Nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích sàng lọc Calux trong đánh giá mức độ ô nhiễm Dioxin trong môi trường tại một số khu vực ô nhiễm nặng ở Việt Nam

Đặc trưng này làm cho dioxin có một tính chất vô cùng nguy hiểm đối với con người và động vật là khả năng tích tụ sinh học.Nếu dioxin đi vào cơ thể, chúng sẽ không bị bài tiết ra ngoài m

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2014

Chuyên ngành: Hóa môi trường

Em xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị và các bạn đồng nghiệp phòng thí nghiệm Dioxin, Trung tâm Quan trắc Môi trường, Tổng cục Môi trường đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn

ở bên động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình

Cuối cùng, em xin cảm ơn Ban quản lý Dự án xây dựng Phòng thí nghiệm Dioxin (Tổng cục Môi trường), Đề tài KHCN-33.01/11-15(thuộc chương trình nghiên cứu Khoa học và Kĩ thuật quốc gia KHCN-33/11-15-Nghiên cứu và khắc phục hậu quả lâu dài của chất độc da cam/Dioxin đối với môi trường và sức khỏe con người Việt Nam), Dự ánHợp tác khoa học và công nghệ vì sự phát triển bền vững của Nhật Bản (Science and Technology Research Partnership for Sustainable Development -SATREPS)đã giúp đỡ em hoàn thành luận văn này

Hà nội, 24/11/2014 Học viên

Nguyễn Thị Mơ

4

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của các chất dioxin và các hợp chất tiêu biểu về độ độc 3

Hình 1.2 Sơ đồ tác động sinh học của dioxin………… ……… …….….8

Hình 1.3 Cơ chế hình thành dioxin trong sản xuất chất diệt cỏ……….9

Hình 1.4 Sơ đồ nguyên tắc của phương pháp CALUX ……… ….24

Hình 2.1 Các khu vực ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa ……….……… 31

Hình 2.2 Các khu vực ô nhiễm tại sân bay Đà Nẵng……… ……… 32

Hình 2.3 Phương pháp lấy mẫu đất dưới bề mặt ……… 34

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chiết tách và làm sạch mẫu đất……… ………… 37

Hình 2.5 Quy trình làm sạch mẫu bằng hệ làm sạch bán tự động ………… 38

Hình 2.6 Quy trình thí nghiệm CALUX……… 39

Hình 3.1 Đường chuẩn phân tích CALUX ……… … 41

Hình 3.2 Đồ thị tương quan ln[TCDD*100] và RLU của tế bào ………… …43

Hình 3.3 Đồ thị so sánh hai phương pháp HRGCMS và CALUX…….…… 46

Hình 3.4 Sơ đồ vị trí lấy mẫu tại khu vực Pacer Ivy, sân bay Biên Hòa …… 48

Hình 3.5 Biểu diễn nồng độ dioxin tại các vị trí lấy mẫu ……….50

Hình 3.6 Sơ đồ vị trí lấy mẫu tại sân bay Đà Nẵng ……….… 52

Hình 3.7 Biểu diễn vị trí đất bị nhiễm dioxin vượt ngưỡng cho phép …… 53

Hình 3.8 Phân bố giá trị nồng độ TEQ tại khu vực phía Tây/Pacer Ivy… … 55

Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn nồng độ phân bố theo chiều sâu của mẫu…… ….56

Hình 3.10 Sơ đồ tiến trình xử lý bằng công nghệ giải hấp nhiệt ………… ….62

Hình 3.11 Sơ đồ cơ sở hệ thống IPTD ……… … 63

Hình 3.12 Sơ đồ đơn giản máy nghiền bi ……….……… 68

Hình 3.13 Sơ đồ quy trình công nghệ MCD ……….…68

5

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các nhóm đồng loại của PCDD và PCDF ……….… 4

Bảng 1.2 Giá trị hệ số độc của các PCDD, PCDF tiêu biểu……… 5

Bảng 1.3 Số lượng chất độc hóa học được sử dụng tại miền Nam Việt nam….15 Bảng 1.4.Các phương pháp sinh học xác định dioxin……… ….….20

Bảng 3.1 Nồng độ các dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn………… …… 40

Bảng 3.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn thực tế ……….… ….….42

Bảng 3.3 Kết quả phân tích xác định LOD/LOQ của phương pháp CALUX ……… …43

Bảng 3.4 Kết quả phân tích kiểm tra chéo giữa Việt Nam và Nhật Bản … 45

Bảng 3.5 Kết quả phân tích mẫu đất tại khu vực Pacer Ivy, sân bay Biên Hoà 49

Bảng 3.6 Kết quả phân tích mẫu đất theo độ sâu tại khu Pacer Ivy sân bay Biên Hoà 51

Bảng 3.7 Kết quả phân tích mẫu đất tại sân bay Đà nẵng 53

Bảng 3.8 Các điểm nóng ô nhiễm dioxin tại sân bay Đà Nẵng ………58

Bảng 3.9 Sàng lọc công nghệ/phương pháp cho xử lý đất nhiễm dioxin tại Việt Nam 59

Bảng 3.10 Nồng độ PCB và dioxin trong đất trước và sau xử lý bằng ISTD……… 65

Bảng 3.11 Nồng độ PCB và dioxin trong đất trước và sau xử lý bằng ISTD tại Mỹ… 65

6

BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Kí hiệu Giải thích

ADN Axit DeoxyriboNucleic

ARNT Thể vận chuyển AhR trong nhân

AhR Aryl hydrocarbon Receptor

CALUX Chemical-Activated LUciferase gene eXpression DRE Yếu tố đáp ứng dioxin (Dioxin Responsive Element) HRGC High Resolution Gas Chromatography

HRMS High Resolution Mass Spectrometry

Hsp90 Protein sock nhiệt 90 kDa

ISTD Giải hấp nhiệt tại chỗ (In-Situ Thermal Desorption) IPTD Giải hấp nhiệt trong mố (In-Pile Thermal Desorption) MCD Công nghệ hóa cơ (MechanoChemical Destruction) OCDD Octachlorodibenzo-p-dioxin

PCB Polychlorinated biphenyl

PCDD Polychlorinated dibenzo-p-dioxin

PCDF Polychlorinated dibenzofuran

TCDD Tetrachlorodibenzo-p-dioxin

TEF Hệ số độc (Toxic Equivalency Factor)

TEQ Độ độc tương đương (Toxic Equivalency Quantity)

1

MỞ ĐẦU

Dioxin là một nhóm các hợp chất hóa học được đưa vào danh sách các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy (Persistant Organic Pollutant-POP)[39] Dioxin được sinh ra một cách không chủ định và tồn tại như là một sản phẩm phụ của các quá trình hoạt động, sản xuất công nghiệp khi cómặt chấtclo Do phân tử của các chất dioxin có cấu trúc gồm hai mạch vòng và có sự góp mặt của clo nên chúng rất ổn định và do đócó thểtồn tại một cách bền vững trong môi trường Mặt khác, các phân tửdioxin đều không phân cực; vì thế, chúng không tan trong nước và các dung dịch điện ly, nhưng lại tan trong dung môi hữu cơ và trong mỡ Đặc trưng này làm cho dioxin có một tính chất vô cùng nguy hiểm đối với con người và động vật là khả năng tích tụ sinh học.Nếu dioxin đi vào cơ thể, chúng sẽ không bị bài tiết ra ngoài

mà sẽ tích tụ lại trong các mô mỡ và tế bào cơ thể sống gây ra các tác động đến các quá trình sinh hóa của cơ thể.[10]

Tại Việt Nam,trong suốt những năm từ năm 1961 đến năm 1971, quân đội

Mỹ đã tiến hành cuộc chiến tranh hóa học lớn nhất trong lịch sử, sử dụng khoảng 80 triệu lít chất độc hóa học trong đó chứa ít nhất 366 kg chất dioxin[26] Những gì để lại sau cuộc chiến là sự tồn lưu của dioxin trong môi trường và đặc biệt ở một số khu vực lượng dioxin tồn lưu trong đất là vô cùng lớn với nồng độ cỡ vài nghìn, vài chục nghìn hay thậm chí là hàng trăm nghìn pg-TEQ/g mẫu Các khu vực này đã trở thành điểm nóng ô nhiễm nặng dioxin tại Việt Nam Sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng và Phù Cát là những khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề nhất của chất độc hóa học/dioxin Đây là những khu vựctrước đây thuộc căn cứ không quân của quân đội

Mỹ và được sử dụng để tập kết, pha trộn, lưu trữ và chuẩn bị cho phun rải Đặc biệt tại đâyđã từng xảy ra những vụ rò rỉ lớn các chất độc hóa học ra môi trường gây hậu quả ô nhiễm nghiêm trọng cho đến tận ngày nay [9]

