AS996)
Hai cá thể P284 và P307 của thế hệ BC1F1 mang tỉ lệ nền gen cây nhận tương ứng là 89.06% và 86.36%. Hai cây này đã được sử dụng để phát triển quần thể thế hệ BC2F1.
500 cá thể của quần thể BC2F1 thuộc phép lai (AS996/FL478/AS996/ AS996) đã được trồng và phân tích ADN. Tương tự như các bước phân tích trên các cá thể thuộc thế hệ BC1F1, các bước phân tích sự có mặt của gen đích, phân tích xác định cây tái tổ hợp rồi phân tích toàn bộ nền gen sử dụng các chỉ thị nằm trên 12 nhiễm sắc thể đã được tiến hành. Bước phân tích gen đích sử dụng chỉ thị AP3206, RM3412, RM10793, RM10711 (Hình 3.11; 3.12). Các cá thể có mang hai băng đối với cả bốn chỉ thị này sẽ được chọn lựa cho bước phân tích tái tổ hợp sử dụng các chỉ thị RM10694, RM562, RM7075 nằm về hai phía của vùng Saltol trên nhiễm sắc thể số 1. Trong tổng số 250 cây dị hợp tử đã xác định được 26 cây tái tổ hợp trên vùng gen Saltol.
Hình 14. Sàng lọc cá thểBC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM3412. Làn gel từ 1 đến 57: các cá thể BC2F1; 58: FL478, 59: AS996
Hình 15. Sàng lọc cá thểBC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị
RM10793 (bên trái), và RM10711 (bên phải).
1 10 20 30 40 50 59 FL AS
45
Bước phân tích xác định cây mang nhiều nền gen cây nhận đã được tiến hành với tổng số 48 chỉ thị SSR nằm rải rác trên 12 nhiễm sắc thể. Kết quả cho thấy các cây P307-322, P284-112 and P307-305 là những cây tốt nhất, mang từ 93.18% đến 94.03% nền gen cây nhận AS996. Ba cây này đã được sử dụng trong phép lai trở lại để tạo thế hệ BC3F1 tiếp theo. Mỗi cây sử dụng một nửa số bông cho lai trở lại và một nửa tự thụ tạo thế hệ BC2F2. Trong trường hợp sử dụng chọn giống truyền thống, tỉ lệ nền gen cây nhận đạt cao nhất là 87.5% trong thế hệ BC2F1, nhưng ở nghiên cứu này, tỉ lệ nền gen cây nhận thu được cao hơn từ 5.7- 6.5% so với chọn giống truyền thống.
3.3.3. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC3F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996/AS996 )
Từ kết quả phân tích cá thể thế hệ BC2F1, 3 cá thể mang tỉ lệ nền gen nhận cao nhất đã được lai trở lại tạo lập quần thể BC3F1 của tổ hợp AS996 mang Saltol.
Hình 16. Sàng lọc các thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996) sử dụng chỉ thị RM3412 (A), RM10711 (B), RM10793 (C), AP3206 (D) và
RM10694 (E). Làn gel 1: AS996, Làn gel 2: FL478.
Tổng số 371 cá thể đã được phân tích với các chỉ thị định vị trên vùng gel
Saltol. Phát hiện 94 cá thể mang gen đích được phân tích tái tổ hợp. Sàng lọc các
A
B
C
D
46
thể BC3F1(AS996/FL478/AS996/AS996/AS996) sử dụng chỉ thị RM3412, RM10711, RM10793, AP3206, và RM10694 trên hình 3.13. Phân tích ADN các cá thể tái tổ hợp mang gen đích với 63 chỉ thị phân tử SSR. Số liệu về kiểu gen của 14 cá thể được đưa vào phân tích bằng phần mền GGT2.0, đã xác định cá thể P284- 112-291 của quần thể BC3F1 là tốt nhất trong 5 cá thể tái tổ hợp P284-112-291, P307-305- 21, P284-112-195, P284-112-198, P284-112-213 mang nhiều nền di truyền cây nhận gen, cả 5 cây này đã được chọn cho quá trình chọn giống SALTOL- AS996 ở các thế hệ sau.
