Biện pháp sinh học xử lý chất ô nhiễm nói chung và các hợp chất dioxin nói riêng đã đƣợc nghiên cứu ứng dụng từ lâu đã dần trở thành hƣớng đi triển vọng vì đây là một biện pháp tuy có nhƣợc điểm là thời gian xử lý kéo dài nhƣng là một biện pháp hiệu quả, rẻ tiền và đặc biệt là không tạo sản phẩm thứ cấp, an toàn đối với con ngƣời và hệ sinh thái.
Phƣơng pháp thứ nhất là bổ sung các vi sinh vật có khả năng phân hủy chất ô nhiễm vào vùng ô nhiễm mà ở đó điều kiện môi trƣờng có thể điều khiển đƣợc (bioaugmentation). Các bằng chứng của sự phân hủy dioxin và các hợp chất tƣơng tự trong các hệ thống xử lý thử nghiệm đã dần đƣợc sáng tỏ. Hầu hết các nghiên cứu đều quan tâm đến các vi khuẩn phân hủy dioxin đƣợc bổ sung vào đất gây nhiễm nhân tạo các đồng phân dioxin. Kết quả của các nghiên cứu này cho thấy những chủng vi khuẩn đƣợc bổ sung vào đất chuyển hóa từ 32% đến 100% các đồng phân mono- đến tri- chloro dibenzo –p –dioxin/dibenzofuran đƣợc đƣa vào ở nồng độ từ 1 đến 100 ppm trong 1 tuần. Chủng vi khuẩn Sphingomonas wittichii RW làm giảm 75,5% các PCDD độc sau 15 ngày, trong khi đó mẫu đối chứng giảm 20,2%, đây là một bằng chứng rõ ràng cho thấy sự phân hủy sinh học một số đồng phân dioxin chọn lọc.[8]
Phƣơng pháp thứ hai là kích thích phát triển của vi sinh vật bản địa ngay tại nơi bị ô nhiễm (biostimulation). Một hƣớng nghiên cứu khác là bổ sung một lƣợng lớn chất hữu cơ vào đất để tăng khả năng phân hủy dioxin của vi sinh vật. Phân ủ hữu cơ sinh học đã qua khử trùng đƣợc sử dụng làm chất dinh dƣỡng hữu cơ, sau 3 tháng nồng độ PCDD và PCDF giảm 22%. Động học của quá trình loại bỏ đồng phân này cho thấy bản chất của sự đề khử chlo kị khí. Yoshida và cộng sử đã sử dụng axít hữu cơ nhằm tăng cƣờng quá trình phân hủy các chất dioxin chứa clo trong trầm tích từ sông nhiễm. Sau 210 ngày xử lý, trên 32% PCDD/PCDF đã bị loại bỏ, bằng chứng này thừa nhận sự phân hủy sinh học là cơ chế loại độc chủ yếu.[8]
30
CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.ĐỐI TƢỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu của chúng tôi trong đề tài này là các mẫu đất đƣợc thu thập từ các khu vực thuộc sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng. Theo TCVN 8183: 2009do Bộ Khoa học và Công nghệ công bố thì ngƣỡng dioxin trong đất ở điểm ô nhiễm nặng đƣợc giới hạn là 1000ppt (1000 ng-TEQ/Kg)[7]. Điều đó có nghĩa làkhu vực có mẫu đất đƣợc nghiên cứu có hàm lƣợng dioxin trong đất vƣợt quá 1000 ng/kg TEQđƣợc cho là khu vực bị ô nhiễm dioxin.
Sân bay Biên Hòa nằm ởPhƣờng Tân Phong, Thành phốBiên Hòa, tỉnh Đồng Nai, tại tọa độ10°58’37” Bắc, 106°49’6” Đông,diện tích khoảng 1000 ha. Nguồn ô nhiễm dioxin chủ yếu do rò rỉ, rửa các thiết bịvà máy bay sau khi phun chất diệt cỏ trong chiến tranh. Theo sốliệu của BộQuốc phòng Mỹ, cuối những năm 1969, đầu 1970, một sốtai nạn đã xảy ra, dẫn đến rò rỉkhoảng 28000 lít chất độc da cam và 10000 lít chất độc trắng tại khu vực này.