Vấn đề đánh giá, khảo sát và xử lý ô nhiễm dioxin đang là chủ đề thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học, chính phủ cũng như nhân dân Việt Nam

CALUX (Chemically Activated LUciferase eXpression) để xác định nhanh nồng độ

các chất dioxin trong đất tại khu vực điểm nóng và nghiên cứu đề xuất phương án

xử lý ô nhiễm thích hợp cho từng khu vực

Vì vậy, với đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích sàng lọc CALUX trong đánh giá mức độ ô nhiễm dioxin trong môi trường tại một số khu vực ô nhiễm nặng tại Việt Nam và đề xuất giải pháp xử lý ô nhiễm tại khu vực này”, tôi hi vọngcác kết quả đạt được sẽ đóng góp một phần nhỏ vào lĩnh vực

nghiên cứu và xử lý ô nhiễm dioxin tại Việt Nam hiện nay

3

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ DIOXIN VÀ CÁC TÁC ĐỘNG CỦA DIOXIN TỚI SỨC KHOẺ CON NGƯỜI VÀ MÔI TRƯỜNG

1.1.1 Khái niệm về Dioxin

Các tính chất lý – hóa của dioxin

Dioxin được biết đến như là tên gọi chung của một nhóm các hợp chất hóa học có cấu tạo chung gồm các nhóm hydrocacbon mạch vòng liên kết với clotồn tại bền vững trong môi trường cũng như trong cơ thể con người và các sinh vật khác

Dioxin bao gồm 75 chất đồng loại PCDD (Polyclorodibenzo-p-dioxin) và 135 chất

đồng loại PCDF (Polychlorodibenzofuran).[17]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của các chất dioxin và các hợp chất tiêu biểu về độ độc

Tùy thuộc vào số nhóm thế clo trong phân tử mà người ta chia các hợp chất PCDD/PCDF thành 8 nhóm chất như sau:

Các chất dioxin là những hợp chất có tính bền vững cao và được tìm thấy trong không khí, đất, nước, trầm tích, động vật và thức ăn Độc tính của chúng rất khác nhau tùy vào cấu trúc của mỗi phân tử, các phân tử có độ độc cao là các phân

tử chứa nguyên tử clo ở các vị trí thế 2,3,7,8, trong đó bao gồm 7 chất PCDD và 10 chất PCDF

Khái niệm về hệ số độc (Toxicity Equivalency Factor-TEF) của các chất dioxin được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đưa ra, hệ số độcđược xác định dựa trêndựa trên những nghiên cứu vềtác dụng của chất dioxin với cơ thể sống và những biểu hiện xấu do nó gây ra Chất 2,3,7,8-TCDD là chất được cho là có độc tính cao nhất được biết đến và được quy ra hệ số độc cao nhất là 1, tính độc của các dioxin

và các hợp chất liên quan khác được biểu thị dưới dạng một phân số của độc tính qui cho TCDD

5

Bảng 1.2 Giá trị hệ số độc của các PCDD, PCDFtiêu biểu [40]

(*) giá trị TEF được qui định bởi WHO (2005)

Các chất dioxin là các chất không màu, không mùi, có nhiệt độ sôi tương đối cao Các đồng loại này tồn tại ở trạng thái rắn ở điều kiện bình thường Một số tính chất chính của các chất dioxin như sau: áp suất hơi thấp (từ 4,0×10-8 mm Hg đối với 2,3,7,8-TCDD đến 8,2×10-13 mm Hg đối với OCDD);độ tan trong nước rất thấp (19,3 ng/L đối với 2,3,7,8-TCDD);độ tan trong dung môi/ chất béo (log Kow có giá trị từ 5,6 đối với TCDF và 6,1/7,1 đối với TCDD đến 8,2 đối với OCDD); liên kết

ưu tiên với các thành phần hữu cơ trong đất và trầm tích (giá trị log Koc của 2,3,7,8-TCDD trong khoảng 6,4 - 7,6).[17]

Đặc tính ưa mỡ (lipophilic) và kỵ nước (hydrophobic) của dioxin liên quan chặt chẽ đến độ bền vững của chúng trong cơ thể sống cũng như trong tự nhiên và

sự phân bố của chúng trong các cơ quan của cơ thể Đặc tính ưa mỡ của dioxin làm cho nó có khả năng tích lũy trong các mô mỡ của cơ thể với thời gian bán hủy từ 7-

12 năm Chúng cũng đồng thời được tích lũy sinh học trong các cơ thể động vật là

6

nguồn thực phẩm cho con người Trong môi trường, thời gian bán hủy của các hợp chất dioxin trong các lớp đất bề mặt và sâu hơn dưới bề mặt khoảng 9 - 12 và 25 -

100 năm và trong trầm tích thời gian bán hủy lên tới hàng trăm năm.[10]

Dioxin rất bền vững, không bị phân huỷ bởi các axít mạnh, kiềm mạnh, các chất oxy hoá mạnh khi không có chất xúc tác ngay ở cả nhiệt độ cao Dioxin không

bị thuỷ phân trong nước ở điều kiện bình thường Dioxin có nhiệt độ nóng chảy khá cao, nhiệt độ sôi của 2,3,7,8-TCDD lên tới 412oC, các quá trình cháy tạo dioxin cũng xảy ra ở khoảng nhiệt độ khá cao Nhiệt độ 750 - 900oC vẫn là khoảng nhiệt

độ tạo thành 2,3,7,8-TCDD; ngay cả ở nhiệt độ 1200oC, quá trình phân huỷ dioxin vẫn là quá trình thuận nghịch Dioxin chỉ bị phân huỷ hoàn toàn ở khoảng nhiệt độ

1200 - 1400oC và cao hơn.[17]

Dioxin có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua các con đường hô hấp, tiêu hóa

và qua da Trong đó, các kết quả nghiên cứu trên động vật thực nghiệm cho thấy dioxin xâm nhập qua đường tiêu hóa tốt hơn qua da Khả năng xâm nhập của dioxin qua đường hô hấp có thể ngang với qua đường tiêu hóa Khả năng xâm nhập của dioxin vào cơ thể phụ thuộc vào cấu trúc của chúng, trong đó chất 2,3,7,8-TCDD là

có khả năng xâm nhập cao hơn so với các đồng loại khác.[10]

Đặc tính sinh học của dioxin

Hiện nay vẫn chưacó bằng chứng rõ ràng về cơ chế gây độc của các chất dioxin Mặc dù vậy, nhiều ý kiến nhất trí rằng thụ thể hydrocarbon thơm (aryl hydrocarbon receptor-AhR) đóng một vai trò trung gian trong cơ chế tác động của dioxin đối với cơ thể sống AhR là một protein đóng vai trò nhân tố phiên mã (transcription factor) tham gia vào quá trình điều hoà các đáp ứng sinh học đối với hydrocarbon thơm Thụ thể AhR khi được hoạt hoá bởi hydrocarbon thơm sẽ kích hoạt quá trình biểu hiện gen và sinh tổng hợp các enzym nhóm cytochrom P450, đây là các enzym tham gia trong quá trình chuyển hoá chất ngoại lai như hydrocarbon thơm

tử Ngoài ra nó ổn định thụ thể khi có shock nhiệt, bảo vệ thụ thể khỏi sự thuỷ phân

và đặc biệt là ngăn sự liên kết sớm với ARNT XAP2 đóng vai trò ngăn chặn sự vận chuyển AhR chưa liên kết phối tử vào trong nhân bằng cách che chắn chuỗi amino axit định vị nhân trên AhR

Sau khi liên kết với phối tử như dioxin, chaperon XAP2 tách ra khỏi phức hợp dẫn đến việc AhR dịch chuyển qua màng nhân Khi đã ở trong nhân, cặp Hsp90 được giải phóng, cho phép AhR dimer hoá với thể vận chuyển AhR trong nhân (ARNT) Phức hợp AhR/ARNT đã được hoạt hoá bởi phối tử dioxin sau đó có khả năng tương tác với ADN bằng sự liên kết với chuỗi DRE (yếu tố đáp ứng dioxin) trong vùng khởi động (promoter) của các gen đáp ứng AhR, dẫn đến sự biểu hiện (phiên mã và dịch mã) của các gen này

Khi có mặt dioxin, dioxin sẽ liên kết trực tiếp với các AhR tạo thành phức hợp khởi động quá trình liên tiếp phosphoryl hóa/khử phospho, từ đó dẫn tới việc hoạt hóa các yếu tố sao chép gen, điều biến quá trình biến đổi tín hiệu và biểu hiện gen Các đáp ứng sinh học bất thường dẫn đến các tác động kích thích hoặc kìm hãm sự sao chép của hàng loạt các gen khác nhau và gây ra những tổn thương về bệnh lý như hoại tử tế bào, chết tế bào, tăng sản, giảm sản hoặc loạn sản ở tế bào Các dioxin còn làm biến đổi sao chép và giải mã của các gen bao gồm: gen gây ung thư, gen mã hóa và các yếu tố tăng trưởng, các hocmon, các enzyme chuyển hóa thuốc như CYP1A1,CYP1A2, CYP1B1 là những đáp ứng nhạy nhất thấy được ở động vật và cả người bị phơi nhiễm dioxin.[24]

