lúa chịu mặn
Phân tích đa hình di truyền giữa hai giống bố mẹ nhận gen và cho Locut gen
Saltol bằng chỉ thị phân tử SSR. Xác định các cặp mồi đa hình phục vụ phân tích di truyền, chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly BC.
Lai tạo hạt F1 quần thể chọn giống: Dòng mẹ đã được lựa chọn là cây nhận AS996 (giống địa phương phổ biến) sẽ được lai tạo với dòng cho Locut gen Saltol, dòng FL478.
33
Tạo cây BC1F1, sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể mang gen đích Saltol và cây tái tổ hợp mang nhiều nền gen của cây AS996 trong quần thể BC1F1.
Cây mang nhiều nền gen nhận sẽ được lai trở lại với dòng nhận gen để tạo quần thể BC2F1.
Lặp lại bước chọn lọc các thể bằng chỉ thị phân tử, chọn dòng mang gen đích và mang nhiều nền gen cây nhận.
Đánh giá sơ bộ tính chống chịu mặn của dòng chọn lọc
2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá mặn nhân tạo
Phương pháp thanh lọc mặn nhân tạo trong phòng thí nghiệm theo tiêu chuẩn của IRRI. [18]
Hoá chất
34 Dung dịch dinh dưỡng Yoshida
Bảng 6. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida (Yoshida và ctv, 1976)
Nguyên tố Hoá chất Lƣợng cần
(g/2L dd mẹ)
Đa lượng
N Ammonium nitrate (NH4NO3) 365,6
P Sodium phosphate, monosasic monohydrate
(NaH2PO4.H2O) 142,4
K Potassium sulfate (K2SO4) 285,6
Ca Calcium sulfate, dihydrate (CaCl2.2 H2O) 469,4
Mg Magensium sulfate, 7- hydrate
(MgSO4.7H2O) 1.296,0
Vi lượng
Hoà tan làn lượt từng nhóm chất với 2L nước cất, sau đó thêm 200 ml H2SO4 cuối cùng lên thể tích đầy đủ.
Mn Mangannuos chloride, 4-hydrate
(MnCl2.4H2O) 6,000
Mo Ammonium molybdate, 4-hydrate
[(NH4)6MoO24.4H2O] 0,296
Zn Zinc sulfate, 7-hydrate (ZnSO4.7 H2O) 0,140 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B Boric acid (H3BO3) 3,736
Cu Cupric sulfate, 5-hydrate (CuSO4.5H2O) 0,124
Fe Ferric chloride, 6-hydrate (FeCl3.6H2O) 30,800
35
Phƣơng pháp đánh giá mặn (theo IRRI) [18]
Các dòng sử dụng cho quá trình thanh lọc
Vật liệu chính gồm chậu nhựa có dạng hình chữ nhật, kích thước khoảng 14x30x35cm, lưới chống muỗi, tấm xốp dầy khoảng 1,2 - 2,5cm, muối NaCl, dung dịch Yoshida.
Tấm xốp nổi được cắt kích thước sao cho lọt vừa khít vào bên trong của chậu nhựa. Cắt những rãnh thẳng sao cho chứa được 20 hạt lúa nảy mầm. Mặt dưới của tấm xốp phủ bằng lưới muỗi sao cho hạt lúa không bị lọt xuống đáy chậu nhựa.
Hạt lúa vô trùng, được nảy mầm và đặt vào trong rãnh chứa của tấm xốp. Trong 13 ngày đầu mạ được nuôi trong môi trường dinh dưỡng bình thường. Từ ngày thứ 14 mạ được nuôi trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung muối và bắt đầu theo dõi tính chịu mặn của các dòng nghiên cứu, 5 ngày thay môi trường dinh dưỡng 1 lần. pH của dung dịch luôn được duy trì ở mức 5. Việc điều chỉnh pH được thực hiện mỗi ngày. Kết thúc thử mặn sau khi các dòng nhiễm (chuẩn nhiễm) đạt đến điểm 7 -9.
Bảng 7. Thang điểm Standard Evaluating Score (IRRI, 1997)
Điểm Quan sát Mức chống chịu
1 Tăng trưởng bình thường, không lá nào bị héo
vàng Kháng cao
3 Cây sinh trưởng gần như bình thường, có một vài lá hoặc dầu lá hơi trắng và bị cuộn lại. Kháng
5 Cây chậm phát triển. Hầu hết lá cuộn lại, rất ít lá phát triển dài ra được Kháng trung bình
7 Cây ngừng sinh trưởng, một số cây chết Nhiễm
9 Hầu hết cây bị chết hoặc đang chết Nhiễm cao
Tính tỉ lệ % cây sống vào ngày thứ 10 sau thử mặn.