Các khu ô nhiễm trong sân bay quân sự Biên Hòa bao gồm:Khu vực Pacer Ivy (Góc phía Tây sân bay); Khu vực Tây Nam (Góc Tây Nam sân bay); Khu Nam Z1 (bao gồm bãi chôn lấp Z1 và vùng xung quanh); Các hồ bên trong và bên ngoài sân bay đƣợc xem là các nguồn ô nhiễm thứ cấp (Hình2.1).
31
Hình 2.1. Các khu vực ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa
Khu vực Pacer Ivy là địa điểm do Bộ Quốc phòng Mỹ đề nghị khảo sát, nằm ở phía Tây Nam của sân bay. Theo khảo sát ban đầu của Công ty Hatfield & Văn phòng 33, tháng 1 năm 2008 thì khu vực này có nồng độ dioxin là tƣơng đối cao, khoảng từ 80,3 – 22800 ppt. Tuy nhiên số lƣợng mẫu lấy còn ít nên chƣa đánh giá đƣợc chính xác diện tích bị ô nhiễm vàdo đây là một khu vực có diện tích lớn, có khả năng lan truyền ô nhiễm đến các hệ sinh thái nƣớc, nên chúng tôi đã tiến hành thu thập thêm mẫu và đánh giá kỹ lƣỡng hơn về mức độ ô nhiễm dioxin tại khu vực này.[40]
Sân bay Đà Nẵng là căn cứ không quân củaMỹ, nơi từng lƣu trữ số lƣợng lớn chất da camvà các chất diệt cỏ khác trong Chiến dịch RanchHand 1961- 1971 và hiện là một trong 3 điểmnóng ô nhiễm dioxin nghiêm trọng nhất tại Việt Nam. Sân
32
bay quốc tế Đà Nẵng có tổng diện tích là 892,5 ha, gồm 2 khu vực ô nhiễm: phía Bắc và phía Nam đƣờng băng (Hình 2.2). Khu vực bắc đƣờng băng bao gồm các khu: Pha trộn và chuyển tải; khu lƣu trữ; mƣơng thoát nƣớc; hồ Sen và khu đất ngập phía đông. Khu nam đƣờng băng là khu vực lƣu trữ Pacer Ivy cũ.Nguồn ô nhiễm tại các khu vực này chủ yếu do nạp rửa khi phun rải, thấm chảy khi đóng, mởthùng. Theo điều tra của Công ty Hatfield& Văn phòng 33, từ những nghiên cứu năm 2007 đến 2009 và tháng 1 năm 2010 của USAIDthì khu vực này có nồng độ dioxin trung bình khoảng từ 1000 ppt – 19.000 ppt, trong đó khu bắc đƣờng băng là khu vực bị ô nhiễm nặng.[8]
Hình 2.2. Các khu vực ô nhiễm tại sân bay Đà Nẵng 2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành phân tích xác định tổng hàm lƣợng dioxin trong các mẫu đất thu thập đƣợc từ khu vực Pacer Ivy, sân bay Biên Hoà và khu ven hồ Sen thuộc khu vực bắc đƣờng băng, sân bay Đà Nẵng. Dựa trên các kết quả thu đƣợc, đánh giá
Khu lƣu trữ Pacer Ivy cũ
Khu lƣu trữ phía bắc sân bay
33
mức độ ô nhiễm dioxin của khu vực nghiên cứu, khoanh vùng ô nhiễm cần xử lý và đề xuất phƣơng án xử lý thích hợp.
Nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Lấy mẫu và phân tích xác định nồng độ dioxin trong mẫu: Số lƣợng mẫu thu thập gồm 12 mẫu tại khu vực ven hồ Sen phía bắc đƣờng băng, sân bay Đà Nẵng và 30 mẫu tại khu Pacer Ivy, sân bay Biên Hòa.
- Phân tích đối chiếu và so sánh xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp CALUX cho phân tích sàng lọc mẫu đất tại Việt Nam
- Nghiên cứu mức độ ô nhiễm dioxin tại khu vực khảo sát, bổ xung số liệu góp phầnđánh giá và khoanh vùng ô nhiễm.