8

Hình 1.2 Sơ đồ cơ chế tác động sinh học của dioxin

Sự hình thành của dioxin trong môi trường

Trong tự nhiên, dioxin có thể được sinh ra do quá trình đốt cháy các vật chất hữu cơ không hoàn toàn như cháy rừng hay núi lửa phun Tuy nhiên, nguồn sinh ra dioxin chủ yếu là sản phẩm không chủ định trong các hoạt động của con người tạo

ra và giải phóng vào môi trường trong các quá trình đốt cháy (thiêu hủy rác thải, chất thải, đốt chấy gỗ, đốt cháy nhiên liệu hóa thạch…), trong các hoạt động công nghiệp, sản xuất, sử dụng, hủy bỏ một số hóa chất nhất định (sản xuất và sử dụng chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu…), trong các quá trình tẩy trắng bột giấy và trong quá trình sản xuất, tái sử dụng một số kim loại.[10]

Ở Việt Nam, nguồn dioxin được quan tâm và chú ý lớn là do hậu quả của cuộc chiến tranh hóa học của quân đội Mỹ thực hiện trong những năm 1961-1971 Trong giai đoạn này quân đội Mỹ đã tiến hành phun rải hàng trăm triệu lít chất diệt

cỏ mà trong đó chứa hàng trăm kg chất độc dioxin xuống miền Nam Việt Nam

9

1.1.2 Dioxin từ chất độc da cam

Chất độc da cam là tên gọi tên gọi của một loại thuốc diệt cỏ và làm rụng lá cây được quân đội Mỹ sử dụng tại Việt Nam trong Chiến dịch Ranch Hand, một phần của chiến tranh hóa học của Mỹ trong thời kỳ Chiến tranh Việt Nam từ năm

1961 tới 1971

Dioxin trong chất độc da cam được tạo thành do quá trình sản xuất chất 2,4,5-trichlorophenoxyacetic (chất 2,4,5-T) trong chất diệt cỏ theo sơ đồ sau:

Hình 1.3 Cơ chếhình thành dioxin trong sản xuất chất diệt cỏ

Do cơ chế hình thành dioxin theo sơ đồ trên nên tỷ lệ 2,3,7,8-TCDD đối với nguồn dioxin từ chất độc da cam là rất lớn, nó chiếm khoảng 80-98%, đây là một thông số có thể sử dụng để phân biệt dioxin từ chất da cam với các nguồn khác

Tùy thuộc vào thời gian và công nghệ sản xuất của từng nước, từng nhà máy

mà hàm lượng dioxin trong chất da cam rất khác nhau Theo số liệu nghiên cứu của một số tác giả thì dioxin trong chất diệt cỏ sản xuất trong những năm 60 là rất lớn: 30-40ppm, 70ppm thậm chí đến 100ppm Vì vậy việc đánh giá lượng dioxin ở miền Nam Việt Nam do chiến tranh hóa học để lại rất phức tạp vàrất khác nhau.[9]

1.1.3 Dioxin và tác động tới sức khoẻ con người

Con người có thể bị phơi nhiễm dioxin thông qua một vài con đường như hít thở các hạt lơ lửng chứa dioxin trong không khí, hấp thụ qua da hay tiêu thụ thực

10

phẩm có chứa dioxin Người bị nhiễm dioxin cơ thể bị mắc các chứng bệnh như sinh con bị dị tật, bất thường thai sản, ung thư, bệnh lý hệ thống hô hấp, miễn dịch, bệnh lý di truyền, da, nội tiết, thần kinh…

Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất dioxin tới sức khỏe con người Các ảnh hưởng này bao gồm:

Dioxin có thể gây rối loạn hệ miễn dịch của con người

Hệ miễm dịch là hệ thống có vai trò đáp ứng miễn dịch chống lại (loại bỏ) các chất lạ xâm nhập hay mới biến đổi khác trạng thái bẩm sinh xuất hiện trong cơ thể để bảo toàn sự hằng định nội môi của cơ thể Khi chịu tác động của dioxin, hệ miễn dịch có thể bị dối loạn và gây ra những biến chứng bất thường cho cơ thể

Các nghiên cứu về dioxin cho thấy chất này có làm giảm khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể, làm tổn thương phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào thong qua khả năng gây độc tế bào lympho T và miễn dịch dịch thể thong qua các

cơ chế ức chế các lympho B biệt hóa sinh kháng thể.[10]

Việc nghiên cứu tác động của dioxin tới hệ miễn dịch đã được nghiên cứu trên các loài động vật trong phòng thí nghiệm và cả trên những người bị nhiễm dioxin

Dioxin có thể gây ra hiện tượng teo tuyến ức trên động vật thí nghiệm như: trên khỉ (Mc Connell và cộng sự, 1978), trên chuột cống trắng (Fan F và cộng sự, 1996), trên chuột nhắt (Hanberg và cộng sự, 1998)[31]…

Dioxin có thể gây ức chế miễn dịch dẫn đến tăng tỷ lệ nhiễm bệnh trùng và ung thư Theo Burleson và cộng sự, thì sức đề kháng chống virut cúm giảm ở chuột nhắt cũng giống như nhận xét của Yang Y G và cộng sự trên chuột cống.Một số nghiên cứu trên người bị nhiễm dioxin cũng được thực hiện Theo Tonn và cộng sự (1996) chứng minh có hiện tượng ức chế đáp ứng miễn dịch với KN dị gen của tế bào lympho người ngay cả khi thúc mạnh với IL2 ngoại sinh…[10]

11

Tuy nhiên cũng có nhiều nghiên cứu cho rằng dioxin không gây ảnh hưởng tới hệ thống miễn dịch của con người Vì vậy hiện nay nhiều nhà khoa học vẫn đang tiếp tục các nghiên cứu về các tác động của dioxin lên hệ miễn dịch

Dioxin tác động lên máu và hệ tạo máu

Nhiều nghiên cứu cho rằng dioxin có khả năng gây các bệnh ác tính hệ tạo máu thông qua trung gian là các gốc tự do dẫn tới các tổn thương ADNdo cơ chế oxy hóa

Thực nghiệm trên động vật chỉ ra sự biến đổi của các chỉ số máu ngoại vi và tuỷ xương sau khi nhiễm dioxin Sau khi uống liều duy nhất 10 µg/kg dioxin, người

ta thấy có biểu hiện tăng nồng độ hemoglobin và hematocrit ở chuột cống Ngoài ra còn quan sát thấy có biểu hiện giảm số lượng bạch cầu và tiểu cầu Biểu hiện thiếu máu nhẹ xuất hiện ở khỉ Rhesus sau khi uống liều duy nhất 25 µg/kg Nhiễm dioxin với liều duy nhất còn gây hiện tượng ức chế sinh sản tế bào gốc tạo máu, giảm số lượng bạch cầu lympho có hồi phục [10]

Nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy có sự liên quan giữa dioxin và các bệnh hệ tạo máu như: u lympho Hodgkin và không Hodgkin, đa rối loạn chuyển hoá porphyrin Dioxin cũng gây ra các bất thường của tuỷ sinh máu với sự giảm sinh hoặc rối loạn về hình thái của các tế bào sinh máu Tuy nhiên các kết quả nghiên cứu trên người vẫn chưa thống nhất về mức độ ảnh hưởng và hậu quả bệnh

lý sau khi bị phơi nhiễm dioxin.[10]

Dioxin tác động tới hệ thống enzym, chuyển hoá chất, nội tiết, thần kinh và tâm thần

Dioxin có tác động lên sự hoạt động của các enzym chuyển hoá liên quan đến chuyển hoá năng lượng tế bào, carbohydrat, lipid và amino acid cũng như các enzym chuyển hoá thuốc Sự thay đổi kéo dài của hoạt độngcác enzym này ảnh hưởng trực tiếp tới chức năng gan, rối loạn chức năng gan, suy giảm chuyển hoá năng lượng Ảnh hưởng độc của các loại chất dioxin là làm tăng lipid máu, giảm

Dioxin ảnh hưởng tới hệ dẫn truyền thần kinh, làm mất chức năng thần kinh, tâm thần Những biểu hiện của người bị nhiễm dioxin có thể gồm: đau nhói dây thần kinh, tê chân tay, đau đầu, rối loạn tinh thần [10]

