2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số
ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến (Shagai – Maroof - 1984) [26]. Lá lúa sau khi cấy 2 - 3 tuần được nghiền trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn. Mẫu được cho vào eppendorf 2ml và thêm 1ml đệm chiết (100mM Tris; 500mM NaCl; 50mM EDTA; 0,07% - Mercaptol ethanol) sau đó thêm 50l SDS 10% rồi ủ trong 30 phút ở 650C. Hỗn hợp trên mang ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 20 phút, sau đó lấy dịch nổi rồi thêm 1ml isopropanol alcohol, để vào tủ 40C 30 phút, ly tâm tiếp ở 13500 vòng/phút trong 25 phút. Đổ hết dịch nổi, thêm 400l đệm TE (10mM Tris; 0,5 mM EDTA pH=8,0) rồi ủ trong 5 phút ở 65oC. Cho 3l RNAse (10mg/ml) vào mỗi ống và ủ ở 37oC 60 phút. Thêm 400l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút. Thêm vào 800l chloroform/isoamyl alcohol (24:1) sau đó ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi được tách riêng, thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong -200C 60 phút. Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút. Thu tủa, rửa tiếp bằng 400l cồn 70%, ly tâm 13500 vòng/phút trong 5 phút. Hòa tan tủa trong TE và giữ trong -20oC để sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
2.3.1.2. Phƣơng pháp PCR [5] với mồi SSR
Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR được chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lượng của các chất trong mỗi phản ứng như trong bảng 4.
Bảng 4. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR
TT Thành phần Thể tích (l)
1 H2O cất khử trùng 8.95
2 Buffer 10X 1,5
29
TT Thành phần Thể tích (l)
4 dNTP (1mM) 1,0
5 Taq ADN polymeraza (5U) 0,1
6 Mồi xuôi (5M) 0,5
7 Mồi ngược (5M) 0,5
8 ADN (35ng/ l) 2,0
Tổng thể tích: 15
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 5. Điều kiện của phản ứng PCR
Bƣớc Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 94 5 phút 1 2 94 30 giây 35 55* 30 giây 72 45 giây 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể
2.3.1.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%
Các bước tiến hành
0.8g agarose hòa vào 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0). Đun nóng đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất. Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều. Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông. Rút lược, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE
30
ngập mặt gel. Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ 5l Xylen cyanol /15l mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng để điện di phụ thuộc vào kích thước của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp. Soi gel trên máy soi cực tím, đo ̣c và ghi nhâ ̣n kết quả.
2.3.1.4. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính
Lau kỹ bề mặt hai tấm kính rồi lắp ghép lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm. Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào cốc đong. Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều. Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí. Cài lược vào giữa hai tấm kính rồi dùng kẹp cố định lược. Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.
Sau khi tháo lược, thực hiện lắp ráp bộ điện di, cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dưới. Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện là 50 - 60A, công suất 92 - 100W. Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi trộn với 4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol), làm lạnh nhanh trong 5 phút. 5l sản phẩm PCR được tra vào các giếng, các mẫu chạy với ladder 50 bp. Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước từng mồi sử dụng.
Phƣơng pháp nhuộm bạc
Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành cố định gel. Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng (glacial acetic 10%), để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Rửa gel bằng nước cất rồi cho vào dung dịch nhuộm (1g bạc nitrat (AgNO3) trong 1 lít nước cất, bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37%.), lắc nhẹ trong 30 phút. Gel sau đó được lấy ra rửa sạch bằng nước cất rồi đưa vào dung dịch hiện (Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nước cất) lắc nhẹ đến khi băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng trong 3 - 6 phút rửa lạivbằng nước cất, để khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
31
Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide không biến tính
Lau kỹ 2 tấm kính sau đó đặt tấm kính ngắn lên trên tấm kính dài sao cho không bị hở và dùng kẹp kẹp chặt hai tấm kính với nhau. Chuẩn bị dung dịch 6% acrylamide, thêm các thành phần 50l TEMED và 250l APS 20%, 2,5ml TBE 10X, 7,5ml 40% acrylamide, 39,44 ml H2O, khuấy đều. Đổ từ một góc cho đến khi gel đầy tấm kính ngắn, cài lược sao cho để răng lược hướng vào trong. Sau 15 phút gel đông lại, lắp vào bể điện di sao cho không để lại bọt khí dưới tấm kính, thêm đệm TBE 0,5x ngập mặt gel khoảng 0,5cm. Rút lược ra và tra khoảng 7l mẫu cho mỗi giếng. các mẫu chạy với marker chuẩn 25bp. Điện di từ 1,5 – 5h ở 100V tùy từng kích thước cặp mồi PCR và tùy từng nồng độ gel.
Sau khi điện di xong, tháo kính, lấy gel ra cho vào một hộp kín có chứa TBE 0,5X. Cho dung dịch nhuộm Syber Safe ngâm trong 30 phút. Sau đó chụp ảnh bằng máy soi UV.
2.3.2. Phƣơng pháp lai nhân tạo
Phương pháp này được sử dụng trong trở lại, qui tụ gen chịu mặn từ dòng/giống cho gen vào giống lúa ưu việt.
Cặp lai được lựa chọn là dòng /giống cho gen chịu mặn (donor) mang gen kháng và có đặc tính kháng cao, dòng hoặc giống nhận gen là những dòng/giống có các đặc điểm ưu việt như chất lượng gạo ngon, năng suất cao, các đặc điểm nông sinh học đáp ứng nhu cầu sản xuất. Khi gieo hạt phải tính toán thời gian sinh trưởng của các dòng/giống cho và nhận gen sao cho thời gian ra hoa phải trùng nhau. Tiến hành theo những bước sau:
Gieo hạt cây bố mẹ, chăm sóc cây đến khi ra hoa. Chọn những hoa phát triển tốt, có khả năng cho hạt bình thường. Tiến hành khử đực cây mẹ khi lúa bắt đầu trổ bông. Khử đực phải tiến hành khi vách bao phấn chưa mở, nếu khử quá sớm sẽ gây tổn thương hoa, nếu khử quá muộn hạt đã được thụ phấn. Khi khử đực, cắt vát vỏ phần nửa trên của hoa, chú ý không cắt vào vòi nhị cái, sau đó dùng panh nhỏ hoặc máy thổi để loại bỏ hết nhị đực trong hạt lúa.
Sau khi khử đực xong tiến hành cách ly các hoa để tránh giao phấn từ những cây khác trong quần thể bằng cách bao giấy bóng mờ hay những bao nilon để tránh
32
mưa, vừa tạo cho cây và hoa quang hợp được. Sau khi khử đực 1-2 ngày có thể cho thụ phấn. Chuẩn bị phấn của cây bố để thụ phấn cho cây mẹ, cần phải chuẩn bị luợng phấn đủ để thụ phấn cho hoa của những cây mẹ đã khử đực.
Thông thường, tiến hành khử đực chiều hôm trước và cho thụ phấn vào 10- 12 giờ ngày hôm sau vì đó là thời gian vòi nhụy dễ dàng tiếp nhận và hạt phấn dễ nẩy mầm ở trên đầu nhụy. Cũng có thể để cây bố và mẹ cạnh nhau hay có thể rũ phấn cây bố vào cây mẹ hoặc dùng panh nhỏ gắp bao phấn đặt lên vòi nhụy. Khi thụ phấn nên dùng những hạt phấn ở trên những cây bố khoẻ, hoa tươi mới. Sau thụ phấn, tiến hành chăm sóc cây và các biện pháp chống côn trùng phá hoại hạt lai. Sau 25- 30 ngày có thể thu hạt lai.
Các hạt lai F1 được trồng đến khi được 20 ngày tuổi thì tiến hành tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của gen chịu mặn bằng chỉ thị phân tử. Chọn lọc các cá thể dị hợp tử mang gen chịu mặn để lai trở lại với giống AS996 (làm bố) tạo quần thể BC1F1. Các cá thể BC1F1 được trồng, tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của gen chịu ngập và chọn lọc nền gen của cây mẹ bằng chỉ thị phân tử. Chọn những cá thể mang gen chịu mặn và có nền di truyền lớn nhất của giống để lai trở lại với dòng nhận gen tạo BC2F1.