Sơ đồ nền gen của cá thể P284-112-291 thể hiện trên hình 3.14.: Tại các locut nằm ở vị trí của gen Saltol, cây P284-112-291 có băng màu xanh nhạt, thể hiện là mang locut dị hợp tử. Đối với các locut còn lại trên các NST, cây P284-112- 291 đều có các locut màu đỏ, thể hiện băng của locut cây nhận gen hay là nền gen của giống AS996. Như vậy, với 63 chỉ thị rải rác trên 12 nhiễm sắc thể của lúa, đã xác định được cây mang gen đích và mang tới 100% nền gen cây nhận gen. Ngoài
Hình 17 Bản đồ của câyBC3F1 - P284-112-291 phân tích bằng phần mềm GGT2.0
47
ra các dòng mang nền gen của giống nhận gen cao như P307-305- 21, P284-112- 195, P284-112-198, P284-112-213 cũng được giữ lại để chọn dòng và phát triển trong chọn giống. Những dòng này đã được thu hạt, đánh giá tính chống chịu mặn và một số chỉ tiêu nông sinh học và các yếu tố cấu thành năng suất để chọn ra những dòng triển vọng năng suất cao và có tính chịu mặn tốt.
3.3.4. Kết quả đánh giá tính chịu mặn các dòng chọn lọc
Thí nghiệm đánh giá tính chịu mặn ở thế hệ BC3F2, BC3F3 đã được tiến hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp theo như đã mô tả ở phần “2.3.4. Phương pháp đánh giá mặn nhân tạo”. Các dòng được đánh giá mặn tại nồng độ muối bằng EC=12dSm, tương đương mức nhiễm mặn NaCl = 60/00. Các dòng BC3F2 tham gia thí nghiệm đều có mức độ kháng tương đương giống FL478 mang vùng gen Saltol. Các dòng này được đưa ra ruộng gieo trồng để theo dõi đánh giá và thu hạt cho lần thí nghiệm tiếp theo.
Ở thế hệ BC3F3, các dòng chọn lọc được đưa vào đánh giá tính chịu mặn.
48
Hình 18 là hình ảnh các dòng lúa chọn lọc BC3F3có mang gen kháng được gieo trong khay và nuôi bằng môi trường dinh dưỡng Yoshida trước khi được thanh lọc mặn. Sau khi bổ sung muối vào môi trường, có thể ghi nhận triệu chứng về mặt hình thái của các dòng/giống. Đối với FL478, sau khi bổ sung muối thì dấu hiệu đầu tiên là hiện tượng cháy đầu lá nhưng mức độ ít nghiêm trọng hơn so với giống IR29, và sau đó là hiện tượng quăn đầu lá và 1-2 lá già nhất ở một số cây có hiện tượng chết. Trong quá trình thanh lọc, các cây chịu mặn phát triển bình thường. Những cây nhiễm mặn bị héo quăn lá và phát triển chậm (giống IR29).
Hình 19. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00 ). Trên mỗi khay thử: hàng 1: FL478; hang 10: IR29;
49
Hình 20: Kết thúc thí nghiệm thử mặn các dòng BC3F3ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00). Trên mỗi khay thử: hàng 1: AS996; hàng 2: FL478; hàng
10: IR29; Các hàng 3-9: Các dòng BC3F3 mang vùng gen Saltol
Ở hình 3.17, sau 14 ngày thanh lọc mặn, có sự khác biệt rõ ràng giữa giống bố mẹ: giống gốc AS996 nhiễm mặn bị héo quắt, cây chết và giống FL478 vẫn sinh trưởng tốt. Giống chuẩn nhiễm IR29 chết hết. Các dòng chọn ra từ dòng B291 cho phản ứng chống chịu tốt với mặn. Kết quả đánh giá ở bảng 2 cho thấy, mức chống chịu mặn của các dòng cho thấy dòng BC3F3 có mức chống chịu cao tương đương giống cho gen FL478. Chỉ có dòng B291-1-9 ở mức nhiễm vừa. Kết quả đánh giá được ghi nhận lại ở bảng 3.2
50
Bảng 9. Kết quả đánh giá mức chịu mặn của các dòngBC3F3 (AS996xFL478) theo tiêu chuẩn IRRI, 1997
STT Dòng Điểm Mức chống chịu 1 B291-1-1 3 KC 2 B291-1-2 3 KC 3 B291-1-3 3 KC 4 B291-1-4 3 KC 5 B291-1-5 3 KC 6 B291-1-6 3 KC 7 B291-1-7 3 KC 8 B291-1-8 3 KC 9 B291-1-9 5 NV 10 B291-1-10 3 KC 11 B291-1-11 3 KV 12 B291-1-12 3 KC 13 FL478 (ĐC kháng) 3 KC 14 AS996 7 N 15 IR29 (ĐC nhiễm) 7 N
Kết quả đánh giá mức chống chịu mặn của các dòng cho thấy dòng BC3F3 có mức chống chịu cao tương đương giống cho gen FL478. Chỉ có dòng B291-1-9 ở mức nhiễm vừa.