Tác động của dioxin tới sức khoẻ sinh sản

Các vấn đề về nghiên cứu tác động của dioxin tới hệ thông di truyền và sức khoẻ sinh sản đã được chú ý từ rất lâu và đã có nhiều công trình nghiên cứu Tuy nhiên vấn đề này chậm được phổ biến và thừa nhận

Y văn Thế giới hiện nay đề cập đến tác hại của dioxin trên các loài vật trong phòng thí nghiệm nhiều hơn là trên con người Đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của dioxin tới thai nhi và sức khoẻ sinh sản nhưng chúng vẫn chưa đủ các bằng chứng thuyết phục nên theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ảnh hưởng của dioxin tới sức khoẻ sinh sản của con người là chưa xác thực

Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cho thấy dioxin ảnh hưởng tới sức khoẻ sinh sản ở các loài vật nghiên cứu như sau: tác động lên sự phát triển(gây chết, chậm tăng trưởng, biến dạng cấu trúc, rối loạn chức năng các hệ cơ quan…), tác động lên sự sinh sản: ảnh hưởng lên sự sinh tinh, sự di động của tinh trùng, hình dạng tinh trùng, chu kỳ kinh, nồng độ một số hormon, hành vi tình dục, khả năng thụ thai…[10]

Ngoài ra, nhiều nhà nghiên cứu còn cho rằng chất độc dioxin gây ra các tai biến sinh sản, dị tật bẩm sinh ở trẻ em có cha hoặc mẹ bị nhiễm dioxin.Kết quả khảo sát 28817 gia đình cựu chiến binh có chất độc da cam/dioxin ở nước ta thì số gia đình có có con bị dị tật bẩm sinh là 1604 gia đình chiếm 5,69 %, trong khi đó

13

khảo sát 19076 gia đình không bị nhiễm chất độc da cam/dioxin thì tỷ lệ gia đình có con bị dị tật bẩm sinh là 356 gia đình, chiếm 1,87 % Như vậy, số gia đình bị nhiễm chất độc da cam/dioxin có con bị dị tật bẩm sinh gấp hơn 3 lần số gia đình không bị nhiễm chất độc da cam/dioxin.[1]

1.1.4 Dioxin và tác động tới môi trường sinh thái

Trong môi trường sinh thái, dioxin ít hoà tan trong nước nhưng khả năng hấp thụ vào đất lại khá cao Khi xâm nhập vào đất, dioxin kết hợp với các chất hữu cơ biến thành các phức chất không hoà tan trong nước và ít bị rửa trôi, do vậy, những lớp đất có lượng mùn cao ở khu vực nhiễm độc dioxin có khả năng tích tụ dioxin nhiều nhất Dioxin có thể chuyển rời ra khỏi những nơi tích tụ ban đầu nếu khu vực đất nhiễm dioxin bị sạt lở, và theo dòng nước cuốn đi xa, tạo thành những khu vực nhiễm độc mới

Những nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã khẳng định tính khó tiêu huỷ của dioxin trong môi trường với chu kỳ bán huỷ lên tới hàng chục năm Thực tế ở nước ta cho thấy chu kỳ bán huỷ của dioxin có khả năng còn hơn thế nữa Gần 30 năm sau chiến tranh, di chứng của dioxin vẫn hiển hiện trên nhiều vùng lãnh thổ Có những khu rừng rậm nhiệt đới vốn giàu có về đa dạng sinh học, sau khi

bị phun rải chất độc da cam/dioxin, hệ sinh thái rừng bị phá hủy nghiêm trọng và cho đến nay chúng vẫn chưa thể tự hồi phục

Những nghiên cứu trên cơ thể thực vật cho thấy, khi bị phun rải chất độc da cam/dioxin, cơ thể thực vật sẽ có những phản ứng sinh lý, như xuất hiện nhiều u nổi trên lá, một số thay đổi khá rõ nét về hình dáng thân, cành, lá, hoa và quả, nhiều trường hợp dẫn tới rụng lá Nếu cây không mọc lá trở lại, có nghĩa là chấm dứt sự quang hợp, dẫn đến chết cây Chất độc da cam cũng gây tiêu huỷ các chất hữu cơ trong đất, dẫn đến sự giảm sút các hoạt động của vi sinh vật trong đất, gây hậu quả phá huỷ cơ cấu thành phần thổ nhưỡng và xói mòn đất Hệ động vật cũng chịu tổn thất rất nặng nề Khi bị nhiễm độc trực tiếp với liều lượng lớn, các loài động vật có

ra diễn thế của rừng nhiệt đới sau khi bị phun rải chất độc da cam Rừng nhiệt đới bị đốt thành nương rẫy, sau đó bỏ hoang do thoái hoá đất, có thể tự phục hồi theo chu trình: khởi đầu là những thực vật bậc thấp như lau lách xuất hiện, tiếp đó là chuối rừng và tre nứa, các loài cây gỗ mọc nhanh Sau khoảng một vài chục năm sẽ xuất hiện những cây rừng và phát triển tiếp một thời gian sẽ thành rừng nhiệt đới Nhưng thực tế cho thấy diễn thế của rừng nhiệt đới bị phá huỷ do chất da cam lại không diễn ra như vậy Việc tái sinh rừng cần một thời gian rất dài và khó khăn.[4,9]

1.1.5 Tình hình ô nhiễm dioxin tại Việt Nam

Từ năm 1961 - 1971, quân đội Mỹ đã tiến hành cuộc chiến tranh hoá học lớn nhất, tàn khốc nhất trong lịch sử chiến tranh Việt Nam, xét cả về tính độc, khối lượng, chủng loại hoá chất độc Trên 100 nghìn tấn chất độc hóa học, phun rải trên diện tích 1,7 triệu ha của miền nam Việt Nam Các chất da cam, chất trắng, chất xanh, là các chất diệt cỏ làm rụng lá cây đã được sử dụng với liều lượng cao gấp nhiều lần liều sử dụng trong nông nghiệp nên chúng trở thành các chất độc ảnh hưởng lớn tới môi trường và các hệ sinh thái.[10]

Hiện nay, tại một số khu vực có lượng dioxin tồn lưu trong môi trường còn rất lớn, theo TCVN 8183:2009, ngưỡng dioxin trong đất và trầm tích lần lượt là

1000 pg-TEQ/g và 150 pg-TEQ/g, thì tại các khu vực này có lượng dioxin tồn lưu cao hơn gấp nhiều lần ngưỡng cho phép và hình thành các điểm nóng về ô nhiễm dioxin Từ nhiều nghiên cứu, các tác giả đã thống kê lượng chất độc hóa học mà quân độ Mỹ sử dụng trong những năm 1961-1971 (bảng 1.3)

(2003) 49.268.937 20.556.525 4.741.381 2.387.963 76.954.806 Young

(2009) 43.332.640 21.798.400 6.100.640 2.944.240 74.175.920

Trong bảng này cần chú ý là trong số liệu của Westing không bao gồm các chất tím, hồng và xanh mạ là những chất có hàm lượng dioxin rất cao Theo Young

và cộng sự thì con số 74.175.920 lít là tổng số Mỹ đưa vào Việt Nam, đến năm

1972 theo kế hoạch Pacer Ivy đã đưa về nước 25.200 phi (loại 208 lít) chất da cam, tương đương 5.241.600 lít, còn lượng đã sử dụng là 74.250.800 lít Theo số liệu của Stellman thì số lượng tổng các chất diệt cỏ là 76.954.806 lít(~77 triệu) các chất, tương đương với 95.112.688 kg (~ 95 triệu kg), trong đó có 67% các chất chứa dioxin, mà chủ yếu là chất da cam với khối lượng 49,27 triệu lít, tương đương 63.000 tấn

Từ các số liệu trên đây, có thể đánh giá mật độ phun rải như sau: Tất cả các chất là ~ 36 kg/ ha, riêng các chất da cam với khối lượng 49.268.937 lít tương đương 63.064.240 kg, rải trên 1,68 triệu ha thì mật độ 37,5 kg/ ha, gấp 17 lần liều

sử dụng trong nông nghiệp theo hướng dẫn của Bộ lục quân Mỹ năm 1969 là 2,2 kg/ha Với mật độ này thì các chất diệt cỏ trở thành những chất độc phát quang và phá hoại mùa màng có tính hủy diệt [9]

Trong cuộc chiến tranh này, do chất độc được phun rải trên đầu nguồn của nhiều con song lớn như song Bến Hải, sông Hương, song Đồng Nai, song Vàm

16

Cỏ,… và do tác động của nhiều yếu tố tự nhiên như gió, bão, lụt… làm cho chất độc gây ô nhiễm lan tỏa gần như toàn bộ miền Nam Niệt Nam và cả vùng ven bờ Theo tính toán, rừng nội địa là đối tượng chịu ảnh hưởng nặng nề nhất, chiếm 86% tổng

số đợt phun rải chất độc hoá học Kết thúc chiến tranh, khoảng hơn 2 triệu ha rừng

tự nhiên, chiếm hơn 1/3 diện tích rừng miền Nam Việt Nam đã bị tác động ở các mức độ khác nhau, trong đó có hàng trăm ha rừng nguyên sinh bị phá huỷ hoàn toàn.[10]

