (làm bố) tạo quần
thể BC1F1. Các cá thể BC1F1 được trồng, tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của
gen chịu ngập và chọn lọc nền gen của cây mẹ bằng chỉ thị phân tử. Chọn những cá
thể mang gen chịu mặn và có nền di truyền lớn nhất của giống để lai trở lại với
dòng nhận gen tạo BC2F1.
Tiếp tục các công việc như từ thế hệ BC1F1 đến thế hệ BC3F1 có thể lai thêm
1 thế hệ nữa hoặc cho tự thụ để chọn cá thể đồng hợp tử mang gen kháng, chọn
được dòng mang gen chịu mặn và mang phần trăm lớn nhất nền gen của cây mẹ.
2.3.3. Quy trình MABC (Marker Assisted Backcrossing) trong chọn tạo giống
lúa chịu mặn
Phân tích đa hình di truyền giữa hai giống bố mẹ nhận gen và cho Locut gen
Saltol bằng chỉ thị phân tử SSR. Xác định các cặp mồi đa hình phục vụ phân tích di
truyền, chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly BC.
Lai tạo hạt F1 quần thể chọn giống: Dòng mẹ đã được lựa chọn là cây nhận
AS996 (giống địa phương phổ biến) sẽ được lai tạo với dòng cho Locut gen Saltol,
dòng FL478.
32
Tạo cây BC1F1, sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể mang gen
đích Saltol và cây tái tổ hợp mang nhiều nền gen của cây AS996 trong quần thể
BC1F1.
Cây mang nhiều nền gen nhận sẽ được lai trở lại với dòng nhận gen để tạo
quần thể BC2F1.
Lặp lại bước chọn lọc các thể bằng chỉ thị phân tử, chọn dòng mang gen đích
và mang nhiều nền gen cây nhận.
Đánh giá sơ bộ tính chống chịu mặn của dòng chọn lọc
2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá mặn nhân tạo
Phương pháp thanh lọc mặn nhân tạo trong phòng thí nghiệm theo tiêu chuẩn
của IRRI. [18]
Hoá chất
Muối NaCl
33
Dung dịch dinh dưỡng Yoshida
Bảng 6. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida
(Yoshida và ctv, 1976)
Nguyên tố
Hoá chất
Lƣợng cần
(g/2L dd mẹ)
Đa lượng
N
P
Ammonium nitrate (NH4NO3)
Sodium phosphate, monosasic monohydrate
(NaH2PO4.H2O)
365,6
142,4
K
Potassium sulfate (K2SO4)
285,6
Ca
Calcium sulfate, dihydrate (CaCl2.2 H2O)
469,4
Mg
Magensium sulfate, 7- hydrate
(MgSO4.7H2O)
1.296,0
Hoà tan làn lượt từng nhóm chất với 2L nước
Vi lượng
cất, sau đó thêm 200 ml H2SO4 cuối cùng lên
thể tích đầy đủ.
Mn
Mo
Mangannuos chloride, 4-hydrate
(MnCl2.4H2O)
Ammonium molybdate, 4-hydrate
[(NH4)6MoO24.4H2O]
6,000
0,296
Zn
Zinc sulfate, 7-hydrate (ZnSO4.7 H2O)
0,140
B
Boric acid (H3BO3)
3,736
Cu
Cupric sulfate, 5-hydrate (CuSO4.5H2O)
0,124
Fe
Ferric chloride, 6-hydrate (FeCl3.6H2O)
30,800
C
Citric acid, monohydrate (C6H8O7.H2O)
47,600
34
Phƣơng pháp đánh giá mặn (theo IRRI) [18]
Các dòng sử dụng cho quá trình thanh lọc
Vật liệu chính gồm chậu nhựa có dạng hình chữ nhật, kích thước khoảng
14x30x35cm, lưới chống muỗi, tấm xốp dầy khoảng 1,2 - 2,5cm, muối NaCl, dung
dịch Yoshida.
Tấm xốp nổi được cắt kích thước sao cho lọt vừa khít vào bên trong của chậu
nhựa. Cắt những rãnh thẳng sao cho chứa được 20 hạt lúa nảy mầm. Mặt dưới của
tấm xốp phủ bằng lưới muỗi sao cho hạt lúa không bị lọt xuống đáy chậu nhựa.
Hạt lúa vô trùng, được nảy mầm và đặt vào trong rãnh chứa của tấm xốp.
Trong 13 ngày đầu mạ được nuôi trong môi trường dinh dưỡng bình thường. Từ
ngày thứ 14 mạ được nuôi trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung muối và bắt đầu
theo dõi tính chịu mặn của các dòng nghiên cứu, 5 ngày thay môi trường dinh
dưỡng 1 lần. pH của dung dịch luôn được duy trì ở mức 5. Việc điều chỉnh pH được
thực hiện mỗi ngày. Kết thúc thử mặn sau khi các dòng nhiễm (chuẩn nhiễm) đạt
đến điểm 7 -9.
Bảng 7. Thang điểm Standard Evaluating Score (IRRI, 1997)
Điểm
Quan sát
Mức chống chịu
1
Tăng trưởng bình thường, không lá nào bị héo
vàng
Kháng cao
3
Cây sinh trưởng gần như bình thường, có một vài
lá hoặc dầu lá hơi trắng và bị cuộn lại.
Kháng
5
Cây chậm phát triển. Hầu hết lá cuộn lại, rất ít lá
phát triển dài ra được
Kháng trung bình
7
Cây ngừng sinh trưởng, một số cây chết
Nhiễm
9
Hầu hết cây bị chết hoặc đang chết
Nhiễm cao
Tính tỉ lệ % cây sống vào ngày thứ 10 sau thử mặn.
Tiến hành đánh giá vào ngày thứ 7- 8 sau khi cho cây vào môi trường mặn
theo bảng 2.3.
35
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu được ghi nhận trong chương trình, IRRISTAT, Excel và xử lý trong
chương trình GGT2.0 (Van Berloo, 2008)[41] như sau: Ghi nhận dữ liệu của từng
chỉ thị SSR đối với các alen đồng hợp tử giống nhận nhận gen là “A”, đồng hợp tử
giống cho gen là “B” và dị hợp tử là “H”, số % alen của cây nhận gen là “R”.
(Giống
nhận gen x giống cho gen) F1 x Giống nhận gen
BC1F1 (700 cá thể)
Sàng lọc gen kháng
Chỉ thị liên kết với gen kháng
BC1F1 mang gen kháng (150 – 350 cá thể)
Sàng lọc tái tổ hợp
Chỉ thị nắm về hai phía gen kháng
BC1F1 tái tổ hợp (15 – 25 cá thể)
Sàng lọc nền di truyền giống nhận gen
Chỉ thị nằm trên 11 NST còn lại
Cá thể BC1F1 tốt nhất (1-3 cá thể) x Giống nhận gen
BC2F1 (100-200 cá thể)
Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và
nền di truyền giống nhận gen
Chỉ thị liên kết chặt, nằm về hai phía
gen kháng và trên 11 NST khác
Cá thể BC2F1 tốt nhất (1-3 cá thể) x Giống nhận gen
BC3F1 (100-200 cá thể)
Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và
nền di truyền giống nhận gen
Khẳng định kết quả bằng chỉ thị liên kết chặt,
nằm hai phía gen kháng và trên 11 NST khác
BC3F2 (400 cá thể)
Cá thể BC3F1 tốt nhất
Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và
nền di truyền giống nhận gen
Các dòng mang gen chịu mặn có nền
di truyền của giống nhận gen
Hình 3. Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết gen
kết hợp lai trở lại (MABC)
36
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết và tinh sạch ADN tổ ng số
Để tiế n hành kiể m tra các cây lai của vu ̣ trước chúng tôi tiế n hành thu mẫu lá
lúa khi cây lúa cấy được
20 ngày tuổi về tách chiết ADN. Đây là bước rấ t quan
trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là
điều kiện tốt cho các bước nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều phương pháp tách chiết
và tinh sạch ADN. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp tách chiết
ADN bằng CTAB. Lá non 3 tuần sau khi cấy của những giống nghiên cứu được thu
để tách chiết ADN. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN được kiểm tra bằng điện di
trên gel agarose 0,8%. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết
quả trên máy soi cực tím. Kết quả tách chiết ADN được minh hoạ ở hình 3.1.
