Các phương pháp phân tích công cụ
Dioxin là nhóm chất có nhiều đồng phân và nồng độ của chúng trong các mẫu môi trƣờng là vô cùng nhỏ (cỡ ppq đến ppb tức 10-15 đến 10-9 g/g). Việc phân tích xác định từng thành phần của chúng trong mẫu là vô cùng phức tạp. Phƣơng pháp phân tích yêu cầu phải đáp ứng đƣợc 2 yếu tố:Phân tích riêng rẽ từng đồng phân với hàm lƣợng siêu vết.
Nhóm các phƣơng pháp phân tích công cụ có thể đáp ứng các yêu cầu trên là nhóm thiết bị phân tích sắc ký khí ghép nối khổi phổ bao gồm: thiết bị sắc ký khí khối phổ phân giải cao (HRGC-HRMS), sắc ký khí ghép nối khối phổ ba lần tứ cực (GC-Triple Quadrupole MS), Sắc ký khí ghép nối khối phổ bẫy ion (GC- Ion trap MS)…Ƣu điểm của thiết bị sắc ký khí ghép nối khối phổ là sự kết hợp hoàn hảo của sắc ký khí cho phép xác định chất phân tích trong mẫu với độ phân giải cao dựa vào cơ chế làm giàu mẫu cùng chiều cao của pic sinh ra và khối phổ cho phép xác định chính xác từng thành phần chất phân tích có trong mẫu dựa vào tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) để xác định khối lƣợng ion phân mảnh của chất phân tích. Sự kết hợp này cho phép thiết bị có khả năng phân tích chính xác và riêng rẽ chất phân tích với hàm lƣợng siêu vết.
Phƣơng pháp 1613 đƣợc phát triển bởi Phòng Khoa Học và Công Nghệ thuộc Cơ quan Bảo Vệ Môi Trƣờng Hoa Kỳ để xác định đồng phân đặc trƣng của 17 chất dioxin/furans đƣợc thế 2,3,7,8 trong nền mẫu lỏng, rắn và thịt (cơ) bằng phƣơng pháp pha loãng đồng vị sắc ký khí ghép khối phổ cột mao quản độ phân giải cao (HRGC) ghép khối phổ phân giải cao (HRMS). Thiết bị phân tích HRGCMS có thể đạt đến độ phân giải 10.000, định lƣợng đƣợc đồng thời 17 đồng phân PCDDs/PCDFs trong mẫu ở mức giới hạn phát hiện có thể tới 0,1ppt.Chính nhờ 2 thông số này mà phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ phân giải cao HRGCMS cho phép phân tích với độ chính xác và độ nhạy cao hơnrất nhiều so với các phƣơng pháp khác.[41]
20
Tuy nhiên phƣơng pháp này đòi hỏi phòng thí nghiệm phải đầu tƣ một nguồn vốn lớn cho thiết bị sắc ký khí khối phổ và duy trì hoạt động của thiết bị này. Mặt khác phƣơng pháp này cần thời gian phân tích lâu hơn, chi phí cho xử lý mẫu và giá thành phân tíchmẫu đắt hơnnhiều so với các phƣơng pháp khác. Phƣơng pháp này chủ yếu phục vụ cho các phân tích đòi hỏi độ chính xác cao và xác định riêng rẽ hàm lƣợng của từng thành phần trong mẫu.
Các phương pháp phân tích sinh học
Ngày nay, việc xác định hàm lƣợng dioxin trong mẫu còn đƣợc thực hiện bằng các phƣơng pháp phân tích sinh học. Phân tích bằn công nghệ sinh học cho phép xác định nhanh các chất dioxin trong mẫu, giảm thiểu chi phí phân tích, rút ngắn thời gian phân tích, đem lại những lợi ích về mặt kinh tế.
Nhóm các phƣơng pháp phân tích bằng công nghệ sinh học đƣợc tóm tắt trong bảng 1.4.
Bảng 1.4.Các phương pháp sinh học xác định dioxin[29]
Phƣơng pháp Nguyên tắc
1. Phân tích dựa trên sự dẫn truyền tín hiệu AhR
Khi các dòng tế bào tiếp xúc với dioxin, AhR trong tế bào chất đƣợc kích hoạt, đi vàonhân tế bào và tạo thành một phức hợp với ARNT (thể vận chuyển AhR trong nhân). Phức hợp này tƣơng tác với các yếu tố đáp ứng dioxin DRE trong bộ gen và kích hoạt sự biểu hiện của gen mã hoá protein CYP1A1, đo đƣợc bởi một trong cácphép phân tích dƣới đây:
1.1. Q-PCR (Quantitative Polymerase Chain
Reaction)
Bằng việc phát hiện sự gia tăng lƣợng mARN mang thông tin mã hoá protein CYP1A1, có thể suy ra giá trị TEQ của dioxin so với chuẩn TCDD.
1.2. AHH/EROD (Arylhydrocarbon Hydroxylase/7-Ethoxy Resorufin-O-Deethylase)
Hoạt tính enzym của CYP1A1 đƣợc xác định bằng cách sử dụng các cơ chất nhƣ 7-ethoxyresorufin hoặc benzo(a)pyren, từ đó suy ra gía trị TEQ của dioxin so với chuẩn TCDD.
21
Bảng 1.4.Các phương pháp sinh học xác định dioxin (tiếp)[29]
Phƣơng pháp Nguyên tắc
1.3. CALUX
(Chemically Activated LUciferase gene eXpression)
Các dòng tế bào tái tổ hợp, đƣợc chuyển nhiễm một cách ổn định với ADN chứa gen reporter mã hoá enzym luciferase đom đóm có khả năng đáp ứng dioxin, đƣợc cho tiếp xúc với mẫu chứa dioxin. Khi các phân tử dioxin kích hoạt AhR, phức hợp AhR-ARNT đƣợc tạo thành và kích hoạt sự biểu hiện của gen reporter luciferase. Luciferase đƣợc đánh giá hoạt tính một cách dễ dàng trong một máy phát quang kế sau khi thêm cơ chất luciferin.