Với lượng TCDD rất lớn do chiến tranh để lại môi trường miền Nam Việt Nam đã và đang gây hậu quả nghiêm trong đối với sức khỏe của hàng triệu dân cư

và cựu chiến binh ở khắp mọi miền của Việt Nam Hàng triệu nạn nhân chất độc da cam/dioxin với nhiều loại chứng bệnh khác nhau: ung thư, suy giảm miễn dịch, tai biến sinh sản, dị tật bẩm sinh… Đặc biệt, ở một số sân bay như Biên Hòa, Đà Nẵng

và Phù Cát, có những điểm bị ô nhiễm chất độc da cam/dioxin rất nặng (những

“điểm nóng” về môi trường), hàm lượng dioxin (2,3,7,8-TCDD) trong đất, trong bùn ở đây cao hơn hàng trăm, có nơi hàng ngàn lần ngưỡng cho phép (1000 pg-TEQ/g đối với đất, 150 pg-TEQ/g với trầm tích, bùn[7])

1.2 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DIOXIN

Hiện nay, để xác định nồng độ dioxin trong các mẫu môi trường người ta có thể dùng hai phương pháp khác nhau bao gồm: phân tích công cụ và phân tích sinh học Tuỳ thuộc vào mục đích và yêu cầu của từng đối tượng mẫu mà người ta lựa chọn phương pháp phân tích thích hợp

Về cơ bản, phân tích Dioxin trong mẫu đất gồm các giai đoạn chính gồm tách chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu, làm sạch dịch chiết mẫu để loại bỏ tạp chất và phân tích định lượng trên thiết bị thích hợp

1.2.1 Các phương pháp chiết tách mẫu

Chiết Soxhlet

Nguyên tắc của kỹ thuật chiết Soxhlet là dựa trên quá trình chiết hồi lưu trong một dụng cụ gồm ba bộ phận chính: một ống chiết đun hồi lưu dung môi, một

17

thimble bằng giấy lọc dày giữ mẫu chiết rắn và một hệ thống siphon rút dịch chiết

từ thimble một cách tuần hoàn

Phương pháp tiến hành với mẫu khô trên hệ chiết Soxhlet có thể tích ống chiết 150-250mL tùy vào khối lượng mẫu cân chiết Hệ dung môi sử dụng để chiết mẫu có thể là toluen/diclometan/hexan (1/1/1, v/v/v) hoặc diclometan/hexan (1/1 v/v) Sau khi chiết, dịch chiết mẫu được cho qua muối Na2SO4 để loại nước và được tiến hành cô đuổi dung môi trên thiết bị cô quay chân không

Chiết lỏng rắn áp suất cao

Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng nhiệt độ cao và áp suất cao để tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu trong dung môi thích hợp

Phương pháp được tiến hành bằng cách cân một lượng mẫu khô hoặc mẫu tươi được trộn với lượng vật liệu nhồi phù hợp là vật liệu hấp thụ nước, sau đó đưa vào cột chiết thể tích 50 hoặc 100 ml Tiến hành chiết mẫu bằng hệ dung môi thích hợp như diclometan/hexan (1/1, v/v…) Dịch chiết được làm bay hơi về thể tích thích hợp và chuyển sang công đoạn làm sạch

Chiết siêu âm

Phương pháp chiết siêu âm là phương pháp mới được sử dụng thay cho các

phương pháp chiết truyền thống khác và được thiết lập bởi Tiêu chuẩn Công nghiệp Nhật Bản (Japanese Industrial Standard-JIS) và Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (U.S Environmental Protection Agency-US-EPA) Phương pháp này được đánh giá

là đơn giản, dễ thực hiện và thời gian chiết ngắn [37]

Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng sóng siêu âm để tách chất phân tích trong nền mẫu bằng dung môi thích hợp Mẫu khô được cân vào một ống nghiệm ly tâm sau đó bổ xung dung môi chiết như H2SO40,1M/aceton… Dịch chiết aceton được chuyển sang pha hexan và đưa sang công đoạn làm sạch

18

1.2.2 Các phương pháp làm sạch mẫu

Quá trình làm sạch mẫu được thực hiện bằng cách sử dụng hệ cột nhồi vật liệu hấp phụ multi-silica có tẩm hóa chất thích hợp, cột alumina và cột cacbon nhằm loại bỏ các chất ảnh hưởng, gây nhiễu cho quá trình phân tích định lượng dioxin Qúa trình này có thể được thực hiện bằng các hệ cột nhồi của hãng supelco, FMS hay hệ cột của hang Seeds Tec

Làm sạch trên hệ cột Supelco

Dịch chiết mẫu được làm sạch trên hệ cột nhồi gồm cột silica đa lớp (bao gồm AgNO3-silica, H2SO4-silica, KOH-silica và silica trung tính)ghép nối cột than hoạt tính đã hoạt hóa bằng dung môi Sau khi tiến hành rửa cột với 100 mL Hexan

và dung môi qua cột được hứng thải, cột silica gel được tháo bỏ và tiến hành rửa cột cacbon đảo chiều với 100 mL toluen để thu chất phân tích

Làm sạch trên hệ làm sạch FMS

Dịch chiết được làm sạch áp dụng quy trình làm sạch tự động trên thiết bị làm sạch do hãng FMS, Mỹ đưa ra sử dụng hệ cột làm sạch có sẵn gồm cột silica đa lớp to (28 g silica axit, 16 g silica bazo và 6 g silica trung tính) và nhỏ (4g silica axit, 2 g silica bazo và 1g silica trung tính), cột nhôm bazo (8 g) và cột Cacbon (2 g) Chất phân tích được rửa giải bằng dung môi toluen Dịch làm sạch được cô về thể tích nhỏtrước khi đưa lên thiết bị phân tích định lượng

Làm sạch trên hệ làm sạch bán tự động SZ-DXN-PT050

Trong quá trình này, các cột sắc ký đa lớp chứa vật liệu hập phụ silica gel bao gồm H2SO4-silica, AgNO3-silica và cột alumina được sử dụng để loại bỏ các chất gây ảnh hưởng tới việc định lượng của chất phân tích trong mẫu

Quá trình làm sạch được thực hiện bằng hệ làm sạch bán tự động PT050 của hãng Seeds Tec Mẫu được rửa giải bằng 990 µL toluen để thu dịch làm sạch cho phân tích bằng sắc ký khí ghép nối khối phổ hoặc bằng 550 µL dung môi dimetyl sunphoxit (DMSO) để thu dịch làm sạch cho phân tích sinh học

SZ-DXN-19

1.2.3 Các phương pháp phân tích định lượng dioxin

Các phương pháp phân tích công cụ

Dioxin là nhóm chất có nhiều đồng phân và nồng độ của chúng trong các mẫu môi trường là vô cùng nhỏ (cỡ ppq đến ppb tức 10-15 đến 10-9 g/g) Việc phân tích xác định từng thành phần của chúng trong mẫu là vô cùng phức tạp Phương pháp phân tích yêu cầu phải đáp ứng được 2 yếu tố:Phân tích riêng rẽ từng đồng phân với hàm lượng siêu vết

Nhóm các phương pháp phân tích công cụ có thể đáp ứng các yêu cầu trên là nhóm thiết bị phân tích sắc ký khí ghép nối khổi phổ bao gồm: thiết bị sắc ký khí khối phổ phân giải cao (HRGC-HRMS), sắc ký khí ghép nối khối phổ ba lần tứ cực (GC-Triple Quadrupole MS), Sắc ký khí ghép nối khối phổ bẫy ion (GC- Ion trap MS)…Ưu điểm của thiết bị sắc ký khí ghép nối khối phổ là sự kết hợp hoàn hảo của sắc ký khí cho phép xác định chất phân tích trong mẫu với độ phân giải cao dựa vào

cơ chế làm giàu mẫu cùng chiều cao của pic sinh ra và khối phổ cho phép xác định chính xác từng thành phần chất phân tích có trong mẫu dựa vào tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) để xác định khối lượng ion phân mảnh của chất phân tích

Sự kết hợp này cho phép thiết bị có khả năng phân tích chính xác và riêng rẽ chất phân tích với hàm lượng siêu vết

Phương pháp 1613 được phát triển bởi Phòng Khoa Học và Công Nghệ thuộc Cơ quan Bảo Vệ Môi Trường Hoa Kỳ để xác định đồng phân đặc trưng của

17 chất dioxin/furans được thế 2,3,7,8 trong nền mẫu lỏng, rắn và thịt (cơ) bằng phương pháp pha loãng đồng vị sắc ký khí ghép khối phổ cột mao quản độ phân giải cao (HRGC) ghép khối phổ phân giải cao (HRMS) Thiết bị phân tích HRGCMS có thể đạt đến độ phân giải 10.000, định lượng được đồng thời 17 đồng phân PCDDs/PCDFs trong mẫu ở mức giới hạn phát hiện có thể tới 0,1ppt.Chính nhờ 2 thông số này mà phương pháp sắc ký khí khối phổ phân giải cao HRGCMS cho phép phân tích với độ chính xác và độ nhạy cao hơnrất nhiều so với các phương pháp khác.[41]

20

Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi phòng thí nghiệm phải đầu tư một nguồn vốn lớn cho thiết bị sắc ký khí khối phổ và duy trì hoạt động của thiết bị này Mặt khác phương pháp này cần thời gian phân tích lâu hơn, chi phí cho xử lý mẫu và giá thành phân tíchmẫu đắt hơnnhiều so với các phương pháp khác Phương pháp này chủ yếu phục vụ cho các phân tích đòi hỏi độ chính xác cao và xác định riêng rẽ hàm lượng của từng thành phần trong mẫu

Các phương pháp phân tích sinh học

Ngày nay, việc xác định hàm lượng dioxin trong mẫu còn được thực hiện bằng các phương pháp phân tích sinh học Phân tích bằn công nghệ sinh học cho phép xác định nhanh các chất dioxin trong mẫu, giảm thiểu chi phí phân tích, rút ngắn thời gian phân tích, đem lại những lợi ích về mặt kinh tế

Nhóm các phương pháp phân tích bằng công nghệ sinh học được tóm tắt trong bảng 1.4

Bảng 1.4.Các phương pháp sinh học xác định dioxin [29]

1 Phân tích dựa trên sự

dẫn truyền tín hiệu AhR

Khi các dòng tế bào tiếp xúc với dioxin, AhR trong tế bào chất được kích hoạt, đi vàonhân tế bào và tạo thành một phức hợp với ARNT (thể vận chuyển AhR trong nhân) Phức hợp này tương tác với các yếu tố đáp ứng dioxin DRE trong bộ gen và kích hoạt sự biểu hiện của gen mã hoá protein CYP1A1, đo được bởi một trong cácphép phân tích dưới đây:

32P chứa trình tự đồng thuận DRE liên kết với các phức hợp này, tốc độ dịch chuyển của các phân tử ADN thăm dò này trong gel polyacrylamid sẽ bị chậm lại so với phân tử thăm dò không liên kết

Một cách khác, các dioxin trong mẫu cùng với các chất đồng loại chuẩn được liên hợp với một enzym cạnh tranh liên kết với các kháng thể kháng dioxin được gắn cố định trên đĩa, sau đó rửa và thực hiện phép đo hoạt độ enzym.Bằng cách sử dụng một đường cong chuẩn tạo ra bởi các nồng độ đã biết trước của các chất chuẩn dioxin, có thể suy ra được giá trị TEQ của các dioxin

Tương tự với ELISA, ngoại trừ việc sử dụng Europium

để dánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể

(radioimmunoassay)

Các kháng nguyên chuẩn được đánh dấu phóng xạ (*Ag) và các kháng nguyên không được đánh dấu trong mẫu phân tích (Ag) cạnh tranh liên kết với các kháng thể đặc hiệu (Ab) và tạo thành các phức hợp *Ag-Ab hoặc Ag-Ab Khi phản ứng liên kết đạt đến cân bằng, nếu lượng Ag tăng lên, lượng Ag-Ab tăng lên, trong khi lượng *Ag-Ab hơi giảm xuống và lượng *Ag tự do tăng lên, nghĩa là khối lượng của Ag tỷ lệ nghịch với khối lượng của phức hợp đánh dấu *Ag-Ab Các phức hợp *Ag-Ab và Ag-Ab được kết tủa bằng cách thêm một kháng thể kháng Ab và tách ra khỏi hỗn hợp kháng nguyên tự do, sau đó đo hoạt độ phóng xạ để xác định hàm lượng của kháng nguyên trong mẫu phân tích 4.4 Ah-Immunoassay Theo cơ chế dẫn truyền tín hiệu AhR, lượng dimer

AhR/ARNT có một mối tương quan với hàm lượng dioxin Trước tiên, cố định phức hợp AhR/ARNT bằng các mảnh ADN chứa trình tự đồng thuận DRE đã được gắn cố định trên microplate Sau đó phức hợp AhR/ARNT được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể kháng AhR hoặc kháng ARNT

24

1.2.4 Phương pháp phân tích định lượng bằng CALUX

CALUX là phương pháp thuộc nhóm các phương pháp phân tích sinh học

CALUX là từ viết tắt của cụm “Chemically Activated LUciferase eXpression”, đây

là phương pháp phân tích nhanhxác định tổng pg-TEQ/g của các chất dioxin/furans, dioxin-like PCBscó trong mẫu Phương pháp này được sử dụng cho các đối tượng mẫu môi trường như đất, nước, trầm tích, khí thải…Đây là kỹ thuật phân tích độc đáo được phát triển lần đầu tiên ở Mỹ và sau đó được mở rộng nghiên cứu tại Nhật Bản.[24,37]

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên việc đo mật độ ánh sáng trong phản ứng phát quang của cơ chất luciferin xúc tác bởi enzym luciferase tạo rakhi có mặt dioxin bởicác tế bào đã được chuyển nhiễm với một cấu trúc ADN chứa trình tự DRE (yếu tố đáp ứng dioxin) và gen reporter mã hoá luciferase

Sơ đồ nguyên tắc của phương pháp được trình bày như Hình 1.4

Hình 1.4 Sơ đồ nguyên tắc của phương pháp CALUX

25

Có thể giải thích một cách khái quát về nguyên tắc này như sau:

1) Các halogen hydrocacbon thơm (HAH), bao gồm cả các dioxin liên kết

với thụ thể AhR trong tế bào chất và kích hoạt các thụ thể này

2) Sau đó các phức hợp HAH-AhR đi vào nhân tế bào và dimer hoá với thể

vận chuyển AhR trong nhân (ARNT)

3) Các phức hợp HAH-AhR/ARNT liên kết với một trình tự ADN cụ thể gọi

là yếu tố đáp ứng dioxin (DRE) nằm trong vùng khởi động của các gen đáp

ứng dioxin

4) Liên kết của phức hợp HAH-AhR/ARNT với DRE kích hoạt sựphiên mã của các gen liên quan với DRE bao gồm gen mã hoá cytochrom CYP1A1 và luciferase

5) Các ARN thông tin (mARN) được phát tán vào tế bào chất

6) Các mARN được dịch mã tại các ribosom, tổng hợp nên các phân tử protein bao gồm CYP1A1 và luciferase

7) Các protein mới như CYP1A1 tạo ra các tác dụng sinh học và độc tính được quan sát thấy sau khi tiếp xúc với dioxin và các chất HAH

8) Hàm lượng dioxin được xác định từ một đường cong liều lượng-đáp ứng của phản ứng phát quang của cơ chất luciferin xúc tác bởienzym luciferase Như vậy, phương pháp này dựa trên cơ chế phân tử mà thông qua đó dẫn đến các tác dụng sinh học và độc tính của dioxin và các hydrocarbon thơm liên quan, cụ thể là ứng dụng việc các chất này có khả năng kích hoạt thụ thể hydrocarbon thơm (AhR) và cơ chế dẫn truyền tín hiệu AhR Trong các tế bào sinh vật, các quá trình phiên mã và giải mã của tế bào dẫn đến kết quả cuối cùng là sự gia tăng lượng enzym cytochrom P450 như CYP1A1 Trong phương pháp CALUX, trình tự gen

mã hoá CYP1A1 được thay thế bởi kỹ thuật gen tái tổ hợp bằng một gen reporter, chẳng hạn gen mã hoá enzym luciferase, xúc tác cho phản ứng phát quang của luciferin

Dòng tế bào tái tổ hợp (H1L6.1c2) được sử dụng trong phương pháp CALUX được tạo thành bằng cách chuyển nhiễm plasmid pGudLuc6.1 vào tế bào

26

ung thư gan chuột (Hepa1c1c7) Plasmid pGudLuc6.1 là một phân tử ADN dạng vòng chứa vùng đáp ứng dioxin của gen CYP1A1 (bao gồm 4 DRE) ở phía trên của gen mã hoá enzym luciferaze của loài đom đóm

Phản ứng hoá học xúc tác bởi luciferase đom đóm:

Luciferin + ATP → Luciferyl adenylate + PPiLuciferyl adenylate + O2 → Oxyluciferin + AMP + hν Ánh sáng được phát rado phản ứng tạo thành oxyluciferin trong một trạng thái kích thích và phải giải phóng một photon để trở về trạng thái cơ bản