1
2 3
4 5
6 7
32 33 34 35 36 37 38
8 9 10 11 12 13 14 15
39 40 41 42 43 44 45 46
16 17 18 19 20 21 22 23
47 48 49 50 51 52 53 54
24 25 26 27 28 29 30 31
55 56 57 58 59 60 61
Hình 4. Kết quả điện di kiểm tra ADN của các giống trên gel agarose. Giếng
1, 33: ADN chuẩn nồng độ 100ng/l. Giếng 2-31; 34-61: ADN của các cá thể
trong quần thể nghiên cứu.
Trên hình 3.1 cho thấy, kết quả tách chiết tinh sạch ADN của các cây trong
quần thể nghiên cứu có đủ độ tinh sạch và nồng độ trong khoảng từ 100 ng/l để có
thể tiến hành thí nghiệm. Các cá thể ở các thế hệ tiếp theo cũng được tách chiết
ADN tương tự như vậy để phục vụ cho bước tiếp theo trong thí nghiệm phân tích.
37
3.2. Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ
Đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác nhau
của các đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp
mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình ADN giữa các giống cho gen và nhận gen với chỉ
thị liên kết chặt là điều kiện tiên quyết để có thể sử dụng chỉ thị phân tử nhằm phát
hiện sự có mặt của gen kháng trong các cá thể con lai.
Để lựa chọn gen đích (Saltol) chúng tôi tiến hành khảo sát một nhóm chỉ thị
nằm ở vị trí của gen và về hai phía của gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1. Vị trí xác
định của các chỉ thị trên nhiễm sắc thể số 1 được thể hiện trên hình.
Hình 5. Các chỉ thị liên kết gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1(IRRI, 2012) [24]
Giống FL478 có mang gen chịu mặn Saltol. Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị
có thể sử dụng để phát hiện gen chịu mặn trong các cá thể con lai chúng tôi tiến
hành phản ứng PCR với ADN của các giống lúa FL478 và AS996. Tổng số 500 chỉ
thị SSR trên 12 NST của lúa đã được sàng lọc để xác định các chỉ thị cho đa hình
giữa các cây bố mẹ cho và nhận gen kháng. Trong số đó, có 52 chỉ thị nằm ở vùng
gen Saltol đã được phân tích. Kết quả có 63 chỉ thị cho băng đa hình giữa giống
38
FL478 và AS996 (phụ lục 1). Kết quả này cho thấy tần số cho đa hình của các chỉ
thị SSR đã phân tích với 2 giống AS996/FL478 là khá thấp (12,6%). Tất cả các chỉ
thị này đã được sử dụng để phân tích sàng lọc các cá thể con lai ở những thế hệ
BC1F1, BC2F1 và BC3F1.
1
4
8
12
16
17
20
24
28
32
34
38
41
Hình 6. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 6%
Thứ tự giếng theo chỉ thị: 1.Q5; 2.Q5; 3.OM5472; 4.FL478; 5.IR64SUB1;
6.AS996; 7.KDDB; 8.BT
Chỉ thị: 1-8 SO7053; 9-16 G11; 17-24 AP3206; 25-32 S12055; 34-41 RM228;
M: 42 25bp ladder
Hình 6 cho thấy, hai giống FL478 và AS996 (giếng thứ tư và thứ sáu ở mỗi
phần gel đối với từng chỉ thị) cho đa hình với các chỉ thị SO7053, G11, AP3206,
S12055.
1
2 3
4 5 6
7 1
2 3
4 5 6 7
1
2 3
4 5 6 7
1
2 3
4 5 6
7 12 34 5 6 7
Hình 7. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 4.5%
Thứ tự giếng theo chỉ thị:1.Q5; 2.Q5; 3.OM5472; 4. IR64SUB1; 5. FL478;
6.KDDB; 7.AS996; Chỉ thị: RM18; RM118; RM152; RM223; RM284
Hình 3.4 đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide cho thấy
hai giống FL478 và AS996 cho đa hình với các chỉ thị RM18 và RM152.
39
Hình 8. Bản đồ di truyền các chỉ thị SSR được sử dụng cho phân tích các cá thể
quần thể AS996/FL478
40
3.3. Phân tích các cá thể BC bằng phƣơng pháp MABC
3.3.1. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC1F1 (AS996/FL478 x
AS996)
Trên cơ sở bản đồ vùng QTL Saltol, những chỉ thị tốt nhất trong vùng QTL
Saltol là AP3206 và RM3412, chỉ thị hữu ích nhất là chỉ thị nằm rải rác 2 phía của
Saltol là RM10694 và RM493, RM10793, trong khi các chỉ thị nằm gần đó có thể
sử dụng cho phép chọn lọc âm tính là RM490 nằm phía trên Saltol và RM7075 ở
phía dưới, các chỉ thị Microsatellite không liên kết với Saltol bao phủ cả NST này
cho đa hình giữa 2 giống cho nhận gen cũng có thể được sử dụng cho sàng lọc các
cá thể tái tổ hợp di truyền và cho chọn lọc nền gen thể nhận. Có 42 chỉ thị SSR đã
được phân tích cho sàng lọc thế hệ BC1F1. Việc sàng lọc gen đích đã tiến hành nhờ
phân tích các cá thể với 3 chỉ thị AP3206, RM3412 và RM10793. Sau đó, các chỉ
thị nằm 2 phía gần vùng Saltol đã được phân tích trong sàng lọc xác định các cây tái
tổ hợp. Tổng số 500 cá thể đã được phân tích. Đã xác định được 245 cây mang gen
đích Saltol.
1 2
25
AS FL
Hình 9. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị AP3206.
Làn gel 1: 25bp ladder, 2-25 và 26-48: các cá thể BC1F1, 49:AS996, 50: FL478
Sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị AP3206 cho thấy có 26/46 cá thể trên
gel là dị hợp tử với locut AP3206. Các cá thể mang băng dị hợp tử sẽ được ghi nhận
lại để phân tích. (Hình 3.6)
12
25
50
Hình 10. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM10793. Làn
gel 25, 50: 25bp ladder, 1-24 và 26-47: các cá thể BC1F1, 48:AS996, 49: FL478
41
Hình 10 cho thấy kết quả sàng lọc với chỉ thị RM10793, hầu hết các cá thể
BC1F1trên gel là dị hợp tử với locut RM10793. Các cá thể mang băng dị hợp tử sẽ
được ghi nhận lại để phân tích.
Sau đó phân tích xác định cây tái tổ hợp sử dụng các chỉ thị RM10694,
RM562, RM7075 nằm về 2 phía của gen đích trên nhiễm sắc thể số 1.
Sau khi xác định các cá thể tái tổ hợp có chứa gen đích, tiếp tục bước phân
tích các cây đã chọn ra bằng các chỉ thị nằm rải rác trên 12 nhiễm sắc thể của lúa đã
được sử dụng để phân tích xác định cây mang nhiều nền gen cây nhận.