3.3.5. Đánh giá chỉ tiêu nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng chịu mặn
Các dòng lúa chọn lọc được gieo trồng trên ruộng để đánh giá các đặc tính nông sinh học: thời gian sinh trưởng, chiều caocây, số bchiều dài lá đòng, chiều dài
51
cổ bông và các yếu tố cấu thành năng suất như số khóm/bông, số hạt/bông, tỉ lệ số hạt chắc/bông; khối lượng 1000 hạt, năng suất.
Các số liệu được ghi nhận lại và tiến hành theo phương pháp hệ thống đánh giá chuẩn của IRRI. Số liệu được phân tích và xử lý bằng chương trình tính Excel và IRRISTART 5.0.
Bảng 10. Đặc tính nông sinh học của các dòng AS996-Saltol
(Vụ Xuân 2013) tại Hà nội
TT Tên dòng TGST (ngày) Chiều cao cây(cm) Chiều dài lá đòng (cm) Chiều dài cổ bông(cm) Chiều dài bông(cm) 1 B291-1 125 88,2±4,7 34,4±2,7 3,6 ± 1,4 23,6±0,9 2 B291-2 125 83,4±3,6 23,2±2,7 7,2±1,2 20,4±0,8 3 B291-13 125 81,0±3,0 25,1±2,6 7,0±1,4 21,9±1,4 4 B291-2-5 125 86,0±1,6 22,5±3,5 5,3±0,6 19,1±0,6 5 B291-1-10 125 99,6±2 26,1±2,5 4,7±0,4 25,8±1,4 6 B291-1-3 125 98,9±1,7 28,5±4,8 7,7±2,8 24,1±1,5 7 B291-2-2 125 104±3,1 31,2±2,6 6,2±1,6 24,1±1,3 8 B291-2-8 125 89,3±2,2 22±3,6 8,0±1,3 19,8±0,8 9 B291-2-7 125 96,3±2,3 27,1±4,8 5,8±1,9 22,5±0,6 10 B291-1-1 128 87,3±3,1 23,1±3,7 5,2±1,4 23,6±1,0 11 B291-2-15 125 89,8±5,0 22,7±3,2 3,6±0,9 20,3±1,6 12 B291-2-1 125 87,8±3,3 25,8±3,1 6,3±1,8 23,5±1,5 13 B291-2-3 125 85,8±1,7 23,2±3,9 5,5±2,2 20,1±0,9 14 B291-16 125 88,5±1,2 23,3±4,0 4,3±1,1 21,5±1,5 15 B291-1-9 130 92,7±1,5 26,2±2,1 5,2±1,3 23,8±0,9
52 16 B291-2-10 125 84,6±0,8 24,4±3,3 5,3±1,3 20,3±0,7 17 B291-14 125 85,4±1,1 26,7±3,3 5,1±1,1 20,8±0,9 18 B291-1-3 125 104,2±1,0 26,0±2,5 4,0±0,8 24,0±1,1 19 AS996 125 91,0±0,8 28,6±0,7 5,9±0,6 22±0,8 20 FL478 132 87,3±2,2 33,1±4,8 3,6±1,1 21±0,7
Bảng 11. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cúa các dòng AS996 – Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội
TT Tên dòng bông/khóm Số Số hạt/ bông lép(%) Tỉ lệ P1000 hạt(g) NSLT tạ/ha (tạ/ha) NSTT