Ưu điểm của phương pháp

- Khối lượng mẫu sử dụng cho phân tích thấp

- Phương pháp này không đòi hỏi chi phí cho thiết bị đắt tiền như HRGC/MS

và đã giảm chi phí cho xử lý mẫu nên giá thành phân tích mẫu cũng rẻ hơn rất nhiều so với phân tích bằng HRGC/MS

- Thời gian phân tích nhanh

- Chuẩn bị mẫu dễ dàng

Rất nhiều nghiên cứu xác nhận đã chỉ ra rằng kết quả phân tích mẫu bằng CALUX có mối tương quan cao, chặt chẽ so với phương pháp phân tích bằng HRGC/MS Cho nên đây là phương pháp đáng tin cậy dùng cho mục đích phân tích nhanh dioxin trong các mẫu môi trường

1.3 MỘT SỐ CÔNG NGHỆ XỬ LÝ DIOXIN HIỆN NAY

Hiện nay, để xử lý dioxin trong đất người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp như xử lý hóa học, lý học, cơ học, sinh học hay là sự kết hợp nhiều phương pháp khác nhau để hướng tới tiêu chí xử lý đạt hiệu quả cao nhất, ít tác động đến môi trường nhất và chi phí ít tốn kém nhất Các phương pháp tiêu biểu bao gồm:

1.3.1 Công nghệ xử lý giải hấp nhiệt

Công nghệ giải hấp nhiệt (In-Situ Thermal Desorption/In-PileThermal Desorption - ISTD/IPTD) do Công ty Terra-Therm (USA) đề xuất Đây là phương

27

pháp hiện đã và đang được áp dụng xử lý tại Sân bay Đà Nẵng Phương pháp này được thực hiện dựa trên cơ sở quá trình oxy hoá hoàn toàn hoặc nhiệt hoá thành than cốc của các hợp chất dioxin khi ở nhiệt độ cao có sự hiện diện của oxy Dioxin còn sót trong pha nước có thể bị thiêu huỷ thông qua sự thuỷ phân hoặc nhiệt phân có nước ở nhiệt độ cao hơn

Công nghệ này được thực hiện gồm hai giai đoạn, thứ nhất là dùng điện cực gia nhiệt cho đất, bùn nhiễm trong mố (ụ đất) đến nhiệt độ thích hợp để làm bay hơi các hợp chất hữu cơ độc hại gây ô nhiễm; sau đó thu gom và xử lý bằng các phương pháp thích hợp khác.[8]

1.3.2 Công nghệ cơ -hoá

Công nghệ phân hủy hóa cơ (MCD- Mechano-Chemical Destruction) sử dụng máy nghiền bi cóvận tốc cao để phân hủy các chất hữu cơ bền vững đã được nghiên cứu trong phòng thí nghiệmvà được đưa thử nghiệm với diện rộng ở một số nước như New Zealand, Mỹ, Nhật Công nghệMCD đưa đến sự phân huỷ hoá cơ hiệu quả cao với tất cả các độc chất hữu cơ bền vững ở trongđất-bùn như dioxin, DDT và các dẫn xuất, dieldrin, aldrin, lindane, polychrorinates biphenyls(PCBs) và phencyclidine (PCP), tất cả các hydrocarbon dầu mỏ (TPH) Hiện nay, công nghệ nàyđang được phát triển và thị trường hóa với các lò phản ứng có công suất khử độc 15 tấn đất- bùn/giờ theo quá trình liên tục với nhiệt độ thấp, quá trình xử lý kín, không tạo ra các chất ô nhiễmthứ cấp Do cấu trúc gọn đặt trong các container nên việc vận chuyển lắp đặt và bảo dưỡng rấtthuận lợi Hiệu xuất khử độc được kiểm soát qua việc biến đổi thời gian lưu kết hợp với lò phảnứng phụ cho các dự án lớn.[27]

1.3.3 Xử lýthiêu đốt

Công nghệ xử lý bằng phương pháp thiêu đốt cũng được đề xuất cho xử lý đất bị ô nhiễm dioxin tại Việt Nam.Nội dung cơ bản của phương pháp này là nghiền đất bị ô nhiễm dioxin thành kích thước hạt phù hợp rồi đưa vào lò thiêu ở 800oC Tại đây dioxin bị bay hơi, hỗn hợp khí thải được dẫn sang một buồng kín khác ở nhiệt độ trên 1200oC Để tăng khả năng phân hủy của dioxin, đất được trộn với xúc

28

tác thích hợp Khí thải được xử lý trong tháp phun bằng các dung dịch hấp thụ thích hợp, qua các tầng lọc bằng than hoạt tính, rồi thải ra môi trường.[8]

1.3.4 Xử lýphân hủy hóa học bằng xúc tác kiềm

Ở nhiệt độ khoảng 250oC, các chất dioxin bị các axit vô cơ có tính oxy hóa mạnh phân hủy thành các chất không độc hoặc ít độc hơn Dưới tác dụng của kiềm đặc, nhiệt độ và áp suất cao, các nguyên tử chlo bị thay thế từng phần bằng các nhóm hydroxyl thành các chất ít độc hơn.[8]

1.3.5 Xử lý chôn lấp

Xử lý chôn lấp là phương pháp cơ bản và dễ thực hiện nhất được đề xuất cho

xử lý đất bị ô nhiễm dioxin Phương pháp xử lý chôn lấp bao gồm hai hướng xử lý chôn lấp thụ động và chôn lấp tích tích cực

Phương pháp xử lý chôn lấp thứ nhất làxử lý chôn lấp thụ động hay còn gọi là chôn lấp cô lập Phương pháp nàytrong những năm trước đây (trước năm 2000) cũng

đã được nghiên cứu và áp dụng ở nhiều cấp độ khác nhau ở hầu khắp các địa phương trong cả nước, tất nhiên đây chỉ là giải pháp tình thế Phần nhiều các hố chôn có quy

mô nhỏ, có kích thước từ vài khối đến vài chục khối, được xây bằng gạch hoặc bê tông, chưa bọc lót bằng các vật liệu chống thấm và cách ly với môi trường tốt Từ năm 2006 đến 2009 tại sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai, cũng trên cơ sở loại hình công nghệ này

đã tiến hành cô lập triệt để tại chỗ khoảng gần 100.000 m3 đất nhiễm chất đôc da cam/dioxin trong các hố chôn an toàn Vào năm 2012, Bộ Quốc phòng phối hợp với

Cơ quan phát triển Quốc tế Hoa Kỳ bằng ngân sách của Chính phủ Mỹ thực hiện đã chôn lấp hoàn toàn 75.000 m3 đất nhiễm tại sân bay Phù Cát.[8]

Một phương pháp xử lý chôn lấp cô lập có kèm theo xử lý sinh học hay còn gọi

là xử lý chôn lấp tích cực cũng được đề cập Trong phương pháp này, người ta tiến hành chôn lấp cô lập đất nhiễm dioxin trong một bãi chôn lấp vững chắc đồng thời xử

lý phân hủy sinh học để khử độc Công nghệ này dựa trên cơ sở nghiên cứu quá trình phân hủy sinh học các chất chứa chlo ở điều kiện hiếu khí, kị khí không bắt buộc và kị khí nghiêm ngặt của vi sinh vật bản địa và các yếu tố môi trường cùng với các phương

29

pháp thi công phù hợp với các chất nguy hại, đặc biệt là dioxin Tuy nhiên phương pháp này vẫn chưa từng được ứng dụng xử lý đất nhiễm dioxin trên quy mô lớn và nó cũng chưa có bằng chứng xác thực về khả năng xử lý ô nhiễm dioxin một cách hiệu quả

Phương pháp thứ hai là kích thích phát triển của vi sinh vật bản địa ngay tại nơi bị ô nhiễm (biostimulation) Một hướng nghiên cứu khác là bổ sung một lượng lớn chất hữu cơ vào đất để tăng khả năng phân hủy dioxin của vi sinh vật Phân ủ hữu

cơ sinh học đã qua khử trùng được sử dụng làm chất dinh dưỡng hữu cơ, sau 3 tháng nồng độ PCDD và PCDF giảm 22% Động học của quá trình loại bỏ đồng phân này cho thấy bản chất của sự đề khử chlo kị khí Yoshida và cộng sử đã sử dụng axít hữu

cơ nhằm tăng cường quá trình phân hủy các chất dioxin chứa clo trong trầm tích từ sông nhiễm Sau 210 ngày xử lý, trên 32% PCDD/PCDF đã bị loại bỏ, bằng chứng này thừa nhận sự phân hủy sinh học là cơ chế loại độc chủ yếu.[8]