- Đề xuất phƣơng pháp xử lý thích hợp dựa trên các cơ sở khoa học thực tiễn, tính toán khối lƣợng đất cần xử lý và các vấn đề liên quan khác.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu 2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Để nghiên cứu, đánh giá một cách chính xác về hiện trạng ô nhiễm dioxin của các khu vực, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm, quy trìnhvà quy tắc thu thập và lấy mẫu sao cho phù hợp nhất mà chúng tôi có thể thực hiện đƣợc với các trang thiết bị và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm.
Công tác lấy mẫu đƣợc tuân thủ theo nguyên tắc sau:
Loại mẫu, lƣợng mẫu: tiến hành lấy mẫu đất tại khu vực Biên Hòa, Đà Nẵng Dụng cụ, hóa chất dung trong lấy mẫu: khoan tay, xẻng, khay chứ mẫu, thìa lấy mẫu, thùng chứa và vận chuyển mẫu, găng tay, ủng cao su, chất rửa dụng cụ lấy mẫu, nƣớc (sinh hoạt) để rửa dụng cụ, dung môi (hexan, axeton loại dung trong phân tích) và máy định vị GPS, máy ảnh.
Lấy các loại mẫu:Thiết kế sơ đồ lấy mẫu theo yêu cầu của nhiệm vụ nghiên cứu. Để đảm bảo tính đại diện khi lấy mẫu cần sử dụng sơ đồ tuyến. Sử dụng máy định vị GPS để xác định vị trí chính xác khi lấy mẫu, ở khu vực nghiên cứu chi tiết
34
đan dày mạng tuyến lấy mẫu. Cần ƣu tiên lấy mẫu theo hƣớng lan tỏa do đất, bị rửa trôi theo nƣớc mƣa hoặc theo kênh mƣơng (theo yếu tố địa hình).
Các thao tác kỹ thuật khi lấy mẫu:Xác định vị trí lấy mẫu ở hiện trƣờng theo sơ đồ thiết kế lấy mẫu; chuẩn bị hiện trƣờng lấy mẫu; chuẩn bị các dụng cụ lấy mẫu; lấy mẫu và ghi các thông số liên quan khác; bảo quản mẫu.
Về cơ bản, quy trình lấy mẫu đã theo sát những quy trình đã đƣợc sử dụng theo tiêu chuẩn của công ti tƣ vấn Hatfield Canada thực hiện. Chỉ có một ngoại trừ là quy trình lấy mẫu đất theo chiều sâu đến 3,2m, phòng thí nghiệm Dioxin – Trung tâm Quan trắc Môi trƣờng đã thiết kế một thiết bị lấy mẫu có khả năng lấy mẫu đến độ sâu 3,2m giảm đƣợc nhiễm chéo rất nhiều. Hình 2.3 mô tả kĩ thuật lấy mẫu đất sâu bằng thiết bị lấy mẫu đa chiều.
Hình 2.3. Phƣơng pháp lấy mẫu đất
Đảm bảo chất lƣợng và kiểm soát chất lƣợng (QA/QC): QA/QC trong lấy mẫu là rất cần thiết để đảm bảo chắc chắn là không có sự lây nhiễm bẩn chéo và nếu có thì kiểm soát đƣợc mức lây nhiễm bẩn do dụng cụ trong quá trình lấy mẫu.Để tránh lây nhiễm bẩn trong quá trình lấy mẫu, trƣớc khi lấy hoặc giữa các lần lấy mẫu, tất cả dụng cụ lấy mẫu phải đƣợc rửa sạch. Dùng loại nƣớc rửa thƣờng sử dụng để rửa dụng cụ phòng thí nghiệm pha với nƣớc sạch (nƣớc sinh hoạt). Rửa tiếp 3 lần bằng dung môi hexan, rồi axeton.Mẫu QA/QC chiếm khoảng 5% tổng số mẫu đã lấy, bao gồm mẫu trắng hiện trƣờng (mẫu nƣớc tráng rửa dụng cụ sau khi đã
35
rửa sạch giữa các lần lấy mẫu), mẫu lặp duplicate trong lấy mẫu của một vị trí và mẫu chia từ một bình đựng mẫu.
Bảo quản mẫu: Niêm phòng bình đƣợc mẫu bằng băng giấy paraffin, xếp đặt vào thùng lƣu chứa mẫu, lắp kín, đánh số thùng, lập danh sách mẫu trong thùng, vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm.Tại phòng thí nghiệm mẫu đƣợc bảo quản theo tiêu chuẩn và sơ chế theo quy trình sơ chế lƣu hành nội bộ của phòng thí nghiệm.
