0 KTSHPTUD ỨNG DỤNG PCR RFLP xác ĐỊNH đa HÌNH GENE

I • TỔNG QUAN II • QUY TRÌNH THỰC HIỆN III • ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN... TỔNG QUAN-2006, Trần Như Ngọc ”Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của nấm Me

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG KHOA KỸ THUẬT VÀ CNTP

Chủ đề :

XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH KIỂU GEN ACTN3 R577X

BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP CỦA MỘT SỐ VẬN ĐỘNG VIÊN ĐIỀN KINH VÀ BƠI LỘI Ở VIỆT NAM

I • TỔNG QUAN

II • QUY TRÌNH THỰC HIỆN

III

• ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

1979, ba vị trí cắt (1 của enzyme Pst I

và 2 của HindIII) liên quan đến đa hình giữa các cá thể

I TỔNG QUAN

I TỔNG QUAN

Locus ở các cá thể khác nhau có thể có 1 hay nhiều vị trí cắt khác nhau nên sản phẩm cắt giới hạn có chiều dài khác nhau → Sự đa dạng về chiều dài phân đoạn cắt giới hạn

( restriction fragment length polymorphism- RFLP)

RFLP: là kỹ thuật khai thác những khác biệt trong trình tự DNA DNA mẫu được cắt thành các đoạn nhỏ bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn, và sau đó các đoạn DNA nhỏ tạo thành được phân tách dựa theo kích thước bằng kỹ thuật điện di trên gel

phân biệt giống, phân biệt cá thể

phát hiện gene đã chuyển trong quá trình chuyển gene cây trồng

lập bản đồ di

truyền

phát hiện đột biến

I TỔNG QUAN

-1980, David Botstein đã ứng dụng kỹ thuật RFLP trong

“xây dựng bản đồ di truyền của người”

-1985: Jeffreys phát triển kỹ thuật RFLP để thử nghiệm

di truyền đầu tiên trên DNA ( DNA-fingerprinting)

-2013, Nejat Mahdieh “Tổng quan về Đột biến phương

pháp phát hiện trong các rối loạn di truyền”

I TỔNG QUAN

-2006, Trần Như Ngọc ”Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa

dạng di truyền của nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng gây hại”

-2011,Nguyễn Thị Thu Hương ”Nghiên cứu đột biến gen MLH1

liên quan đến ung thư ruột kết không không polyp di truyền bằng kỹ thuật PCR-RFLP”

-2011, Phạm Minh Huệ “Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở

người Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-RFLP”

-2013,Lê Hữu Song, Trần Thị Huyền Trang “nghiên cứu ứng dụng

kỹ thuật PCR-RFLP xác định kiểu gen của virus viêm gan B”

Tách chiết

và tinh sạch DNA của các mẫu Thực hiện phản ứng cắt DNA với cùng chủng loại

enzyme

Điện di và tiến hành phản ứng Southern lot

II QUY TRÌNH THỰC HIỆN RFLP

Các bước thực hiện:

II QUY TRÌNH THỰC HIỆN RFLP

Hóa chất sử dụng:

-Hóa chất dùng để thu nhận và tách chiết DNA :

+ Đệm STE(NaCl, Tris-HCl, EDTA)

+Dung dịch PCl( Phenol: Chloroform: Isoamylcohol Tỉ lệ 25:24:1)

+TE 1X

-Hóa chất chạy điện di:

+ TAE, Loading dye, nước cất 2 lần, agarose hoặc polyacrylamide

II QUY TRÌNH THỰC HIỆN

-Maker đồng trội cho phép

phát hiện đồng hợp và dị

hợp.

-Kích thước DNA lớn do đó

số lượng dấu phân tử tạo ra

nhiều đáp ứng nhu cầu

nghiên cứu.

-Quy trình thực hiện phức tạp -Có hại sức khỏe người nghiên cứu do sử dụng phóng

RFLP truyền

PCR

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

239 gene liên quan đến hoạt động thể chất, 7 gene nằm trên NST, 18 gene ty thể cũng liên quan đến hoạt động thể chất

-Sự biểu hiện của protein actinin-3 liên quan đến sợi cơ co nhanh loại II (Mills và cs, 2001)

α-Z-line giúp nâng đỡ, sắp xếp các sợi myosin (Yang và cs, 2003)

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

Năm 2012 Ahmetov và cs tìm ra 36 gene quyết định tới sức mạnh và sức bền của hoạt động thể chất con người, được phân thành các nhóm chỉ thị di truyền liên quan đến thành tích thi đấu của các VĐV thể thao

α-actinin-3 tác động lớn hơn đến hiệu quả hoạt động của sợi cơ co nhanh

loại II (Mills và cs, 2001)

Gen ACTN3 mã hóa cho α-actinin-3 có một nucleotide khác nhau giữa

các cá thể, mã di truyền có nucleotide này mã hóa cho protein thứ 577 (R hay X)

XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH KIỂU GEN

ACTN3 R577X BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

CỦA MỘT SỐ VẬN ĐỘNG VIÊN ĐIỀN KINH

VÀ BