2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Để nghiên cứu, đánh giá một cách chính xác về hiện trạng ô nhiễm dioxin của các khu vực, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm, quy trìnhvà quy tắc thu thập và lấy mẫu sao cho phù hợp nhất mà chúng tôi có thể thực hiện đƣợc với các trang thiết bị và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm.
Công tác lấy mẫu đƣợc tuân thủ theo nguyên tắc sau:
Loại mẫu, lƣợng mẫu: tiến hành lấy mẫu đất tại khu vực Biên Hòa, Đà Nẵng Dụng cụ, hóa chất dung trong lấy mẫu: khoan tay, xẻng, khay chứ mẫu, thìa lấy mẫu, thùng chứa và vận chuyển mẫu, găng tay, ủng cao su, chất rửa dụng cụ lấy mẫu, nƣớc (sinh hoạt) để rửa dụng cụ, dung môi (hexan, axeton loại dung trong phân tích) và máy định vị GPS, máy ảnh.
Lấy các loại mẫu:Thiết kế sơ đồ lấy mẫu theo yêu cầu của nhiệm vụ nghiên cứu. Để đảm bảo tính đại diện khi lấy mẫu cần sử dụng sơ đồ tuyến. Sử dụng máy định vị GPS để xác định vị trí chính xác khi lấy mẫu, ở khu vực nghiên cứu chi tiết
34
đan dày mạng tuyến lấy mẫu. Cần ƣu tiên lấy mẫu theo hƣớng lan tỏa do đất, bị rửa trôi theo nƣớc mƣa hoặc theo kênh mƣơng (theo yếu tố địa hình).
Các thao tác kỹ thuật khi lấy mẫu:Xác định vị trí lấy mẫu ở hiện trƣờng theo sơ đồ thiết kế lấy mẫu; chuẩn bị hiện trƣờng lấy mẫu; chuẩn bị các dụng cụ lấy mẫu; lấy mẫu và ghi các thông số liên quan khác; bảo quản mẫu.
Về cơ bản, quy trình lấy mẫu đã theo sát những quy trình đã đƣợc sử dụng theo tiêu chuẩn của công ti tƣ vấn Hatfield Canada thực hiện. Chỉ có một ngoại trừ là quy trình lấy mẫu đất theo chiều sâu đến 3,2m, phòng thí nghiệm Dioxin – Trung tâm Quan trắc Môi trƣờng đã thiết kế một thiết bị lấy mẫu có khả năng lấy mẫu đến độ sâu 3,2m giảm đƣợc nhiễm chéo rất nhiều. Hình 2.3 mô tả kĩ thuật lấy mẫu đất sâu bằng thiết bị lấy mẫu đa chiều.
Hình 2.3. Phƣơng pháp lấy mẫu đất
Đảm bảo chất lƣợng và kiểm soát chất lƣợng (QA/QC): QA/QC trong lấy mẫu là rất cần thiết để đảm bảo chắc chắn là không có sự lây nhiễm bẩn chéo và nếu có thì kiểm soát đƣợc mức lây nhiễm bẩn do dụng cụ trong quá trình lấy mẫu.Để tránh lây nhiễm bẩn trong quá trình lấy mẫu, trƣớc khi lấy hoặc giữa các lần lấy mẫu, tất cả dụng cụ lấy mẫu phải đƣợc rửa sạch. Dùng loại nƣớc rửa thƣờng sử dụng để rửa dụng cụ phòng thí nghiệm pha với nƣớc sạch (nƣớc sinh hoạt). Rửa tiếp 3 lần bằng dung môi hexan, rồi axeton.Mẫu QA/QC chiếm khoảng 5% tổng số mẫu đã lấy, bao gồm mẫu trắng hiện trƣờng (mẫu nƣớc tráng rửa dụng cụ sau khi đã
35
rửa sạch giữa các lần lấy mẫu), mẫu lặp duplicate trong lấy mẫu của một vị trí và mẫu chia từ một bình đựng mẫu.
Bảo quản mẫu: Niêm phòng bình đƣợc mẫu bằng băng giấy paraffin, xếp đặt vào thùng lƣu chứa mẫu, lắp kín, đánh số thùng, lập danh sách mẫu trong thùng, vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm.Tại phòng thí nghiệm mẫu đƣợc bảo quản theo tiêu chuẩn và sơ chế theo quy trình sơ chế lƣu hành nội bộ của phòng thí nghiệm.
2.2.2. Hoá chất, thiết bị và dụng cụ
a) Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ
Tủ nuôi cấy vi sinh sử dụng khí CO2, model MCO-5AC, SANYO. Thiết bị đƣợc sử dụng để điều chỉnh nhiệt độ môi trƣờng không khí trong buồng tủ.
Thiết bị chiết siêu âm Vibracell VCX-130. Thiết bị đƣợc sử dụng để phá mẫu, đồng nhất mẫu trên cơ sở sử dụng sóng siêu âm.
Thiết bị làm sạch mẫu bán tự động SZ DX-PT050, đƣợc sử dụng trong làm sạch dịch chiết mẫu đất phục vụ cho phân tích các chất hữu cơ chậm phân hủy.
Máy đo huỳnh quang Centro-XS3 LB960, Berthold đƣợc sử dụng để đo mật độ ánh sáng huỳnh quang trong phản ứng phát quang của mẫu khi có mặt chất xúc tác thích hợp. Ứng dụng trong phân tích CALUX, động học enzym, xác định ATP,…
Bồn điều nhiệt Minder SD-Mini N, Thermo sử dụng môi trƣờng điều nhiệt là nƣớc cất, thiết bị điều chỉnh nhiệt độ môi trƣờng nƣớc.
Máy ly tâm Tabletop Centrifuge H36, Kokusan đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm với mục đích ly tâm phân tách hỗn hợp nhiều chất thành các pha tách ra khỏi nhau.
36
Pipet 10ml, 25ml
Micropitet và micropipet tip 10µl, 20µl, 200µl, 1000µl và 10ml
Multi-micropipet 8 kênh 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 30-300µl
Multi-micropipet đa kênh, 200µl/kênh.
Cân phân tích, cân kĩ thuật, máy lắc Vortex.
Các dụng cụ khác: ống chiết ly tâm 50ml, ống nghiệm thủy tinh 40ml, cốc thuỷ tinh, vial ly tâm 1,5ml.
Hóa chất và chất chuẩn
Chất chuẩn: là dung dịch 2,3,7,8-TCDD Code ED-901-B 50 µg/mL trong dung môi Dimetyl Sulfoxit
Các dung môi: axeton, n-hexan, dung môi Dimetyl Sulfoxit (DMSO)loại dùng cho phân tích sinh học
Muối NaCl
Dung dich H2SO4 đậm đặc (95-97%).
Chất môi trƣờng RPMI1640 có thành phần bao gồm: phenol đỏ, L- glutamin, NaHCO3, glucozơ 2g/l, pyridoxin hdrochloride C8H11NO3.HCl.
Dung dịch muối photphat PBS
Tế bào,bộ kit luciferin
Nƣớc cất, nƣớc deion, cồn 70%
2.2.3. Xử lý và phân tích mẫu
Mẫu sau khi đƣợc sơ chế đƣợc chuyển sang công đoạn xử lý mẫu. Quy trình xử lý mẫu bao gồm các công đoạn chiết tách và làm sạch đƣợc mô tả trong hình 2.4.
37
Hình 2.4. Quy trình chiết tách và làm sạch mẫu đất
Chiết siêu âm
Tiến hành chiết siêu âm mẫu đất với khối lƣợng cân thích hợp (5g) trong dung dịch 5% H2SO40,1M/aceton trong 15 phút. Sau đó hút 5 mL dich chiết sang ống nghiệm 40 mL, bổ xung dung dịch NaCl 5% và 2 mL hexan, tiến hành chiết lắc 2 phút để thu dịch chiết n-hexan.
Làm sạch dịch chiết
Dịch chiết mẫu đƣợc tiến hành làm sạch trên thiết bị làm sạch bán tự động SZ-DXN-PT050. Quy trình làm sạch đƣợc mô tả trong hình 2.4.
38
Hình 2.5. Quy trình làm sạch mẫu bằng hệ làm sạch bán tự động
Phân tích bằng CALUX
Dịch chiết mẫu sau khi làm sạch đƣợc sử dụng cho quá trình phân tích CALUX. Các chất dioxin/furan đƣợc định lƣợng dựa trên đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa giá trị ln[TCDD*100] và đơn vị ánh sáng tƣơng đối RLU. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng từ các dung dịch chuẩn 2,3,7,8-TCDD ở các nồng độ khác nhau và kiểm tra độ chính xác của đƣờng chuẩn bằng dung dịch kiểm chứng QC. [45]
39
Hình 2.6. Quy trình thí nghiệm CALUX
Các bƣớc chuẩn bị cho phân tích đo mật độ quang bao gồm:
- Chuẩn bị mẫu: mẫu sau khi làm sạch đƣợc pha loãng ở các tỉ lệ 1, 1/5 và 1/25 trong dung môi DMSO.
- Tạo môi trƣờng nuôi cấy: các mẫu sau khi pha loãng ở các tỉ lệ khác nhau đƣợc pha loãng tiếp 100 lần trong môi trƣờng nuôi cấy là media RPMI1640.
- Phơi nhiễm tế bào: cho mẫu vào các giếng chứa tế bào. Tiến hành ủ ở 37oC trong 19-24 giờ.
- Đo huỳnh quang xác định nồng độ TEQ tổng của chất trong mẫu.
Tính toán kết quả
Sau khi đo huỳnh quanh, kết quả đƣợc tính toán và xử lý bởi phần mềm chuyên dụng.
Quy trình xử lý số liệu phân tích nhƣ sau: Từ số liệu đo mật độ ánh sáng tƣơng đối (RLU- Relative Light Unit)→Hiệu chỉnh số liệu theo giá trị RLUmax→Tính toán kết quả theo đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của RLU vào nồng độ chất 2,3,7,8-TCDD.
40
CHƢƠNG 3 –KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP XỬ LÝ DIOXIN
3.1. PHÂN TÍCH XÁC NHẬN PHƢƠNG PHÁP 3.1.1. Đƣờng chuẩn của phƣơng pháp 3.1.1. Đƣờng chuẩn của phƣơng pháp
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng nhằm kiểm tra độ chính xác của phép phân tích, đồng thời là cơ sở để xác định hàm lƣợng chất phân tích có trong mẫu.
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên mối tƣơng quan giữa giá trị nồng độ chất 2,3,7,8-TCDD trong mẫu chuẩn và khả năng đáp ứng quang học của tế bào đối với mẫu chuẩn đó (ln[TCDD*100] và Relative Light Unit-RLU].
Đƣờng chuẩn gồm 10 điểm chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng: 0,0488 - 25 ng/mL.Dung dịch chuẩn đƣợc sử dụng là dung dịch D48-DM có thành phần là chất 2,3,7,8-TCDD nồng độ 50 ng/ml DMSO. Để kiểm tra độ chính xác của đƣờng chuẩn, chúng tôi tiến hành phân tích chất chuẩn kiểm chứng QC có nồng độ chính xác 2,3,7,8-TCDD 5 pg/ml.
Để dựng đƣờng chuẩn, tiến hành pha các dung dịch chuẩn từ dung dịch chuẩn gốc D48-DM, nồng độ các dung dịch chuẩn tại các điểm chuẩn đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nồng độ các dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn
Chất chuẩn
Nồng độ ( ng/ml )
STD0 STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 STD7 STD8 STD9
2,3,7,8-TCDD 25.0 12.5 6.25 3.13 1.56 0.781 0.391 0.195 0.0997 0.0488
Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành dựng đƣờng chuẩn cho phép phân tích, kết quả đƣợc mô tả trong hình 3.1.
41
Hình 3.1. Đƣờng chuẩn phân tích CALUX
Việc xây dựng đƣờng chuẩn phải đạt đƣợc các tiêu chuẩn sau:
-Các điểm chuẩn nằm trên đƣờng chuẩn hoặc dao động nhỏ xung quanh đƣờng chuẩn;
- Khoảng tuyến tính trong khoảng nồng độ từ điểm STD7 đến STD3 (nồng độ từ 195-3125 pg/ml);
- Hệ số đáp ứng tƣơng quan của nồng độ chất chất chuẩn trong đƣờng chuẩn so với giá trị lý thuyết không lệch quá 30%.
0 4000 8000 12000 16000 20000 24000 28000 2 4 6 8 10 RLU [2,3,7,8-TeCDD] CALUX-TeCDD STD Tên mẫu TCDD(*100) pg/ml Ln (TCDD*100) mật độ ánh sáng (RLU) STD1 12500.00 9.43 24471 STD2 6250.00 8.74 22274 STD3 3125.00 8.05 19066 STD4 1562.50 7.35 13393 STD5 781.25 6.66 9010 STD6 390.63 5.97 4429 STD7 195.31 5.27 2079 STD8 97.66 4.58 983 STD9 48.83 3.89 510 Tên mẫu Mật độ ánh sang (RLU) TCDD (pg/ml) Blank 0 ND Blank 0 ND STD9 510 0.424 STD8 983 1.007 STD7 2079 1.961 STD6 4429 3.830 STD5 9010 8.182 STD4 13393 14.635 STD3 19066 33.031 STD2 22274 62.386 STD1 24471 121.666 QC 4869 4.193
42
Kết quả đƣờng chuẩn chúng tôi xây dựng đƣợc đƣợc đối chiếu với nồng độ lý thuyết mô tả trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn thực tế
CLT: nồng độ chất chuẩn lý thuyết CTT:nồng độ chất chuẩn thực tế
Từ bảng so sánh trên có thể thấy sai số thực tế của đƣờng chuẩn mà chúng tôi thực hiện phù hợp giới hạn cho phép của phƣơng pháp (±30%).
3.1.2. Giới hạn xác định và giới hạn định lƣợng
Để xác định giới hạn định lƣợng và giới hạn phát hiện của phƣơng pháp, chúng tôi tiến hành thí nghiệm phân tích lặp với n=5 cho các điểm chuẩn từ STD0 đến STD10 nhƣ bảng 2.1 và điểm chuẩn STD10 có nồng độ 0,0244 pg TEQ/g. Bằng cách này ngƣời ta xác định đƣợc trong giới hạn cho phép của phƣơng pháp Calux, các giá trị giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng lần lƣợt là:
Điểm chuẩn CLT (ng/ml) CTT (ng/ml) Sai số so với lí thuyết (%) STD0 25.00 - - STD1 12.50 12.17 3 STD2 6.25 6.24 0 STD3 3.13 3.30 6 STD4 1.56 1.46 6 STD5 0.78 0.82 5 STD6 0.39 0.38 2 STD7 0.20 0.20 1 STD8 0.10 0.10 3 STD9 0.05 0.04 14 QC 5.00 4.19 16
43
LOD = 0,977 pg TEQ/ml LOQ = 1,95 pg TEQ/ml.
Bảng 3.3. Kết quả phân tích xác định LOD/LOQ của phương pháp CALUX
STD CLT (pg/ml) A.V RLU (n=5) Số lần lặp n (pg TEQ/ml) A.V S.D C.V A.V/CLT n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 STD0 250 24097 153 117 201 - 659 - - - - STD1 125 22465 109 62 132 82 343 146 113 77.8 1.16 STD2 62.5 20961 64.1 59 50.9 62 107.8 68.7 22.4 32.6 1.1 STD3 31.3 18196 28.8 30.5 34.3 36.9 44.1 34.9 6.01 17.2 1.12 STD4 15.6 12840 11.7 15.4 14.3 14.8 16.3 14.5 1.73 12 0.93 STD5 7.81 8810 7.37 7.3 8.39 8.27 8.73 8.01 0.65 8.1 1.03 STD6 3.91 4702 3.67 4.13 3.84 3.93 3.87 3.89 0.17 4.3 1.00 STD7 1.95 2454 1.9 1.89 1.98 2.46 2.16 2.08 0.24 11.6 1.06 STD8 0.977 1230 1 1.04 1.05 1.17 1.01 1.05 0.07 6.4 1.08 STD9 0.488 691 0.4 0.45 0.4 0.56 0.43 0.45 0.07 15.1 0.92 STD10 0.244 450 - - - - - - - - -
Hình 3.2. Đồ thị tƣơng quan ln[TCDD*100] và RLU của tế bào.
Trong trƣờng hợp với mẫu thật, LOD và LOQ sẽ đƣợc tính toán dựa trên khối lƣợng mẫu đem chiết, khối lƣợng dung dịch DMSO thu đƣợc sau làm sạch và giá trị LOD/LOQ lý thuyết. LOD và LOQ của mỗi mẫu là khác nhau do các khối
44
lƣợng cân của mẫu là khác nhau. LOD và LOQ của mẫu thật đƣợc xác định theo công thức sau: LOD = m DMSO DL V Q 100 LOQ = m DMSO QL V Q 100 Trong đó: QDL=0,977 pg/ml QQL=1,95 pg/ml
100 là hệ số pha loãng trong thí nghiệm
VDMSO là thể tích dung dịch DMSO sau làm sạch m = m0/4 với m0 là khối lƣợng mẫu đem chiết.