30

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi trong đề tài này là các mẫu đất được thu thập từ các khu vực thuộc sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng Theo TCVN 8183: 2009do Bộ Khoa học và Công nghệ công bố thì ngưỡng dioxin trong đất ở điểm ô nhiễm nặng được giới hạn là 1000ppt (1000 ng-TEQ/Kg)[7] Điều đó có nghĩa làkhu vực có mẫu đất được nghiên cứu có hàm lượng dioxin trong đất vượt quá 1000 ng/kg TEQđược cho là khu vực bị ô nhiễm dioxin

Sân bay Biên Hòa nằm ởPhường Tân Phong, Thành phốBiên Hòa, tỉnh Đồng Nai, tại tọa độ10°58’37” Bắc, 106°49’6” Đông,diện tích khoảng 1000 ha Nguồn ô nhiễm dioxin chủ yếu do rò rỉ, rửa các thiết bịvà máy bay sau khi phun chất diệt cỏ trong chiến tranh Theo sốliệu của BộQuốc phòng Mỹ, cuối những năm 1969, đầu

1970, một sốtai nạn đã xảy ra, dẫn đến rò rỉkhoảng 28000 lít chất độc da cam và

10000 lít chất độc trắng tại khu vực này

Các khu ô nhiễm trong sân bay quân sự Biên Hòa bao gồm:Khu vực Pacer Ivy (Góc phía Tây sân bay); Khu vực Tây Nam (Góc Tây Nam sân bay); Khu Nam Z1 (bao gồm bãi chôn lấp Z1 và vùng xung quanh); Các hồ bên trong và bên ngoài sân bay được xem là các nguồn ô nhiễm thứ cấp (Hình2.1)

31

Hình 2.1 Các khu vực ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa

Khu vực Pacer Ivy là địa điểm do Bộ Quốc phòng Mỹ đề nghị khảo sát, nằm

ở phía Tây Nam của sân bay Theo khảo sát ban đầu của Công ty Hatfield & Văn phòng 33, tháng 1 năm 2008 thì khu vực này có nồng độ dioxin là tương đối cao, khoảng từ 80,3 – 22800 ppt Tuy nhiên số lượng mẫu lấy còn ít nên chưa đánh giá được chính xác diện tích bị ô nhiễm vàdo đây là một khu vực có diện tích lớn, có khả năng lan truyền ô nhiễm đến các hệ sinh thái nước, nên chúng tôi đã tiến hành thu thập thêm mẫu và đánh giá kỹ lưỡng hơn về mức độ ô nhiễm dioxin tại khu vực này.[40]

Sân bay Đà Nẵng là căn cứ không quân củaMỹ, nơi từng lưu trữ số lượng lớn chất da camvà các chất diệt cỏ khác trong Chiến dịch RanchHand 1961- 1971 và hiện là một trong 3 điểmnóng ô nhiễm dioxin nghiêm trọng nhất tại Việt Nam Sân

32

bay quốc tế Đà Nẵng có tổng diện tích là 892,5 ha, gồm 2 khu vực ô nhiễm: phía Bắc và phía Nam đường băng (Hình 2.2) Khu vực bắc đường băng bao gồm các khu: Pha trộn và chuyển tải; khu lưu trữ; mương thoát nước; hồ Sen và khu đất ngập phía đông Khu nam đường băng là khu vực lưu trữ Pacer Ivy cũ.Nguồn ô nhiễm tại các khu vực này chủ yếu do nạp rửa khi phun rải, thấm chảy khi đóng, mởthùng Theo điều tra của Công ty Hatfield& Văn phòng 33, từ những nghiên cứu năm 2007 đến 2009 và tháng 1 năm 2010 của USAIDthì khu vực này có nồng độ dioxin trung bình khoảng từ 1000 ppt – 19.000 ppt, trong đó khu bắc đường băng là khu vực bị ô nhiễm nặng.[8]

Hình 2.2 Các khu vực ô nhiễm tại sân bay Đà Nẵng 2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành phân tích xác định tổng hàm lượng dioxin trong các mẫu đất thu thập được từ khu vực Pacer Ivy, sân bay Biên Hoà và khu ven hồ Sen thuộc khu vực bắc đường băng, sân bay Đà Nẵng Dựa trên các kết quả thu được, đánh giá

Khu lưu trữ Pacer Ivy cũ

Khu lưu trữ phía bắc sân bay

33

mức độ ô nhiễm dioxin của khu vực nghiên cứu, khoanh vùng ô nhiễm cần xử lý và

đề xuất phương án xử lý thích hợp

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Lấy mẫu và phân tích xác định nồng độ dioxin trong mẫu: Số lượng mẫu thu thập gồm 12 mẫu tại khu vực ven hồ Sen phía bắc đường băng, sân bay Đà Nẵng và 30 mẫu tại khu Pacer Ivy, sân bay Biên Hòa

- Phân tích đối chiếu và so sánh xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp CALUX cho phân tích sàng lọc mẫu đất tại Việt Nam

- Nghiên cứu mức độ ô nhiễm dioxin tại khu vực khảo sát, bổ xung số liệu góp phầnđánh giá và khoanh vùng ô nhiễm

- Đề xuất phương pháp xử lý thích hợp dựa trên các cơ sở khoa học thực tiễn, tính toán khối lượng đất cần xử lý và các vấn đề liên quan khác

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Để nghiên cứu, đánh giá một cách chính xác về hiện trạng ô nhiễm dioxin của các khu vực, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm, quy trìnhvà quy tắc thu thập và lấy mẫu sao cho phù hợp nhất mà chúng tôi có thể thực hiện được với các trang thiết bị và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm

Công tác lấy mẫu được tuân thủ theo nguyên tắc sau:

Loại mẫu, lượng mẫu: tiến hành lấy mẫu đất tại khu vực Biên Hòa, Đà Nẵng Dụng cụ, hóa chất dung trong lấy mẫu: khoan tay, xẻng, khay chứ mẫu, thìa lấy mẫu, thùng chứa và vận chuyển mẫu, găng tay, ủng cao su, chất rửa dụng cụ lấy mẫu, nước (sinh hoạt) để rửa dụng cụ, dung môi (hexan, axeton loại dung trong phân tích) và máy định vị GPS, máy ảnh

Lấy các loại mẫu:Thiết kế sơ đồ lấy mẫu theo yêu cầu của nhiệm vụ nghiên cứu Để đảm bảo tính đại diện khi lấy mẫu cần sử dụng sơ đồ tuyến Sử dụng máy định vị GPS để xác định vị trí chính xác khi lấy mẫu, ở khu vực nghiên cứu chi tiết

34

đan dày mạng tuyến lấy mẫu Cần ưu tiên lấy mẫu theo hướng lan tỏa do đất, bị rửa trôi theo nước mưa hoặc theo kênh mương (theo yếu tố địa hình)

Các thao tác kỹ thuật khi lấy mẫu:Xác định vị trí lấy mẫu ở hiện trường theo

sơ đồ thiết kế lấy mẫu; chuẩn bị hiện trường lấy mẫu; chuẩn bị các dụng cụ lấy mẫu; lấy mẫu và ghi các thông số liên quan khác; bảo quản mẫu

Về cơ bản, quy trình lấy mẫu đã theo sát những quy trình đã được sử dụng theo tiêu chuẩn của công ti tư vấn Hatfield Canada thực hiện Chỉ có một ngoại trừ

là quy trình lấy mẫu đất theo chiều sâu đến 3,2m, phòng thí nghiệm Dioxin – Trung tâm Quan trắc Môi trường đã thiết kế một thiết bị lấy mẫu có khả năng lấy mẫu đến

độ sâu 3,2m giảm được nhiễm chéo rất nhiều Hình 2.3 mô tả kĩ thuật lấy mẫu đất sâu bằng thiết bị lấy mẫu đa chiều

Hình 2.3 Phương pháp lấy mẫu đất

Đảm bảo chất lượng và kiểm soát chất lượng (QA/QC): QA/QC trong lấy mẫu là rất cần thiết để đảm bảo chắc chắn là không có sự lây nhiễm bẩn chéo và nếu có thì kiểm soát được mức lây nhiễm bẩn do dụng cụ trong quá trình lấy mẫu.Để tránh lây nhiễm bẩn trong quá trình lấy mẫu, trước khi lấy hoặc giữa các lần lấy mẫu, tất cả dụng cụ lấy mẫu phải được rửa sạch Dùng loại nước rửa thường

sử dụng để rửa dụng cụ phòng thí nghiệm pha với nước sạch (nước sinh hoạt) Rửa tiếp 3 lần bằng dung môi hexan, rồi axeton.Mẫu QA/QC chiếm khoảng 5% tổng số mẫu đã lấy, bao gồm mẫu trắng hiện trường (mẫu nước tráng rửa dụng cụ sau khi đã