1 B291-1 5,1 ± 0,7 147,2±36,1 3,27 27,03 88,20 53,37 2 B291-2 5,5±0,5 148,7±20,1 19,3 28,30 84,22 61,0 3 B291-13 5,4±0,5 144,8±23,4 25,3 26,60 70,01 58,0 4 B291-2-5 4,8±0,5 154,7±24,9 20,9 27,54 72,93 64,2 5 B291-1-10 5,0±0,7 171,1±34,4 18,16 25,50 64,23 51,13 6 B291-1-3 4,8±0,8 172,2±49,5 3,5 26,80 96,08 65,71 7 B291-2-2 5,8±0,9 155,7±51,5 4,2 24,28 94,09 63,26 8 B291-2-8 5,1±0,8 111,0±26,8 20,9 29,65 65,53 48,17 9 B291-2-7 4,0±0,9 129,2±60,6 1,9 26,13 59,52 43,12 10 B291-1-1 4,6±0,9 144,6±40,2 2,9 28,05 81,75 59,43 11 B291-2-15 4,3±0,5 133,3±20,7 23,2 27,30 53,95 40,21 12 B291-2-1 4,3±0,5 144,2±15,1 14,5 26,98 64,27 47,31 13 B291-2-3 4,5±0,5 160,2±25,4 25,1 29,00 69,61 49,23 14 B291-16 4±0,4 118,2±30,4 8,7 29,10 56,43 42,81 15 B291-1-9 4,1±0,7 154±35,3 15,9 29,98 71,63 66,32
53 16 B291-2-10 4,3±0,5 160,3±29 19,2 28,50 71,29 66,00 17 B291-14 4,4±0,8 110,7±30,4 13,5 28,40 53,99 40,62 18 B291-1-3 4,9±0,8 123,9±21,6 6,4 30,78 78,77 67,20 19 AS996 4,7±0,6 145,2±21,9 23,6 26,60 62,32 51,30 20 FL478 4,6±0,5 140,7±24 9,0 28,63 75,50 60,45 CV% 1,50 LSD0,5 2,22
Kết quả ở bảng 3.4, 3.5 cho thấy thời gian sinh trưởng của các dòng biến động từ 125 ngày đến 132 ngày trong vụ xuân 2013. Chiều cao cây thay đổi từ 81,0 đến 104 cm. Chiều dài bông thay đổi từ 19,1 đến 25,8 cm. Số bông/khóm thay đổi từ 4,1 đến 5,8 bông/khóm. Số hạt/bông biến động từ 110,7 đến 193,3 hạt/bông. Tỉ lệ lép biến động từ 2,5% đến 25,94%. Năng suất thực tế của các giống tham gia thí nghiệm nói chung là khá, trong khoảng 40,21 đến 67,2 tạ/ha.Trong đó, các dòng có năng suất cao như B291-1-3, B291-1-9, B291-2-10, B291-2-2, B291-1-3a, B291-2- 5 sẽ được tiếp tục đánh giá tính chịu mặn và phát triển dòng chọn giống ở thế hệ tiếp theo.
54
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận
Sàng lọc đa hình giống cho gen và nhận gen đã được tiến hành trên 500 chỉ thị SSR, trong đó đã được xác định 63 chỉ thị. Kết quả này cho thấy tỉ lệ đa hinh ADN của hai giống AS996/FL478 là rất thấp khi sử dụng các chỉ thị phân tử SSR.
Hai cá thể của thế hệ BC1F1 là P284 và P307, có hàm lượng nền gen cây nhận cao nhất từ 89.06 đến 86.36% tương ứng, cao hơn so với chọn giống MAS và chọn giống truyền thống 16-19%. Hai cá thể này đã được sử dụng cho việc thiết lập thế hệ BC2F1.
Trong thế hệ BC2F1, ba các thể có hàm lượng hệ gen giống nhận gen là đến 93,18 đến 94,03 % đã được xác định bằng cách sàng lọc ADN và đã được sử dụng cho việc thiết lập quần thể BC3F1
Cá thể P284-112-291 tốt nhất của thế hệ BC3F1 đã được sàng lọc mang gần 100% hàm lượng hệ gen cây nhận gen khi khảo sát 63 chỉ thị cho đa hình.