Với mẫu đất có khối lƣợng dịch làm sạch trung bình khoảng VDMSO = 0,3 ml; khối lƣợng mẫu cân trung bình m0 = 5g thì các giá trị giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng đối với mẫu thật tính đƣợc là:
LOD = 23,448 pg/g LOQ = 46,896 pg/g.
3.1.3. Phân tích đối chiếu xác nhận phƣơng pháp
Để khẳng định phƣơng pháp CALUX có thể áp dụng cho phân tích mẫu đất tại Việt Nam. Trong khuôn khổ của nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành phân tích cross-check kiểm tra chéo giữa hai PTN bao gồm: PTN Dioxin, Tổng cục Môi trƣờng và PTN của Đại học Ehime, Nhật Bản. Trong thí nghiệm này, thí nghiệm đƣợc so sánh với thí nghiệm do chuyên gia của PTN Đại học Ehime thực hiện. Ngoài ra, kết quả phân tích bằng CALUX còn đƣợc so sánh tƣơng quan với phƣơng pháp phân tích bằng sắc ký khí khối phổ phân giải cao (High Resolution Gas Chromatography-HRGCMS) cũng do hai phía thực hiện.
45
Thí nghiệm kiểm tra chéo đƣợc thực hiện với 7 mẫu đất trong đó có 2 mẫu kiểm chứng QC. Các kết quả đƣợc đƣợc tổng hợp trong bảng 3.4. Và từ các số liệu đó chúng tôi đã dựng đồ thị so sánh mối tƣơng quan giữa hai phép phân tích bằng CALUX và bằng HRGCMS (hình 3.3).
Bảng 3.4. Kết quả phân tích kiểm tra chéo giữa Việt Nam và Nhật Bản[23]
Tên mẫu Số lần phân tích n (pg TEQ/g) Ave.* (pgTEQ/g) S.D. C.V. HRGC-MS (pg TEQ/g) CALUX/ HRGC- MS n=1 n-2 n=3 Normal cell Ehime VN-1 0 0 0 0 - - 0 - VN-2 95 96 72 88 14 16 91 0.96 VN-3 168 211 186 188 21 11 210 0.90 VN-4 288 290 303 294 8 3 330 0.89 VN-5 787 1075 955 939 145 15 987 0.95 QC-4 1652 1890 1721 1754 122 7 1640 1.07 QC-5 675 883 695 751 115 15 761 0.99 Kit cell Ehime VN-1 - - - - - - 0 - VN-2 71 128 97 99 29 29 91 1.08 VN-3 169 300 163 211 77 37 210 1.00 VN-4 234 346 249 276 61 22 330 0.84 VN-5 657 1069 888 872 206 24 987 0.88 QC-4 1368 1426 1662 1485 155 10 1640 0.91 QC-5 529 876 605 670 183 27 761 0.88 CEM VN-1 30 55 44 43 - - 0 - VN-2 85 82 108 91 14 16 97 0.94 VN-3 113 186 300 200 94 47 244 0.82 VN-4 272 530 408 403 129 32 354 1.14 VN-5 760 496 474 576 159 28 1159 0.50 QC-4 1501 1993 1127 1540 435 28 1896 0.81 QC-5 561 574 861 665 170 26 887 0.75
46
b) c)
Hình 3.3. Đồ thị sosánh tƣơng quan giữa hai phƣơng pháp HRGCMS và CALUX[25]
a) Thí nghiệm với normal cell tại PTN Đại học Ehime; b,c) Thí nghiệm với kit cell tại PTN Đại học Ehime, PTN Dioxin
Các kết quả phân tích cho thấy tỉ lệ tƣơng quan giữa hai phƣơng pháp do hai PTN thực hiện đều trên 90%. Điều đó chứng tỏ rằng phƣờng pháp này hoàn toàn có thể đƣợc áp dụng cho phân tích nhanh xác định hàm lƣợng dioxin trong mẫu đất trong điều kiện thí nghiệm môi trƣờng tại Việt Nam.
47
3.2. PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG DIOXIN TRONG ĐẤT
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân tích xác định hàm lƣợng của