Tiến hành đánh giá vào ngày thứ 7- 8 sau khi cho cây vào môi trường mặn theo bảng 2.3.
36
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu được ghi nhận trong chương trình, IRRISTAT, Excel và xử lý trong chương trình GGT2.0 (Van Berloo, 2008)[41] như sau: Ghi nhận dữ liệu của từng chỉ thị SSR đối với các alen đồng hợp tử giống nhận nhận gen là “A”, đồng hợp tử giống cho gen là “B” và dị hợp tử là “H”, số % alen của cây nhận gen là “R”.
Hình 3. Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết gen kết hợp lai trở lại (MABC)
Sàng lọc gen kháng Chỉ thị liên kết với gen kháng
Chỉ thị nắm về hai phía gen kháng Sàng lọc tái tổ hợp
Sàng lọc nền di truyền giống nhận gen Chỉ thị nằm trên 11 NST còn lại
Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và
nền di truyền giống nhận gen Chỉ thị liên kết chặt, nằm về hai phía gen kháng và trên 11 NST khác
Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và nền di truyền giống nhận gen
Khẳng định kết quả bằng chỉ thị liên kết chặt, nằm hai phía gen kháng và trên 11 NST khác (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sàng lọc gen kháng, tái tổ hợp và nền di truyền giống nhận gen
Các dòng mang gen chịu mặn có nền di truyền của giống nhận gen
(Giống nhận gen x giống cho gen) F1 x Giống nhận gen BC1F1 (700 cá thể) BC1F1 mang gen kháng (150 – 350 cá thể) BC1F1 tái tổ hợp (15 – 25 cá thể) Cá thể BC1F1 tốt nhất (1-3 cá thể) x Giống nhận gen BC2F1 (100-200 cá thể) Cá thể BC2F1 tốt nhất (1-3 cá thể) x Giống nhận gen BC3F1 (100-200 cá thể) BC3F2 (400 cá thể) Cá thể BC3F1 tốt nhất
37
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số
Để tiến hành kiểm tra các cây lai của vu ̣ trước chúng tôi tiến hành thu mẫu lá lúa khi cây lúa cấy được 20 ngày tuổi về tách chiết ADN. Đây là bước rất quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bước nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB. Lá non 3 tuần sau khi cấy của những giống nghiên cứu được thu để tách chiết ADN. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực tím. Kết quả tách chiết ADN được minh hoạ ở hình 3.1.
Hình 4. Kết quả điện di kiểm tra ADN của các giống trên gel agarose.Giếng 1, 33: ADN chuẩn nồng độ 100ng/l. Giếng 2-31; 34-61: ADN của các cá thể
trong quần thể nghiên cứu.
Trên hình 3.1 cho thấy, kết quả tách chiết tinh sạch ADN của các cây trong quần thể nghiên cứu có đủ độ tinh sạch và nồng độ trong khoảng từ 100 ng/l để có thể tiến hành thí nghiệm. Các cá thể ở các thế hệ tiếp theo cũng được tách chiết ADN tương tự như vậy để phục vụ cho bước tiếp theo trong thí nghiệm phân tích.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
38
3.2. Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ
Đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình ADN giữa các giống cho gen và nhận gen với chỉ thị liên kết chặt là điều kiện tiên quyết để có thể sử dụng chỉ thị phân tử nhằm phát hiện sự có mặt của gen kháng trong các cá thể con lai.
Để lựa chọn gen đích (Saltol) chúng tôi tiến hành khảo sát một nhóm chỉ thị nằm ở vị trí của gen và về hai phía của gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1. Vị trí xác định của các chỉ thị trên nhiễm sắc thể số 1 được thể hiện trên hình.
Hình 5. Các chỉ thị liên kết gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1(IRRI, 2012) [24] Giống FL478 có mang gen chịu mặn Saltol. Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng để phát hiện gen chịu mặn trong các cá thể con lai chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với ADN của các giống lúa FL478 và AS996. Tổng số 500 chỉ thị SSR trên 12 NST của lúa đã được sàng lọc để xác định các chỉ thị cho đa hình giữa các cây bố mẹ cho và nhận gen kháng. Trong số đó, có 52 chỉ thị nằm ở vùng gen Saltol đã được phân tích. Kết quả có 63 chỉ thị cho băng đa hình giữa giống
39
FL478 và AS996 (phụ lục 1). Kết quả này cho thấy tần số cho đa hình của các chỉ thị SSR đã phân tích với 2 giống AS996/FL478 là khá thấp (12,6%). Tất cả các chỉ thị này đã được sử dụng để phân tích sàng lọc các cá thể con lai ở những thế hệ BC1F1, BC2F1 và BC3F1.