Tiếp tục các công việc như từ thế hệ BC1F1 đến thế hệ BC3F1 có thể lai thêm 1 thế hệ nữa hoặc cho tự thụ để chọn cá thể đồng hợp tử mang gen kháng, chọn được dòng mang gen chịu mặn và mang phần trăm lớn nhất nền gen của cây mẹ.
2.3.3. Quy trình MABC (Marker Assisted Backcrossing) trong chọn tạo giống lúa chịu mặn lúa chịu mặn
Phân tích đa hình di truyền giữa hai giống bố mẹ nhận gen và cho Locut gen
Saltol bằng chỉ thị phân tử SSR. Xác định các cặp mồi đa hình phục vụ phân tích di truyền, chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly BC.
Lai tạo hạt F1 quần thể chọn giống: Dòng mẹ đã được lựa chọn là cây nhận AS996 (giống địa phương phổ biến) sẽ được lai tạo với dòng cho Locut gen Saltol, dòng FL478.
33
Tạo cây BC1F1, sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể mang gen đích Saltol và cây tái tổ hợp mang nhiều nền gen của cây AS996 trong quần thể BC1F1.
Cây mang nhiều nền gen nhận sẽ được lai trở lại với dòng nhận gen để tạo quần thể BC2F1.
Lặp lại bước chọn lọc các thể bằng chỉ thị phân tử, chọn dòng mang gen đích và mang nhiều nền gen cây nhận.
Đánh giá sơ bộ tính chống chịu mặn của dòng chọn lọc
2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá mặn nhân tạo
Phương pháp thanh lọc mặn nhân tạo trong phòng thí nghiệm theo tiêu chuẩn của IRRI. [18]
Hoá chất
34 Dung dịch dinh dưỡng Yoshida
Bảng 6. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida (Yoshida và ctv, 1976)
Nguyên tố Hoá chất Lƣợng cần
(g/2L dd mẹ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đa lượng
N Ammonium nitrate (NH4NO3) 365,6
P Sodium phosphate, monosasic monohydrate
(NaH2PO4.H2O) 142,4
K Potassium sulfate (K2SO4) 285,6
Ca Calcium sulfate, dihydrate (CaCl2.2 H2O) 469,4
Mg Magensium sulfate, 7- hydrate
(MgSO4.7H2O) 1.296,0
Vi lượng
Hoà tan làn lượt từng nhóm chất với 2L nước cất, sau đó thêm 200 ml H2SO4 cuối cùng lên thể tích đầy đủ.
Mn Mangannuos chloride, 4-hydrate
(MnCl2.4H2O) 6,000
Mo Ammonium molybdate, 4-hydrate
[(NH4)6MoO24.4H2O] 0,296
Zn Zinc sulfate, 7-hydrate (ZnSO4.7 H2O) 0,140
B Boric acid (H3BO3) 3,736
Cu Cupric sulfate, 5-hydrate (CuSO4.5H2O) 0,124
Fe Ferric chloride, 6-hydrate (FeCl3.6H2O) 30,800
35
Phƣơng pháp đánh giá mặn (theo IRRI) [18]
Các dòng sử dụng cho quá trình thanh lọc
Vật liệu chính gồm chậu nhựa có dạng hình chữ nhật, kích thước khoảng 14x30x35cm, lưới chống muỗi, tấm xốp dầy khoảng 1,2 - 2,5cm, muối NaCl, dung dịch Yoshida.
Tấm xốp nổi được cắt kích thước sao cho lọt vừa khít vào bên trong của chậu nhựa. Cắt những rãnh thẳng sao cho chứa được 20 hạt lúa nảy mầm. Mặt dưới của tấm xốp phủ bằng lưới muỗi sao cho hạt lúa không bị lọt xuống đáy chậu nhựa.
Hạt lúa vô trùng, được nảy mầm và đặt vào trong rãnh chứa của tấm xốp. Trong 13 ngày đầu mạ được nuôi trong môi trường dinh dưỡng bình thường. Từ ngày thứ 14 mạ được nuôi trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung muối và bắt đầu theo dõi tính chịu mặn của các dòng nghiên cứu, 5 ngày thay môi trường dinh dưỡng 1 lần. pH của dung dịch luôn được duy trì ở mức 5. Việc điều chỉnh pH được thực hiện mỗi ngày. Kết thúc thử mặn sau khi các dòng nhiễm (chuẩn nhiễm) đạt đến điểm 7 -9.