Đánh giá tính chịu mặn nhân tạo thế hệ BC3F2 và BC3F3 cho thấy các dòng phát triển từ cá thể P284-112-291 có tính chịu mặn tương đương giống cho gen kháng FL478.
Đánh giá đặc tính nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất cho thấy các dòng phát triển từ cá thể P284-112-291, có năng suất cao như B291-1-3, B291-1-9, B291-2-10, B291-2-2, B291-1-3a, B291-2-5 sẽ được tiếp tục đánh giá tính chịu mặn và phát triển dòng chọn giống ở thế hệ tiếp theo.
Đề nghị
Các dòng có tính chịu mặn cao, chứa locut gen Saltol và có đặc tính nông sinh học tốt sẽ tiếp tục được nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử, đánh giá mặn nhân tạo, kết hợp với chọn giống truyền thống để tạo các dòng AS996-Saltol góp phần vào công tác chọn tạo giống lúa chi ̣u mặn cho các vùng đồng bằng thường xuyên bi ̣ xâm nhập mặn góp phần tạo giống lúa chịu mặn để ứng phó với biến đổi khí hậu.
55
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Hữu Ất (2005), “Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tạo giống lúa chịu mặn cho vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ”, TT Khoa học và Công nghệ Hạt nhân, 4/2005, Tr. 28-30.
2. Bộ Tài nguyên Môi trường (2012), Kịch bản Biến đổi khí hậu nước biển dâng cho Việt Nam.
3. Tăng Thị Hạnh, Dương Thị Hồng Mai, Trần Văn Luyện, Phạm Văn Cường, Lê Khả Tường, Phan Thị Nga (2011), “Nghiên cứu khả năng chịu mặn của một số nguồn gen lúa lưu giữ tại ngân hàng gen cây trồng quốc gia”.
4. Lê Sâm (2003), Xâm nhập mặn ở đồng bằng Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp.
5. Lê Duy Thành (1999), “Kỹ thuật PCR và ứng dụng của nó trong chọn giống thực vật”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, Tr. 156-158.
6. Nguyễn Thị Tâm và cs (2008), “Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa OM4498, VND 95-20, IR64, CR203 ở mức độ mô sẹo bằng phương pháp nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ.
7. Lê Thị Thu Trang (2011), “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam”, Tạp chí Khoa hoc Công nghệ.
Tài liệu tiếng Anh
8. Awala, S.K., Nanhapo P.I., Sakagami, J., Kanyomeka, L., and Iijima, M. (2010), “Differential salinity tolerance among Oryza glaberrima, Oryza sativa
and their Interspecies including NERICA”, Plant Prod. Sc. 13 (1), pp. 3-10.
9. Aslam, M., Qureshi R. H., and Ahmad (1993), “Mechanisms of salinity tolerance in rice (Oryza sativa L.)”, Department of soil science and physiology, University of Agriculture, Pakistan.
10. Bonille P., Dvorak J., Mackill D.J., Deal K. and Gregorio G.(2002), “RFLP and SSLP mapping of salinity tolerance genes in chromosome 1 of rice (Oryza sativa L.) using recombinant inbred lines”, Philipp. Agric. Sci, 85, pp. 64–76.
11. Akbar M, GS Khush, D HilleRisLambers (1985), “Genetics of salt tolerance”, Rice Genetics, IRRI Philippines, pp. 399-409.
56
12. Collar BCY, amd DJ Mackill (2008), “Marker-aided selection: an approach for precision plant breeding in the twenty first century”, Philos. Trans. R. Soc. Lond.B. Biol.Sci. 363, pp. 557-572.
13. Dat J, S Vandenabeele, E Vranova, M Van Montagu, D Inze, F Van Breusegem (2000) “Dual ction of the active oxygen species during plant stress responses”, Cell Mol Life Sci 57, pp. 779-795.
14. Bert Collard & David Mackill (1998), “Conserver AND drives polymorphirm(CDDP): A simple and novel method for generating AND marker in plant”, Journal plant Biology (27), pp. 558-562.
15. FAO (Food and Agriculture Organization) (2010), “Report of salt affected agriculture. Link access”, (http://www.fao.org/ag/agl/agll/spush/, latest