2.2.2. Hoá chất, thiết bị và dụng cụ
a) Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ
Tủ nuôi cấy vi sinh sử dụng khí CO2, model MCO-5AC, SANYO. Thiết bị đƣợc sử dụng để điều chỉnh nhiệt độ môi trƣờng không khí trong buồng tủ.
Thiết bị chiết siêu âm Vibracell VCX-130. Thiết bị đƣợc sử dụng để phá mẫu, đồng nhất mẫu trên cơ sở sử dụng sóng siêu âm.
Thiết bị làm sạch mẫu bán tự động SZ DX-PT050, đƣợc sử dụng trong làm sạch dịch chiết mẫu đất phục vụ cho phân tích các chất hữu cơ chậm phân hủy.
Máy đo huỳnh quang Centro-XS3 LB960, Berthold đƣợc sử dụng để đo mật độ ánh sáng huỳnh quang trong phản ứng phát quang của mẫu khi có mặt chất xúc tác thích hợp. Ứng dụng trong phân tích CALUX, động học enzym, xác định ATP,…
Bồn điều nhiệt Minder SD-Mini N, Thermo sử dụng môi trƣờng điều nhiệt là nƣớc cất, thiết bị điều chỉnh nhiệt độ môi trƣờng nƣớc.
Máy ly tâm Tabletop Centrifuge H36, Kokusan đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm với mục đích ly tâm phân tách hỗn hợp nhiều chất thành các pha tách ra khỏi nhau.
36
Pipet 10ml, 25ml
Micropitet và micropipet tip 10µl, 20µl, 200µl, 1000µl và 10ml
Multi-micropipet 8 kênh 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 30-300µl
Multi-micropipet đa kênh, 200µl/kênh.
Cân phân tích, cân kĩ thuật, máy lắc Vortex.
Các dụng cụ khác: ống chiết ly tâm 50ml, ống nghiệm thủy tinh 40ml, cốc thuỷ tinh, vial ly tâm 1,5ml.
Hóa chất và chất chuẩn
Chất chuẩn: là dung dịch 2,3,7,8-TCDD Code ED-901-B 50 µg/mL trong dung môi Dimetyl Sulfoxit
Các dung môi: axeton, n-hexan, dung môi Dimetyl Sulfoxit (DMSO)loại dùng cho phân tích sinh học
Muối NaCl
Dung dich H2SO4 đậm đặc (95-97%).
Chất môi trƣờng RPMI1640 có thành phần bao gồm: phenol đỏ, L- glutamin, NaHCO3, glucozơ 2g/l, pyridoxin hdrochloride C8H11NO3.HCl.
Dung dịch muối photphat PBS
Tế bào,bộ kit luciferin
Nƣớc cất, nƣớc deion, cồn 70%
2.2.3. Xử lý và phân tích mẫu
Mẫu sau khi đƣợc sơ chế đƣợc chuyển sang công đoạn xử lý mẫu. Quy trình xử lý mẫu bao gồm các công đoạn chiết tách và làm sạch đƣợc mô tả trong hình 2.4.
37
Hình 2.4. Quy trình chiết tách và làm sạch mẫu đất
Chiết siêu âm
Tiến hành chiết siêu âm mẫu đất với khối lƣợng cân thích hợp (5g) trong dung dịch 5% H2SO40,1M/aceton trong 15 phút. Sau đó hút 5 mL dich chiết sang ống nghiệm 40 mL, bổ xung dung dịch NaCl 5% và 2 mL hexan, tiến hành chiết lắc 2 phút để thu dịch chiết n-hexan.
Làm sạch dịch chiết
Dịch chiết mẫu đƣợc tiến hành làm sạch trên thiết bị làm sạch bán tự động SZ-DXN-PT050. Quy trình làm sạch đƣợc mô tả trong hình 2.4.