Hình 6 cho thấy, hai giống FL478 và AS996 (giếng thứ tư và thứ sáu ở mỗi phần gel đối với từng chỉ thị) cho đa hình với các chỉ thị SO7053, G11, AP3206, S12055.
Hình 3.4 đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide cho thấy hai giống FL478 và AS996 cho đa hình với các chỉ thị RM18 và RM152.
Hình 6. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 6% Thứ tự giếng theo chỉ thị: 1.Q5; 2.Q5; 3.OM5472; 4.FL478; 5.IR64SUB1;
6.AS996; 7.KDDB; 8.BT
Chỉ thị: 1-8 SO7053; 9-16 G11; 17-24 AP3206; 25-32 S12055; 34-41 RM228; M: 42 25bp ladder
Hình 7. Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 4.5% Thứ tự giếng theo chỉ thị:1.Q5; 2.Q5; 3.OM5472; 4. IR64SUB1; 5. FL478; 6.KDDB; 7.AS996; Chỉ thị: RM18; RM118; RM152; RM223; RM284
1 4 8 12 16 17 20 24 28 32 34 38 41
40
Hình 8. Bản đồ di truyền các chỉ thị SSR được sử dụng cho phân tích các cá thể quần thể AS996/FL478
41 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3. Phân tích các cá thể BC bằng phƣơng pháp MABC
3.3.1. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC1F1 (AS996/FL478 x AS996) AS996)
Trên cơ sở bản đồ vùng QTL Saltol, những chỉ thị tốt nhất trong vùng QTL
Saltol là AP3206 và RM3412, chỉ thị hữu ích nhất là chỉ thị nằm rải rác 2 phía của
Saltol là RM10694 và RM493, RM10793, trong khi các chỉ thị nằm gần đó có thể sử dụng cho phép chọn lọc âm tính là RM490 nằm phía trên Saltol và RM7075 ở phía dưới, các chỉ thị Microsatellite không liên kết với Saltol bao phủ cả NST này cho đa hình giữa 2 giống cho nhận gen cũng có thể được sử dụng cho sàng lọc các cá thể tái tổ hợp di truyền và cho chọn lọc nền gen thể nhận. Có 42 chỉ thị SSR đã được phân tích cho sàng lọc thế hệ BC1F1. Việc sàng lọc gen đích đã tiến hành nhờ phân tích các cá thể với 3 chỉ thị AP3206, RM3412 và RM10793. Sau đó, các chỉ thị nằm 2 phía gần vùng Saltol đã được phân tích trong sàng lọc xác định các cây tái tổ hợp. Tổng số 500 cá thể đã được phân tích. Đã xác định được 245 cây mang gen đích Saltol.
Sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị AP3206 cho thấy có 26/46 cá thể trên gel là dị hợp tử với locut AP3206. Các cá thể mang băng dị hợp tử sẽ được ghi nhận lại để phân tích. (Hình 3.6)
1 2 25 AS FL
Hình 9.Sàng lọc cá thểBC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị AP3206.
Làn gel 1: 25bp ladder, 2-25 và 26-48: các cá thể BC1F1, 49:AS996, 50: FL478
1 2 25 50
Hình 10. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM10793. Làn
42
Hình 10 cho thấy kết quả sàng lọc với chỉ thị RM10793, hầu hết các cá thể BC1F1trên gel là dị hợp tử với locut RM10793. Các cá thể mang băng dị hợp tử sẽ được ghi nhận lại để phân tích.
Sau đó phân tích xác định cây tái tổ hợp sử dụng các chỉ thị RM10694, RM562, RM7075 nằm về 2 phía của gen đích trên nhiễm sắc thể số 1.
Sau khi xác định các cá thể tái tổ hợp có chứa gen đích, tiếp tục bước phân tích các cây đã chọn ra bằng các chỉ thị nằm rải rác trên 12 nhiễm sắc thể của lúa đã được sử dụng để phân tích xác định cây mang nhiều nền gen cây nhận.