1
25
51
Hình 11. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM310. Làn gel
1, 25, 51: 25bp ladder, 2-25 và 26-48: cá thể BC1F1, 49:AS996, 50: FL478
1 2
25
A FL
Hình 12. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM5639. Làn gel
1, 26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: Các cá thể BC1F1, 49:AS996, 50:FL478
Hình 11, 12 cho thấy kết quả sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị RM310,
RM5639 cho phép lựa chọn các cá thể trên gel mang băng của cây nhận gel AS996
để chọn lựa tối đa nền gen cây nhận gen. Số liệu ghi nhận được phân tích trên trong
Excel. Hai cây mang nhiều nền gen cây nhận gồm cá thể P284 và P307 mang tỉ lệ
nền gen cây nhận tương ứng là 89.06% và 86.36% (bảng 3.1). Trong trường hợp chỉ
sử dụng các phương pháp chọn giống truyền thống, tỉ lệ nền gen của cây nhận gen
trong thế hệ này chỉ đạt được 75%, thấp hơn trong nghiên cứu này từ 16-19%.
42
Bảng 8. Tỉ lệ nền gen cây nhận ở 12 cây tái tổ hợp ở thế hệ BC1F1
Cây
số
5
49
28
38
81
84
05
07
11
01
26
11
A
55.26 51.43 60.53 44.74 56.25 78.13 66.67 75.76 63.64 73.68 66.67 63.64
H
34.38 37.93 36.36 34.38 15.63 21.88 33.33 21.21 36.36 80.00 33.33 36.36
R
72.45 70.39 78.71 61.92 64.06 89.06 83.33 86.36 81.82 73.68 83.33 81.82
Số liệu kiểu gen của các cá thể có chứa tái tổ hợp tại vị trí gen Saltol được
phân tích trên phần mềm GGT2.0. Kết quả thể hiện trên hình 3.10. Hình vẽ thể hiện
bản đồ vị trí các chỉ thị SSR được sử dụng để sàng lọc NST số 1, 3, 4 và 10, các kí
hiệu A: là kiểu gen cây mẹ, B: là kiểu gen cây bố; H: là dị hợp tử và K: là số liệu
nghi ngờ. Nhìn vào hình vẽ có thể thấy rõ các locut phân tích với các kiểu gen đặc
trưng cho giống cho hoặc nhận gen kháng.
RM10694 1.0
RM5639 8.1
B
B
AP3206e 2.0
0
Legend
.
A
G11A 0.0
Legend
.
A
0
K
K
RM10711A 3.0
H
H
SO3065 12.8
SO3068 14.8
SO3072 15.4
RM3412A 4.0
25
RM493 5.0
RM3867 31.5
Legend
.
A
0
RM518 2.0
Group 3 [chrom3]
Legend
.
A
cM
0
Group 1 [chrom1]
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
cM
RM6329 28.7
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
RM10793 6.0
RM5626 24.7
B
RM171 2.6
H
RM 25022 3.6
B
K
R10M10 4.9
H
R4M13 7.9
K
R4M17 11.5
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
R4M30 17.9
cM
cM
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
R10M17 8.6
Group 10 [chrom10]
Group 4 [chrom4]
Hình 13: Bản đồ của một số cây BC1F1 (AS996/FL478/AS996) trên NST1, 3, 4 và
10.
43
3.3.2. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC2F1 (AS996/FL478/AS996/
AS996)
Hai cá thể P284 và P307 của thế hệ BC1F1 mang tỉ lệ nền gen cây nhận
tương ứng là 89.06% và 86.36%. Hai cây này đã được sử dụng để phát triển quần
thể thế hệ BC2F1.
500 cá thể của quần thể BC2F1 thuộc phép lai (AS996/FL478/AS996/
AS996) đã được trồng và phân tích ADN. Tương tự như các bước phân tích trên các
cá thể thuộc thế hệ BC1F1, các bước phân tích sự có mặt của gen đích, phân tích
xác định cây tái tổ hợp rồi phân tích toàn bộ nền gen sử dụng các chỉ thị nằm trên
12 nhiễm sắc thể đã được tiến hành. Bước phân tích gen đích sử dụng chỉ thị
AP3206, RM3412, RM10793, RM10711 (Hình 3.11; 3.12). Các cá thể có mang hai
băng đối với cả bốn chỉ thị này sẽ được chọn lựa cho bước phân tích tái tổ hợp sử
dụng các chỉ thị RM10694, RM562, RM7075 nằm về hai phía của vùng Saltol trên
nhiễm sắc thể số 1. Trong tổng số 250 cây dị hợp tử đã xác định được 26 cây tái tổ
hợp trên vùng gen Saltol.
1
FL AS
10
20
30
40
50
59
Hình 14. Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ
thị RM3412. Làn gel từ 1 đến 57: các cá thể BC2F1; 58: FL478, 59: AS996
Hình 15. Sàng lọc cá thể BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị
RM10793 (bên trái), và RM10711 (bên phải).
44
Bước phân tích xác định cây mang nhiều nền gen cây nhận đã được tiến hành
với tổng số 48 chỉ thị SSR nằm rải rác trên 12 nhiễm sắc thể. Kết quả cho thấy các
cây P307-322, P284-112 and P307-305 là những cây tốt nhất, mang từ 93.18% đến
94.03% nền gen cây nhận AS996. Ba cây này đã được sử dụng trong phép lai trở lại
để tạo thế hệ BC3F1 tiếp theo. Mỗi cây sử dụng một nửa số bông cho lai trở lại và
một nửa tự thụ tạo thế hệ BC2F2. Trong trường hợp sử dụng chọn giống truyền
thống, tỉ lệ nền gen cây nhận đạt cao nhất là 87.5% trong thế hệ BC2F1, nhưng ở
nghiên cứu này, tỉ lệ nền gen cây nhận thu được cao hơn từ 5.7- 6.5% so với chọn
giống truyền thống.
3.3.3. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC3F1 (AS996/FL478/AS996/
AS996/AS996 )
Từ kết quả phân tích cá thể thế hệ BC2F1, 3 cá thể mang tỉ lệ nền gen nhận
cao nhất đã được lai trở lại tạo lập quần thể BC3F1 của tổ hợp AS996 mang Saltol.
A
B
C
D
E
Hình 16. Sàng lọc các thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996)
sử dụng chỉ thị RM3412 (A), RM10711 (B), RM10793 (C), AP3206 (D) và
RM10694 (E). Làn gel 1: AS996, Làn gel 2: FL478.
Tổng số 371 cá thể đã được phân tích với các chỉ thị định vị trên vùng gel
Saltol. Phát hiện 94 cá thể mang gen đích được phân tích tái tổ hợp. Sàng lọc các
45
thể BC3F1(AS996/FL478/AS996/AS996/AS996) sử dụng chỉ thị RM3412,
RM10711, RM10793, AP3206, và RM10694 trên hình 3.13. Phân tích ADN các cá
thể tái tổ hợp mang gen đích với 63 chỉ thị phân tử SSR. Số liệu về kiểu gen của 14
cá thể được đưa vào phân tích bằng phần mền GGT2.0, đã xác định cá thể P284112-291 của quần thể BC3F1 là tốt nhất trong 5 cá thể tái tổ hợp P284-112-291,
P307-305- 21, P284-112-195, P284-112-198, P284-112-213 mang nhiều nền di
truyền cây nhận gen, cả 5 cây này đã được chọn cho quá trình chọn giống SALTOLAS996 ở các thế hệ sau.
Hình 17 Bản đồ của cây BC3F1 - P284-112-291 phân tích bằng phần
mềm GGT2.0
Sơ đồ nền gen của cá thể P284-112-291 thể hiện trên hình 3.14.: Tại các
locut nằm ở vị trí của gen Saltol, cây P284-112-291 có băng màu xanh nhạt, thể
hiện là mang locut dị hợp tử. Đối với các locut còn lại trên các NST, cây P284-112291 đều có các locut màu đỏ, thể hiện băng của locut cây nhận gen hay là nền gen
của giống AS996. Như vậy, với 63 chỉ thị rải rác trên 12 nhiễm sắc thể của lúa, đã
xác định được cây mang gen đích và mang tới 100% nền gen cây nhận gen. Ngoài
46
ra các dòng mang nền gen của giống nhận gen cao như P307-305- 21, P284-112195, P284-112-198, P284-112-213 cũng được giữ lại để chọn dòng và phát triển
trong chọn giống. Những dòng này đã được thu hạt, đánh giá tính chống chịu mặn
và một số chỉ tiêu nông sinh học và các yếu tố cấu thành năng suất để chọn ra
những dòng triển vọng năng suất cao và có tính chịu mặn tốt.
3.3.4. Kết quả đánh giá tính chịu mặn các dòng chọn lọc
Thí nghiệm đánh giá tính chịu mặn ở thế hệ BC3F2, BC3F3 đã được tiến
hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp theo như đã mô tả ở phần “2.3.4. Phương
pháp đánh giá mặn nhân tạo”. Các dòng được đánh giá mặn tại nồng độ muối bằng
EC=12dSm, tương đương mức nhiễm mặn NaCl = 60/00. Các dòng BC3F2 tham gia
thí nghiệm đều có mức độ kháng tương đương giống FL478 mang vùng gen Saltol.
Các dòng này được đưa ra ruộng gieo trồng để theo dõi đánh giá và thu hạt cho lần
thí nghiệm tiếp theo.
Ở thế hệ BC3F3, các dòng chọn lọc được đưa vào đánh giá tính chịu mặn.
Hình 18 Các dòng thí nghiệm BC3F3 trước khi thử mặn
47
Hình 18 là hình ảnh các dòng lúa chọn lọc BC3F3có mang gen kháng được
gieo trong khay và nuôi bằng môi trường dinh dưỡng Yoshida trước khi được thanh
lọc mặn. Sau khi bổ sung muối vào môi trường, có thể ghi nhận triệu chứng về mặt
hình thái của các dòng/giống. Đối với FL478, sau khi bổ sung muối thì dấu hiệu đầu
tiên là hiện tượng cháy đầu lá nhưng mức độ ít nghiêm trọng hơn so với giống
IR29, và sau đó là hiện tượng quăn đầu lá và 1-2 lá già nhất ở một số cây có hiện
tượng chết. Trong quá trình thanh lọc, các cây chịu mặn phát triển bình thường.
Những cây nhiễm mặn bị héo quăn lá và phát triển chậm (giống IR29).
Hình 19. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm
(NaCl=60/00 ). Trên mỗi khay thử: hàng 1: FL478; hang 10: IR29;
Các hàng 2-9: Các dòng BC3F3 mang vùng gen Saltol
48
Hình 20: Kết thúc thí nghiệm thử mặn các dòng BC3F3 ở nồng độ muối
EC=12dSm (NaCl=60/00). Trên mỗi khay thử: hàng 1: AS996; hàng 2: FL478; hàng
10: IR29; Các hàng 3-9: Các dòng BC3F3 mang vùng gen Saltol
Ở hình 3.17, sau 14 ngày thanh lọc mặn, có sự khác biệt rõ ràng giữa giống
bố mẹ: giống gốc AS996 nhiễm mặn bị héo quắt, cây chết và giống FL478 vẫn sinh
trưởng tốt. Giống chuẩn nhiễm IR29 chết hết. Các dòng chọn ra từ dòng B291 cho
phản ứng chống chịu tốt với mặn. Kết quả đánh giá ở bảng 2 cho thấy, mức chống
chịu mặn của các dòng cho thấy dòng BC3F3 có mức chống chịu cao tương đương
giống cho gen FL478. Chỉ có dòng B291-1-9 ở mức nhiễm vừa. Kết quả đánh giá
được ghi nhận lại ở bảng 3.2
49
Bảng 9. Kết quả đánh giá mức chịu mặn của các dòng BC3F3
(AS996xFL478) theo tiêu chuẩn IRRI, 1997
STT
Dòng
Điểm
Mức chống chịu
1
B291-1-1
3
KC
2
B291-1-2
3
KC
3
B291-1-3
3
KC
4
B291-1-4
3
KC
5
B291-1-5
3
KC
6
B291-1-6
3
KC
7
B291-1-7
3
KC
8
B291-1-8
3
KC
9
B291-1-9
5
NV
10
B291-1-10
3
KC
11
B291-1-11
3
KV
12
B291-1-12
3
KC
13
FL478 (ĐC kháng)
3
KC
14
AS996
7
N
15
IR29 (ĐC nhiễm)
7
N
Kết quả đánh giá mức chống chịu mặn của các dòng cho thấy dòng BC3F3
có mức chống chịu cao tương đương giống cho gen FL478. Chỉ có dòng B291-1-9
ở mức nhiễm vừa.
3.3.5. Đánh giá chỉ tiêu nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các
dòng chịu mặn
Các dòng lúa chọn lọc được gieo trồng trên ruộng để đánh giá các đặc tính
nông sinh học: thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số bchiều dài lá đòng, chiều dài
50
cổ bông và các yếu tố cấu thành năng suất như số khóm/bông, số hạt/bông, tỉ lệ số
hạt chắc/bông; khối lượng 1000 hạt, năng suất.
Các số liệu được ghi nhận lại và tiến hành theo phương pháp hệ thống đánh
giá chuẩn của IRRI. Số liệu được phân tích và xử lý bằng chương trình tính Excel
và IRRISTART 5.0.