1.4. CAFLUX
(Chemically Activated green FLUorescent
protein gene
eXpression)
Phƣơng pháp này tƣơng tự với CALUX ngoại trừ việc gen mã hoá GFP (Green Fluorescent Protein - protein phát huỳnh quang màu lục) đƣợc sử dụng làm gen reporter. Gía trị TEQ của dioxin đƣợc xác định bằng việc đo cƣờng độ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ chất reporter GFP.
1.5. GRAB (Gel Retardation
of AhR Bioassay)
Mẫu chứa dioxin đƣợc ủ với dịch chiết bào tƣơng gan chứa AhR và ARNT. Các dioxin trong mẫu gây ra sự tạo thành các phức hợp AhR/ARNT đã hoạt hoá. Khi các phân tử ADN thăm dò đƣợc đánh dấu bởi đồng vị
32P chứa trình tự đồng thuận DRE liên kết với các phức hợp này, tốc độ dịch chuyển của các phân tử ADN thăm dò này trong gel polyacrylamid sẽ bị chậm lại so với phân tử thăm dò không liên kết.
22
Bảng 1.4.Các phương pháp sinh học xác định dioxin (tiếp)[29]
Phƣơng pháp Nguyên tắc
2.Phân tích dựa trên sự tăng sinh tế bào
Dioxin là các tác nhân hiệu quả gây ra bệnh mụn clo ở ngƣời, đƣợc đặc trƣng bởi sự keratin hoá quá mức. Bằng cách phát hiện sự phân hoá bất thƣờng của các tế bào da đƣợc tiếp xúc với mẫu phân tích, giá trị TEQ của dioxin có thể thu đƣợc bằng cách so sánh với chuẩn TCDD.
3. Phân tích dựa trên liên kết phối tử với AhR
Các phân tử dioxin trong mẫu cạnh tranh liên kết với AhR cùng với TCDD đƣợc đánh dấu bằng đồng vị. Vì vậy, nồng độ dioxin trong mẫu tỷ lệ với mức độ suy giảm hoạt độ phóng xạ của AhR.
4. Phân tích miễn dịch (Imunoassay)
Các phƣơng pháp này sử dụng phản ứng giữa kháng nguyên (dioxin hoặc AhR, ARNT) với các kháng thể đặc hiệu. 4.1. ELISA
(Enzyme-Linked ImmuneSorbent Assay)
Phƣơng pháp này dựa trên liên kết của dioxin với các kháng thể kháng dioxin. Các dioxin trong mẫu cạnh tranh liên kết với kháng thể kháng dioxin cùng với chất đồng loại chuẩn đƣợc gắn cố định trên đĩa. Sau khi rửa đi các phức hợp kháng nguyên-kháng thể tự do, các kháng thể liên kết với đồng loại chuẩn cố định đƣợc xác định bằng cách gắn với các kháng thể thứ cấp đƣợc liên hợp với một loại enzym, sau đó là phép đo hoạt độ enzym sử dụng một cơ chất có thể dễ dàng đo đạc.
Một cách khác, các dioxin trong mẫu cùng với các chất đồng loại chuẩn đƣợc liên hợp với một enzym cạnh tranh liên kết với các kháng thể kháng dioxin đƣợc gắn cố định trên đĩa, sau đó rửa và thực hiện phép đo hoạt độ enzym.Bằng cách sử dụng một đƣờng cong chuẩn tạo ra bởi các nồng độ đã biết trƣớc của các chất chuẩn dioxin, có thể suy ra đƣợc giá trị TEQ của các dioxin.
23
Bảng 1.4.Các phương pháp sinh học xác định dioxin (tiếp)[29]
Phƣơng pháp Nguyên tắc 4.2. DELFIA (Dissociation Enhanced Lanthanide Fluorescence ImmunoAssay)
Tƣơng tự với ELISA, ngoại trừ việc sử dụng Europium để dánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể.
4.3. RIA
(radioimmunoassay)
Các kháng nguyên chuẩn đƣợc đánh dấu phóng xạ (*Ag) và các kháng nguyên không đƣợc đánh dấu trong mẫu phân tích (Ag) cạnh tranh liên kết với các kháng thể đặc hiệu (Ab) và tạo thành các phức hợp *Ag-Ab hoặc Ag-Ab. Khi phản ứng liên kết đạt đến cân bằng, nếu lƣợng Ag tăng lên, lƣợng Ag-Ab tăng lên, trong khi lƣợng *Ag-Ab hơi giảm xuống và lƣợng *Ag tự do tăng lên, nghĩa là khối lƣợng của Ag tỷ lệ nghịch với khối lƣợng của phức hợp đánh dấu *Ag-Ab. Các phức hợp *Ag-Ab và Ag-Ab đƣợc kết tủa bằng cách thêm một kháng thể kháng Ab và tách ra khỏi hỗn hợp kháng nguyên tự do, sau đó đo hoạt độ phóng xạ để xác định hàm lƣợng của kháng nguyên trong mẫu phân tích. 4.4. Ah-Immunoassay Theo cơ chế dẫn truyền tín hiệu AhR, lƣợng dimer
AhR/ARNT có một mối tƣơng quan với hàm lƣợng dioxin. Trƣớc tiên, cố định phức hợp AhR/ARNT bằng các mảnh ADN chứa trình tự đồng thuận DRE đã đƣợc gắn cố định trên microplate. Sau đó phức hợp AhR/ARNT đƣợc phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể kháng AhR hoặc kháng ARNT.
24