Bảng 7. Thang điểm Standard Evaluating Score (IRRI, 1997)
Điểm Quan sát Mức chống chịu
1 Tăng trưởng bình thường, không lá nào bị héo
vàng Kháng cao
3 Cây sinh trưởng gần như bình thường, có một vài lá hoặc dầu lá hơi trắng và bị cuộn lại. Kháng
5 Cây chậm phát triển. Hầu hết lá cuộn lại, rất ít lá phát triển dài ra được Kháng trung bình (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7 Cây ngừng sinh trưởng, một số cây chết Nhiễm
9 Hầu hết cây bị chết hoặc đang chết Nhiễm cao
Tính tỉ lệ % cây sống vào ngày thứ 10 sau thử mặn.
Tiến hành đánh giá vào ngày thứ 7- 8 sau khi cho cây vào môi trường mặn theo bảng 2.3.
36
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu được ghi nhận trong chương trình, IRRISTAT, Excel và xử lý trong chương trình GGT2.0 (Van Berloo, 2008)[41] như sau: Ghi nhận dữ liệu của từng chỉ thị SSR đối với các alen đồng hợp tử giống nhận nhận gen là “A”, đồng hợp tử giống cho gen là “B” và dị hợp tử là “H”, số % alen của cây nhận gen là “R”.
Hình 3. Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết gen kết hợp lai trở lại (MABC)
Sàng lọc gen kháng Chỉ thị liên kết với gen kháng
Chỉ thị nắm về hai phía gen kháng Sàng lọc tái tổ hợp
Sàng lọc nền di truyền giống nhận gen Chỉ thị nằm trên 11 NST còn lại
Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và
nền di truyền giống nhận gen Chỉ thị liên kết chặt, nằm về hai phía gen kháng và trên 11 NST khác
Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và nền di truyền giống nhận gen
Khẳng định kết quả bằng chỉ thị liên kết chặt, nằm hai phía gen kháng và trên 11 NST khác
Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và nền di truyền giống nhận gen
Các dòng mang gen chịu mặn có nền di truyền của giống nhận gen
(Giống nhận gen x giống cho gen) F1 x Giống nhận gen BC1F1 (700 cá thể) BC1F1 mang gen kháng (150 – 350 cá thể) BC1F1 tái tổ hợp (15 – 25 cá thể) Cá thể BC1F1 tốt nhất (1-3 cá thể) x Giống nhận gen BC2F1 (100-200 cá thể) Cá thể BC2F1 tốt nhất (1-3 cá thể) x Giống nhận gen BC3F1 (100-200 cá thể) BC3F2 (400 cá thể) Cá thể BC3F1 tốt nhất
37
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số
Để tiến hành kiểm tra các cây lai của vu ̣ trước chúng tôi tiến hành thu mẫu lá lúa khi cây lúa cấy được 20 ngày tuổi về tách chiết ADN. Đây là bước rất quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bước nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB. Lá non 3 tuần sau khi cấy của những giống nghiên cứu được thu để tách chiết ADN. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực tím. Kết quả tách chiết ADN được minh hoạ ở hình 3.1.
Hình 4. Kết quả điện di kiểm tra ADN của các giống trên gel agarose.Giếng 1, 33: ADN chuẩn nồng độ 100ng/l. Giếng 2-31; 34-61: ADN của các cá thể
trong quần thể nghiên cứu.
Trên hình 3.1 cho thấy, kết quả tách chiết tinh sạch ADN của các cây trong quần thể nghiên cứu có đủ độ tinh sạch và nồng độ trong khoảng từ 100 ng/l để có thể tiến hành thí nghiệm. Các cá thể ở các thế hệ tiếp theo cũng được tách chiết ADN tương tự như vậy để phục vụ cho bước tiếp theo trong thí nghiệm phân tích.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
38
3.2. Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ
Đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});