Bảng 10. Đặc tính nông sinh học của các dòng AS996-Saltol
(Vụ Xuân 2013) tại Hà nội
Chiều
TT
Tên dòng
Chiều dài
TGST
Chiều cao
dài lá
(ngày)
cây(cm)
đòng
(cm)
88,2±4,7
34,4±2,7
3,6 ± 1,4
23,6±0,9
23,2±2,7
7,2±1,2
20,4±0,8
cổ
bông(cm)
Chiều dài
bông(cm)
1
B291-1
125
2
B291-2
125
3
B291-13
125
81,0±3,0
25,1±2,6
7,0±1,4
21,9±1,4
4
B291-2-5
125
86,0±1,6
22,5±3,5
5,3±0,6
19,1±0,6
5
B291-1-10
125
99,6±2
26,1±2,5
4,7±0,4
25,8±1,4
6
B291-1-3
125
98,9±1,7
28,5±4,8
7,7±2,8
24,1±1,5
7
B291-2-2
125
104±3,1
31,2±2,6
6,2±1,6
24,1±1,3
8
B291-2-8
125
89,3±2,2
22±3,6
8,0±1,3
19,8±0,8
9
B291-2-7
125
96,3±2,3
27,1±4,8
5,8±1,9
22,5±0,6
10
B291-1-1
128
87,3±3,1
23,1±3,7
5,2±1,4
23,6±1,0
11
B291-2-15
125
89,8±5,0
22,7±3,2
3,6±0,9
20,3±1,6
12
B291-2-1
125
87,8±3,3
25,8±3,1
6,3±1,8
23,5±1,5
13
B291-2-3
125
85,8±1,7
23,2±3,9
5,5±2,2
20,1±0,9
14
B291-16
125
88,5±1,2
23,3±4,0
4,3±1,1
21,5±1,5
15
B291-1-9
130
92,7±1,5
26,2±2,1
5,2±1,3
23,8±0,9
83,4±3,6
51
16
B291-2-10
125
84,6±0,8
24,4±3,3
5,3±1,3
20,3±0,7
17
B291-14
125
85,4±1,1
26,7±3,3
5,1±1,1
20,8±0,9
18
B291-1-3
125
104,2±1,0
26,0±2,5
4,0±0,8
24,0±1,1
19
AS996
125
91,0±0,8
28,6±0,7
5,9±0,6
22±0,8
20
FL478
132
87,3±2,2
33,1±4,8
3,6±1,1
21±0,7
Bảng 11. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cúa các dòng AS996 –
Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội
TT
Tên dòng
Số
Số hạt/
Tỉ lệ
P1000
NSLT
NSTT
bông/khóm
bông
lép(%)
hạt(g)
tạ/ha
(tạ/ha)
1
B291-1
5,1 ± 0,7
147,2±36,1
3,27
27,03
88,20
53,37
2
B291-2
5,5±0,5
148,7±20,1
19,3
28,30
84,22
61,0
3
B291-13
5,4±0,5
144,8±23,4
25,3
26,60
70,01
58,0
4
B291-2-5
4,8±0,5
154,7±24,9
20,9
27,54
72,93
64,2
5
B291-1-10
5,0±0,7
171,1±34,4
18,16
25,50
64,23
51,13
6
B291-1-3
4,8±0,8
172,2±49,5
3,5
26,80
96,08
65,71
7
B291-2-2
5,8±0,9
155,7±51,5
4,2
24,28
94,09
63,26
8
B291-2-8
5,1±0,8
111,0±26,8
20,9
29,65
65,53
48,17
9
B291-2-7
4,0±0,9
129,2±60,6
1,9
26,13
59,52
43,12
10
B291-1-1
4,6±0,9
144,6±40,2
2,9
28,05
81,75
59,43
11
B291-2-15
4,3±0,5
133,3±20,7
23,2
27,30
53,95
40,21
12
B291-2-1
4,3±0,5
144,2±15,1
14,5
26,98
64,27
47,31
13
B291-2-3
4,5±0,5
160,2±25,4
25,1
29,00
69,61
49,23
14
B291-16
4±0,4
118,2±30,4
8,7
29,10
56,43
42,81
15
B291-1-9
4,1±0,7
154±35,3
15,9
29,98
71,63
66,32
52
16
B291-2-10
4,3±0,5
160,3±29
19,2
28,50
71,29
66,00
17
B291-14
4,4±0,8
110,7±30,4
13,5
28,40
53,99
40,62
18
B291-1-3
4,9±0,8
123,9±21,6
6,4
30,78
78,77
67,20
19
AS996
4,7±0,6
145,2±21,9
23,6
26,60
62,32
51,30
20
FL478
4,6±0,5
140,7±24
9,0
28,63
75,50
60,45
CV%
1,50
LSD0,5
2,22
Kết quả ở bảng 3.4, 3.5 cho thấy thời gian sinh trưởng của các dòng biến
động từ 125 ngày đến 132 ngày trong vụ xuân 2013. Chiều cao cây thay đổi từ 81,0
đến 104 cm. Chiều dài bông thay đổi từ 19,1 đến 25,8 cm. Số bông/khóm thay đổi
từ 4,1 đến 5,8 bông/khóm. Số hạt/bông biến động từ 110,7 đến 193,3 hạt/bông. Tỉ lệ
lép biến động từ 2,5% đến 25,94%. Năng suất thực tế của các giống tham gia thí
nghiệm nói chung là khá, trong khoảng 40,21 đến 67,2 tạ/ha.Trong đó, các dòng có
năng suất cao như B291-1-3, B291-1-9, B291-2-10, B291-2-2, B291-1-3a, B291-25 sẽ được tiếp tục đánh giá tính chịu mặn và phát triển dòng chọn giống ở thế hệ
tiếp theo.
53
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
Sàng lọc đa hình giống cho gen và nhận gen đã được tiến hành trên 500 chỉ
thị SSR, trong đó đã được xác định 63 chỉ thị. Kết quả này cho thấy tỉ lệ đa hinh
ADN của hai giống AS996/FL478 là rất thấp khi sử dụng các chỉ thị phân tử SSR.
Hai cá thể của thế hệ BC1F1 là P284 và P307, có hàm lượng nền gen cây
nhận cao nhất từ 89.06 đến 86.36% tương ứng, cao hơn so với chọn giống MAS và
chọn giống truyền thống 16-19%. Hai cá thể này đã được sử dụng cho việc thiết lập
thế hệ BC2F1.
Trong thế hệ BC2F1, ba các thể có hàm lượng hệ gen giống nhận gen là đến
93,18 đến 94,03 % đã được xác định bằng cách sàng lọc ADN và đã được sử dụng
cho việc thiết lập quần thể BC3F1
Cá thể P284-112-291 tốt nhất của thế hệ BC3F1 đã được sàng lọc mang gần
100% hàm lượng hệ gen cây nhận gen khi khảo sát 63 chỉ thị cho đa hình.
Đánh giá tính chịu mặn nhân tạo thế hệ BC3F2 và BC3F3 cho thấy các dòng
phát triển từ cá thể P284-112-291 có tính chịu mặn tương đương giống cho gen
kháng FL478.
Đánh giá đặc tính nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất cho thấy các
dòng phát triển từ cá thể P284-112-291, có năng suất cao như B291-1-3, B291-1-9,
B291-2-10, B291-2-2, B291-1-3a, B291-2-5 sẽ được tiếp tục đánh giá tính chịu mặn
và phát triển dòng chọn giống ở thế hệ tiếp theo.
Đề nghị
Các dòng có tính chịu mặn cao, chứa locut gen Saltol và có đặc tính nông
sinh học tốt sẽ tiếp tục được nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử, đánh giá mặn nhân
tạo, kết hợp với chọn giống truyền thống để tạo các dòng AS996-Saltol góp phần
vào công tác chọn tạo giống lúa chiụ mặn cho các vùng đồng bằng thường xuyên bi ̣
xâm nhập mặn góp phần tạo giống lúa chịu mặn để ứng phó với biến đổi khí hậu.
54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1.
Đỗ Hữu Ất (2005), “Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tạo giống lúa
chịu mặn cho vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ”, TT Khoa học và Công nghệ Hạt
nhân, 4/2005, Tr. 28-30.
2.
Bộ Tài nguyên Môi trường (2012), Kịch bản Biến đổi khí hậu nước
biển dâng cho Việt Nam.
3.
Tăng Thị Hạnh, Dương Thị Hồng Mai, Trần Văn Luyện, Phạm Văn
Cường, Lê Khả Tường, Phan Thị Nga (2011), “Nghiên cứu khả năng chịu mặn của
một số nguồn gen lúa lưu giữ tại ngân hàng gen cây trồng quốc gia”.
4.
Lê Sâm (2003), Xâm nhập mặn ở đồng bằng Sông Cửu Long, NXB
Nông Nghiệp.
5.
Lê Duy Thành (1999), “Kỹ thuật PCR và ứng dụng của nó trong chọn
giống thực vật”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, Tr. 156-158.
6.
Nguyễn Thị Tâm và cs (2008), “Đánh giá khả năng chịu mặn của các
giống lúa OM4498, VND 95-20, IR64, CR203 ở mức độ mô sẹo bằng phương pháp
nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ.