38
Hình 2.5. Quy trình làm sạch mẫu bằng hệ làm sạch bán tự động
Phân tích bằng CALUX
Dịch chiết mẫu sau khi làm sạch đƣợc sử dụng cho quá trình phân tích CALUX. Các chất dioxin/furan đƣợc định lƣợng dựa trên đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa giá trị ln[TCDD*100] và đơn vị ánh sáng tƣơng đối RLU. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng từ các dung dịch chuẩn 2,3,7,8-TCDD ở các nồng độ khác nhau và kiểm tra độ chính xác của đƣờng chuẩn bằng dung dịch kiểm chứng QC. [45]
39
Hình 2.6. Quy trình thí nghiệm CALUX
Các bƣớc chuẩn bị cho phân tích đo mật độ quang bao gồm:
- Chuẩn bị mẫu: mẫu sau khi làm sạch đƣợc pha loãng ở các tỉ lệ 1, 1/5 và 1/25 trong dung môi DMSO.
- Tạo môi trƣờng nuôi cấy: các mẫu sau khi pha loãng ở các tỉ lệ khác nhau đƣợc pha loãng tiếp 100 lần trong môi trƣờng nuôi cấy là media RPMI1640.
- Phơi nhiễm tế bào: cho mẫu vào các giếng chứa tế bào. Tiến hành ủ ở 37oC trong 19-24 giờ.
- Đo huỳnh quang xác định nồng độ TEQ tổng của chất trong mẫu.
Tính toán kết quả
Sau khi đo huỳnh quanh, kết quả đƣợc tính toán và xử lý bởi phần mềm chuyên dụng.
Quy trình xử lý số liệu phân tích nhƣ sau: Từ số liệu đo mật độ ánh sáng tƣơng đối (RLU- Relative Light Unit)→Hiệu chỉnh số liệu theo giá trị RLUmax→Tính toán kết quả theo đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của RLU vào nồng độ chất 2,3,7,8-TCDD.
40
CHƢƠNG 3 –KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP XỬ LÝ DIOXIN
3.1. PHÂN TÍCH XÁC NHẬN PHƢƠNG PHÁP 3.1.1. Đƣờng chuẩn của phƣơng pháp 3.1.1. Đƣờng chuẩn của phƣơng pháp
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng nhằm kiểm tra độ chính xác của phép phân tích, đồng thời là cơ sở để xác định hàm lƣợng chất phân tích có trong mẫu.
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên mối tƣơng quan giữa giá trị nồng độ chất 2,3,7,8-TCDD trong mẫu chuẩn và khả năng đáp ứng quang học của tế bào đối với mẫu chuẩn đó (ln[TCDD*100] và Relative Light Unit-RLU].
Đƣờng chuẩn gồm 10 điểm chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng: 0,0488 - 25 ng/mL.Dung dịch chuẩn đƣợc sử dụng là dung dịch D48-DM có thành phần là chất 2,3,7,8-TCDD nồng độ 50 ng/ml DMSO. Để kiểm tra độ chính xác của đƣờng chuẩn, chúng tôi tiến hành phân tích chất chuẩn kiểm chứng QC có nồng độ chính xác 2,3,7,8-TCDD 5 pg/ml.
Để dựng đƣờng chuẩn, tiến hành pha các dung dịch chuẩn từ dung dịch chuẩn gốc D48-DM, nồng độ các dung dịch chuẩn tại các điểm chuẩn đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nồng độ các dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn
Chất chuẩn
Nồng độ ( ng/ml )
STD0 STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 STD7 STD8 STD9
2,3,7,8-TCDD 25.0 12.5 6.25 3.13 1.56 0.781 0.391 0.195 0.0997 0.0488
Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành dựng đƣờng chuẩn cho phép phân tích, kết quả đƣợc mô tả trong hình 3.1.
41
Hình 3.1. Đƣờng chuẩn phân tích CALUX
Việc xây dựng đƣờng chuẩn phải đạt đƣợc các tiêu chuẩn sau:
-Các điểm chuẩn nằm trên đƣờng chuẩn hoặc dao động nhỏ xung quanh đƣờng chuẩn;
- Khoảng tuyến tính trong khoảng nồng độ từ điểm STD7 đến STD3 (nồng độ từ 195-3125 pg/ml);
- Hệ số đáp ứng tƣơng quan của nồng độ chất chất chuẩn trong đƣờng chuẩn so với giá trị lý thuyết không lệch quá 30%.
0 4000 8000