Hình 11, 12 cho thấy kết quả sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị RM310, RM5639 cho phép lựa chọn các cá thể trên gel mang băng của cây nhận gel AS996 để chọn lựa tối đa nền gen cây nhận gen. Số liệu ghi nhận được phân tích trên trong Excel. Hai cây mang nhiều nền gen cây nhận gồm cá thể P284 và P307 mang tỉ lệ nền gen cây nhận tương ứng là 89.06% và 86.36% (bảng 3.1). Trong trường hợp chỉ sử dụng các phương pháp chọn giống truyền thống, tỉ lệ nền gen của cây nhận gen trong thế hệ này chỉ đạt được 75%, thấp hơn trong nghiên cứu này từ 16-19%.
Hình 12. Sàng lọc cá thểBC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM5639. Làn gel 1, 26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: Các cá thể BC1F1, 49:AS996, 50:FL478 1 2 25 A FL Hình 11. Sàng lọc cá thểBC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM310. Làn gel 1, 25, 51: 25bp ladder, 2-25 và 26-48: cá thể BC1F1, 49:AS996, 50: FL478 1 25 51
43
Bảng 8. Tỉ lệ nền gen cây nhận ở 12 cây tái tổ hợp ở thế hệ BC1F1 Cây
số 5 49 28 38 81 84 05 07 11 01 11 26
A 55.26 51.43 60.53 44.74 56.25 78.13 66.67 75.76 63.64 73.68 66.67 63.64 H 34.38 37.93 36.36 34.38 15.63 21.88 33.33 21.21 36.36 80.00 33.33 36.36 R 72.45 70.39 78.71 61.92 64.06 89.06 83.33 86.36 81.82 73.68 83.33 81.82
Số liệu kiểu gen của các cá thể có chứa tái tổ hợp tại vị trí gen Saltol được phân tích trên phần mềm GGT2.0. Kết quả thể hiện trên hình 3.10. Hình vẽ thể hiện bản đồ vị trí các chỉ thị SSR được sử dụng để sàng lọc NST số 1, 3, 4 và 10, các kí hiệu A: là kiểu gen cây mẹ, B: là kiểu gen cây bố; H: là dị hợp tử và K: là số liệu nghi ngờ. Nhìn vào hình vẽ có thể thấy rõ các locut phân tích với các kiểu gen đặc trưng cho giống cho hoặc nhận gen kháng.
0 cM RM171 2.6 RM 25022 3.6 R10M10 4.9 R10M17 8.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 L e g e n d . A B H K Group 10 [chrom10] 0 cM RM518 2.0 R4M13 7.9 R4M17 11.5 R4M30 17.9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 L e g e n d . A B H K Group 4 [chrom4] 0 25 cM RM5639 8.1 SO3065 12.8 SO3068 14.8 SO3072 15.4 RM5626 24.7 RM6329 28.7 RM3867 31.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 L e g e n d . A B H K Group 3 [chrom3] 0 cM G11A 0.0 RM10694 1.0 AP3206e 2.0 RM10711A 3.0 RM3412A 4.0 RM493 5.0 RM10793 6.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 L e g e n d . A B H K Group 1 [chrom1]
Hình 13: Bản đồ của một số câyBC1F1 (AS996/FL478/AS996) trên NST1, 3, 4 và 10.
44
3.3.2. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) AS996)
Hai cá thể P284 và P307 của thế hệ BC1F1 mang tỉ lệ nền gen cây nhận tương ứng là 89.06% và 86.36%. Hai cây này đã được sử dụng để phát triển quần thể thế hệ BC2F1.
500 cá thể của quần thể BC2F1 thuộc phép lai (AS996/FL478/AS996/ AS996) đã được trồng và phân tích ADN. Tương tự như các bước phân tích trên các cá thể thuộc thế hệ BC1F1, các bước phân tích sự có mặt của gen đích, phân tích xác định cây tái tổ hợp rồi phân tích toàn bộ nền gen sử dụng các chỉ thị nằm trên 12 nhiễm sắc thể đã được tiến hành. Bước phân tích gen đích sử dụng chỉ thị AP3206, RM3412, RM10793, RM10711 (Hình 3.11; 3.12). Các cá thể có mang hai băng đối với cả bốn chỉ thị này sẽ được chọn lựa cho bước phân tích tái tổ hợp sử dụng các chỉ thị RM10694, RM562, RM7075 nằm về hai phía của vùng Saltol trên nhiễm sắc thể số 1. Trong tổng số 250 cây dị hợp tử đã xác định được 26 cây tái tổ hợp trên vùng gen Saltol.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 14. Sàng lọc cá thểBC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM3412. Làn gel từ 1 đến 57: các cá thể BC2F1; 58: FL478, 59: AS996
Hình 15. Sàng lọc cá thểBC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị
RM10793 (bên trái), và RM10711 (bên phải).
1 10 20 30 40 50 59