7.
Lê Thị Thu Trang (2011), “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen
liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam”, Tạp chí Khoa hoc Công nghệ.
Tài liệu tiếng Anh
8.
Awala, S.K., Nanhapo P.I., Sakagami, J., Kanyomeka, L., and Iijima,
M. (2010), “Differential salinity tolerance among Oryza glaberrima, Oryza sativa
and their Interspecies including NERICA”, Plant Prod. Sc. 13 (1), pp. 3-10.
9.
Aslam, M., Qureshi R. H., and Ahmad (1993), “Mechanisms of
salinity tolerance in rice (Oryza sativa L.)”, Department of soil science and
physiology, University of Agriculture, Pakistan.
10.
Bonille P., Dvorak J., Mackill D.J., Deal K. and Gregorio G.(2002),
“RFLP and SSLP mapping of salinity tolerance genes in chromosome 1 of rice
(Oryza sativa L.) using recombinant inbred lines”, Philipp. Agric. Sci, 85, pp. 64–76.
11.
Akbar M, GS Khush, D HilleRisLambers (1985), “Genetics of salt
tolerance”, Rice Genetics, IRRI Philippines, pp. 399-409.
55
12.
Collar BCY, amd DJ Mackill (2008), “Marker-aided selection: an
approach for precision plant breeding in the twenty first century”, Philos. Trans. R.
Soc. Lond.B. Biol.Sci. 363, pp. 557-572.
13.
Dat J, S Vandenabeele, E Vranova, M Van Montagu, D Inze, F Van
Breusegem (2000) “Dual ction of the active oxygen species during plant stress
responses”, Cell Mol Life Sci 57, pp. 779-795.
14.
Bert Collard & David Mackill (1998), “Conserver AND drives
polymorphirm(CDDP): A simple and novel method for generating AND marker in
plant”, Journal plant Biology (27), pp. 558-562.
15.
FAO (Food and Agriculture Organization) (2010), “Report of salt
affected agriculture. Link access”, (http://www.fao.org/ag/agl/agll/spush/, latest
verified 8 October 2011).
16.
FAO (2012), “FAO says rice production outpacing consumption”,
(http://www.fao.org/news/story/en/item/164713/icode/. Accessed on 17 Nov. 2014.)
17.
Glenn Gregorio (2010), “Rice breeding and genetics for salinity and
problem soils tolerance for Asia and Africa”, October 2010- present.
18.
Glenn B. Gregorio, Dharmawansa Senadhira, and Rhulyx D.
Mendoza, “Screening Rice for Salinity Tolerance”, IRRl DISCUSSION PAPER
SERIES No. 22
19.
Gregorio G.B, Senadhira D., Mendoza R.D, NL Manigbas, JP Rosxas,
CQ Guerta (2002), “Progress in breeding for salinity tolerance and associated
abiotic stresses in rice”, Field crio Research. Elsevier
20.
Gregorio GB (1997), “Tagging salinity tolerance gene in rice (Oryza
sativa) using amplified fragment length polymorphism (AFLP)”, PhD dissertation,
University of the Philippines Los Banos
21.
Haque QA, D HilleRisLambers, NM Tepora, QD de la Cruz (2010),
“Inheritance of submergence tolerance in rice”, Euphytica 41, pp. 247-251.
22.
Islam, M.R., Salam, M.A., Hassan L., Collard B.C.Y. singh R.K. and
Gregorio G.B. (2011). “QTL mapping for salinity tolerance at seedling stage in
rice”, Emir.J.Food Agric, 23 (2): pp. 137-146.
56
23.
Jena KK, Mackill DJ (2008), “Molecular markers and their use in
marker-assisted selection in rice”, Crop Sci 48, pp. 1266-1276.
24.
Kim, D. M., Ju, H. G., Kwon, T. R., Oh, C. S., and Ahn, S. N. (2009),
“Mapping QTLs for salt tolerance in an introgression line population between
japonica cultivars in rice”, J. Crop Sci. Biotech. 12, pp. 121–128.
25.
La Hoang Anh, Nguyen Kien Quoc, Hoang Thi Hue and ,La Tuan
Nghia (2014), "Dentification of QTLS Tolerance to salinity in rice (ORYZA
SATIVA L.)”, International Journal of Development Research. Vol. 4, Issue, 10,
pp. 2113-2118.
26.
M. A. Saghai-Maroof, K. M. Soliman, R. A. Jorgensen, and R. W.
Allard (1984), “Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian
inheritance, chromosomal location, and population dynamics,”Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 81, no. 24, pp.
8014–8018.
27.
M.Olson M., Hood L., Cantor C., Botstein D. (1989),
“A common
language for physical mapping of the human genom”, Science 245, pp 1434–1435.
28.
Maas EV, GJ Hoffman. (1977), “Crop
assessment”, ASCE J Irrig and
29.
salt
tolerance
current
Drainage Div 103, pp 115-134.
Mishra B, M Akbar, DV Seshu, D Senadhira (1998), “Genetics of
salinity tolerance and ion uptake in rice”. IRRN 21, pp 38-39.
30.
Mishra, B., M. Akbar and D.V. Sashu (1990), “Genetic studies on salinity
tolerance in rice towards better productivity in salt-affected soils”, Proceedings of the
Rice Research Seminar, Jul. 12-12, IRRI, Los Ba Laguna, pp: 25-25.
31.
Mohan, M., S. Nair, A. Bhagwat, T.G. Krishna, Y. Masohiro, C.R.
Bhatia and T. Sasaki. (1997), “Genome mapping, molecular markers and marker
assisted selection in crop plants”, Mol. Breed., 3, pp 87-103.
32.
Napvi N..I., Bonman J.M., Mackil D..J., Nelson F..J. .and Chattoo
B..B. (1995), “Identification of RAPD markers linded to a major blast resistance
gene in rice”, Mol. Breed. 1, pp 341 – 348.
57
33.
Negrao S., Courtois B., Ahmadi N., Abreu I., Saibo N. and Oliveira
M.M. (2011), “Recent updates on salinity stress in rice: from physiological to
molecular response”, Crit Rev. Plant Sci, 30, pp 329-377.
34.
Nguyen thi Lang, Bui Chi Buu, Ismail A.M (2011), "Enhancing and
stabilizing the productivity of salt - affected areas by incoporating nenes for
tolerance of abiotics stresses in rice", Omonrice 18, pp 41-49.
35.
Niones JM (2004), “Fine mapping of the salinity tolerance gene on
chromosome 1 of rice (Orysa sativa) using near-isogenic lines”, MSc thesis,
University of the Philippines Los Banos.
36.
Ponnamperuma, F. N. (1984), “Role of cultivar tolerance in increasing
rice production on saline lands. Strategies for crop improvement”, John Wiley and
sons, New York, pp 443.
37.
Ranawake, A., & Nakamura, C. (2013), “Assessment Of Salinity
Tolerance In An Inbred Population Of Rice (Oryza Sativa L) Derived From A Japonica
X Indica Cross”, Tropical Agricultural Research and Extension [Online] 15:3
38.
Sarkar P, Bosneaga E, Auer M (2009), “Plant cell walls throughout
evolution: towards a molecular understanding of their design principles”, J Exp
Bot 60, pp 3615–3635.
39.
Shahbaz a & M. Ashrafa (2013), “Improving Salinity Tolerance in
Cereals”, Department of Botany, University of Agriculture, Faisalabad, Pakistan 27.
Published online: 20 Feb 2013. Plant Sciences, pp 237-249.
40.
Thomson MJ., Ocampo M., Egdane J., Rahman M.A., Saiise AG.,
Adorada DL., Raiz E.T. (2010), “Characterizing the Saltol quantitative trait locus
for salinity tolerance in rice”, Rice, 3, pp. 148-160.
41.
Van Berloo R (2008), GGT 2.0: versatile software for visualization
and analysis of genetic data,. J Hered 99, pp 232–236.
42.
Yeo A.R. and Flowers, T.J. (1996), “Salinity resistance in rice and a
pyramyding approach to breeding varieties for saline soils. In: Plant growth,
Drought and salinity”, ED. By NC Tuner and JB Passioura. CSIRO, pp 161-173.
Melbourn, Australia
58
PHỤ LỤC
Danh sách trình tự các chỉ thị cho đa hình giữa giống FL478 và AS996
Tt
Tên mồi
Ch
Mb
1
RM10287
1
5
2
G11A
1
9.3
3
RM10694
1
11
4
AP3206
1
11.2
5
RM3412
1
11.5
6
RM10711
1
11.2
7
RM493
1
12.3
8
RM10793
1
12.5
9
RM562
1
14.6
10
RM7075
1
15.1
11
RM11125
1
20.5
12
RM7643
1
31.1
13
SO1132A
1
32
14
RM3482
1
39.7
15
RM300
2
13.2
16
M13197
2
16.5
17
RM341
2
19.2
18
RM6318
2
24.4
Mồi xuôi
Mồi ngƣợc
GTATTCCTTGCTGCTGCTG
GACTGGAGATGTGAT
ATGG
CGGAAACC
AGCTGGTAGGAAGGCTGA
TGCCAGCAGCTCAGTAG
AAG
AAG
TTTCCCTGGTTTCAAGCTTA
AGTACGGTACCTTGAT
CG
GGTAGAAAGG
GGAGGAGGAGAGGAAG
GCAAGAATTAATCCA
AAG
TGTGAAAGA
TGATGGATCTCTGAGGT
TGCACTAATCTTTCTG
GTAAAGAGC
CCACAGC
GCTTCGATCGATGAGAA
GAATCTCCCATCCTTC
AGTAGAGG
CCTTCC
GTACGTAAACGCGGAAG
CGACGTACGAGATGC
GTGACG
CGATCC
GACTTGCCAACTCCTTCA
TCGTCGAGTAGCTTCC
ATTCG
CTCTCTACC
GGAAAGGAAGAATCAGA
GTACCGTTCCTTTCGT
CACAGAGC
CACTTCC
GCGTTGCAGCGGAATTT
CCCTGCTTCTCTCGTG
GTAGG
CAGTCG
CCAAGAACCCTAGCTCC
TCGACGAGATCCTCCT
CTCTCC
CGTAAACC
AAACCGCCGTCCTCCTAT
CTTGAGCGCACCAAC
TCG
GAAATACC
CAATGACGACGCATGTA
TGCTTGAATGTTTTTC
TGT
GAGGA
GCCGCTAATGTTGTTGTC
CGAAGCCAACGTAGT
AAGC
CCAATCC
GGGCTTAAGGACTTCTG
AGCGATCCACATCATC
CGAACC
AAATCG
AAACCCTCCGGCTCATTC
ACTCGAATCGTATCGG
TTGC
CTTGAGG
CAAGAAACCTCAATCCG
CTCCTCCCGATCCCAA
AGC
TC
AAGTGCCTCGAATTACA
GCTGCTTCTGTCCAGT
59
Kích
thƣớc
To
184
60
250
57
195
60
180
60
215
55
173
60
178
55
124
60
126
55
376
55
212
60
178
55
180
55
173
55
162
55
183
60
200
55
188
55
Tt
Tên mồi
Ch
Mb
19
RM13628
2
25.1
20
RM231
3
2.5
21
RM3297
3
13.4
22
SO3065
3
15
23
SO3068
3
17
24
SO3072
3
19
25
RM7097
3
26.7
26
RM518
4
2
27
RM5639
4
8.1
28
R4M17
4
11.5
29
RM307
4
12.9
30
RM5626
4
31
RM6329
4
32
RM3867
4
33
RM127
4
34
RM437
5
3.8
35
RM122
5
6.3
36
RM249
5
10.7
4.7
8.7
1.5
4.8
Mồi xuôi
Mồi ngƣợc
CATCTCC
GAGACC
TATGCCACGAATGACCC
CTCCATATGCAGCGAC
TAACC
AATCG
CCAGATTATTTCCTGAGG
CACTTGCATAGTTCTG
TC
CATTG
TGCACGTGATCTCTTGTA
GGAGAGGGCCTTGTT
ACCTAGC
CTTGAGG
TTTCGTGCGGGGATATA
GCAAGATAACTCAAA
GAG
ATCAAAAGC
TTGACAAGTTTTGGAAAT
TTGTTGTGCCATTGGA
TGGA
GAAA
TTTCGTGCGGGGATATA
GCAAGATAACTCAAA
GAG
ATCAAAAGC
GGCCATTATGTGCATCTC
GGATCGATCGACATC
TCAGC
AATCTTGG
AAGACACAAGCAAACAG
AAGCTTGCTTGGTTCA
CTCAACC
AGAGAGG
AGGAGGAAGGAAGAAC
CTGAGTGCGTGCCATT
AGAGTTGC
TATTTCC
AGTGCTCGGTTTTGTTTT
GTCAGATATAATTGAT
C
GGATGTA
GTACTACCGACCTACCGT
CTGCTATGCATGAACT
TCAC
GCTC
GGACGCCACCTTCCTCTT
2
CGGTCATAAACGCCA
CTGC
TTAGACCAAGC
CAGCAGAGACTATAGAC
2
TGCCTAGCTACTCTAG
ACTCAAGC
GTGAAACC
TCCTCCTCACTCGATCAT
3
TTCTCCTACTTGACTG
AATGC
GAACATCG
CGAAGCTTTCGGTGGGA
3
ACCTTGAGCGAGTCCT
TAGC
TGAACG
ATCCCTCCTCTGCTCAAT
TCAGGGAGGGTCCTA
GTTGG
GCTACTGG
GAGTCGATGTAATGTCA
GAAGGAGGTATCGCT
TCAGTGC
TTGTTGGAC
GGCGTAAAGGTTTTGCA
TGT
ATGATGCCATGAAGG
TCAGC
60
Kích
thƣớc
To
200
60
170
55
298
55
180
55
195
55
167
55
177
55
193
55
139
55
220
55
290
55
97
55
344
55
187
55
195
55
183
55
200
55
135
55
Tt
Tên mồi
Ch
Mb
37
RM163
5
18.9
38
RM18877
5
23.5
39
RM510
6
2.8
40
RM585
6
3.2
41
SO6065A
6
16.5
42
RM3635
7
11.1
43
SO 7053
7
15.3
44
RM455
7
22.3
45
RM337
8
0.1
46
RM152
8
0.6
47
RM310
8
5
48
RM547
8
5.5
49
RM23877
9
6.5
50
R9M30
9
14.6
51
RM215
9
20.9
52
RM171
10
2.6
53
RM 25022
10
3.6
54
R10M10
10
4.9
55
RM25271
10
10.7
Mồi xuôi
Mồi ngƣợc
CGCCTTTATGAGGAGGA
AAACTCTTCGACACGC
GATGG
CTTGC
ACCACTGCTGCAAAGAA
GCGAGAATAAGATGA
CATTGG
GACACAAGAGG
GTTTGACGCGATAAACC
ATGAGGACGACGAGC
GACAGC
AGATTCC
CTAGCTAGCCATGCTCTC
CTGTGACTGACTTGGT
GTACC
CATAGGG
CCCCTTCATCATTGCAAC
AGTCTCTCCATCACCC
TT
GTCT
GAGAGACAGTGGAAGGG
GTTCCCTCCCTCCTCC
AAGACG
TAGTTCG
CGAAACTTTGGGACGAA
CGTCCACCATTCACTG
ATG
TCAC
CCACAAATTAATCCGGA
AGCATTGTGCAATCAC
TCACACC
GAGAAGG
GTAGGAAAGGAAGGGCA
CGATAGATAGCTAGA
GAG
TGTGGCC
AAGGAGAAGTTCTCGCC
GCCCATTAGTGACTGC
CAGTGC
TCCTAGTCG
GACTTGTGGTTGTTGCTT
ACTGCCATATGCATTT
GTTGG
CCCTAGC
TTGTCAAGATCATCCTCG
GTCATTCTGCAACCTG
TAGC
AGATCC
TGCCACATGTTGAGAGT
TACGCAAGCCATGAC
GATGC
AATTCG
CTCACCTACCTAAAACCC
CCACCCAAATCTGATA
AAC
CTG
GAGCAGCAAGAGCAGCA
CATGCTCGACTTCAGA
GAGG
AGCTTGG
AACGCGAGGACACGTAC
ACGAGATACGTACGC
TTAC
CTTTG
ACATTCCGCGTTTGTGTG
GCTTGGTAGTTGGGCT
TAGC
GATGG
GAATACAACCCCCTAAA
ATGGACCGTTGAGGA
AAC
GAC
AGACGCTACTCCCACCT
ATATCATTGCCGCAAC
GTAACC
ACAAGC
61
Kích
thƣớc
To
179
55
191
60
193
5
174
55
1
5
90
5
90
55
210
55
175
55
200
55
160
55
176
55
283
55
328
60
170
55
174
55
360
55
200
60
200
55
186
60
Tt
Tên mồi
Ch
Mb
56
RM21
11
19.1
57
RM206
11
21.8
58
RM224
11
27.1
59
S11117C
11
60
RM7102
12
13.3
61
S12055
12
15.2
62
RM28746
12
26.4
63
RM17
12
26.9
9.5
Mồi xuôi
Mồi ngƣợc
ACAGTATTCCGTAGGCA
GCTCCATGAGGGTGG
CGG
TAGAG
ATCGATCCGTATGGGTTC
GTCCATGTAGCCAATC
TAGC
TTATGTGG
ATCGATCGATCTTCACGA
TGCTATAAAAGGCATT
GG
CGGG
2
CAACCATGTCTATGATCG
ATGT
GGCTGTCTCCATGTTG
AGGT
GGGCGTTCGGTTTACTTG
GGCGGCATAGGAGTG
GTTACTCG
TTTAGAGTGC
AAACGGATTAGAGGGGA
TCG
GAAGAAAGAAGACGCCA
AAGAAAGTTCCTTCAT
GAGGCTAT
CATTCCATTCCCTTCC
AGAAACG
TCTTCG
TGCCCTGTTATTTTCTTC
GGTGATCCTTTCCCAT
TCTC
TTCA
62
Kích
thƣớc
To
160
55
200
55
220
55
180
60
212
55
160
55
160
55
300
55
[...]... chống chịu mặn của lúa [20, 35] 1.5.2 Giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam và tình hình chọn giống lúa chịu mặn Việt Nam mới có rất ít nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn Một số giống lúa chịu mặn trồng ở các vùng ven biển Việt Nam như Cườm, Nhộng, Tẻ Tép, Tẻ Đỏ, Chiêm Bầu, Cút Hương năng suất thấp, chỉ đạt 18 - 20 tạ /ha Là những giống địa phương cho năng suất thấp Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng. .. phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chống chịu mặn khá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29 Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyển gen chống chịu mặn từ Pokkali vào một số giống lúa mùa địa phương có tính chống chịu mặn bằng phương pháp trở lại vào các nguồn giống lúa cao sản thích nghi với từng vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp lai tạo truyền... 6, 7, 9 Trong đó 25 QTL trên nhiễm sắc thể số 4 được xác định là QTL chính quy định tính chống chịu mặn của giống [25] Đề tài Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn của tôi được tiến hành trong khuôn khổ của dự án hợp tác quốc tế VN-Đan Mạch nhằm tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng đồng bằng ven biển Việt Nam”, được thực hiện... bằng cách phân tích kiểu hình Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt 1.5 Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn 1.5.1 Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến đổi di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng về năng suất,... gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn nhiều so với Pokkali Giống lúa TCCP226-2-49-B-B-3 đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống lúa chịu mặn tại nhiều Trung tâm nghiên cứu lúa trên thế giới [19] Cho tới nay, rất nhiều nghiên cứu đánh giá và xác định về tính chịu mặn của các giống lúa bản địa và giống lúa cải tiến (Gregorio và cs, 2002; Negrao và cs, 2011) Một số giống lúa địa phương có... mẽ của công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, các nhà khoa học đã đưa ra một phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử mới – đó là Chọn giống trên cơ sở chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assisted BackCrossing – MABC) MABC là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc đưa Locut gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen mong muốn vào giống ưu tú nhằm chọn tạo giống mới mang gen/QTL... Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một số giống lúa địa phương vùng Đồng bằng ven biển Bắc Bộ Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co 60) đã tạo ra những biến dị có lợi cho chọn giống Các giống lúa CM1, CM5, là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những đặc tính chống chịu mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao [1] Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long từ... này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai Do đó, lai tạo cho tính trạng chống chịu mặn trong vài trường hợp kéo dài 10 – 15 năm để phát triển một giống lúa mới (Collard và Mackill, 2008)[12] Việc lai tạo giống lúa chống chịu mặn còn gặp khó khăn do bản chất đa gen (QTL) của tính trạng chống chịu mặn Biểu hiện tính chống chịu mặn của một giống lúa bị ảnh hưởng rất lớn bởi điều kiện môi trường ngoại... giới Trong đó trên 20% 23 giống có khả năng chịu mặn khá Các giống lúa bản địa thu thập ở khu vực vùng duyên hải Nam Á có tính chịu mặn cao chẳng hạn giống Nona Bokra, Cheriviruppu, SR26B, Solla (Ấn độ), Ketumbar (Indonesia), Khao Seetha (Thái lan), hay giống Sóc nâu (Việt nam) Đặc biệt giống Hawasi nguồn gôc từ Saudi Arabia có khả năng chịu mặn lớn hơn cả các giống chịu mặn Pokkali và Nona Bokra [17,... sâu bệnh chính và chống chịu với những điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng, mặn Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), từ năm 1977 - 1980 đã tiến hành chọn được những dòng lúa chống chịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-1, IR463-22-2, IR9884-54-3 Năng suất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm Những giống lúa cải tiến này cho năng ... chống chịu mặn giống [25] Đề tài Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn tiến hành khuôn khổ dự án hợp tác quốc tế VN-Đan Mạch nhằm tạo giống lúa chịu ngập chìm chịu mặn thích... việc chọn tạo giống lúa chịu mặn cần thiết Xuất phát từ nhu cầu trên, tiến hành đề tài: Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn Mục tiêu nghiên cứu đề tài: Sử dụng phương pháp. .. MABC) .20 1.5 Một số kết chọn tạo giống lúa chịu mặn .22 1.5.1 Một số kết thành tựu chọn tạo lúa chịu mặn giới 22 1.5.2 Giống lúa chống chịu mặn Việt Nam tình hình chọn giống lúa chịu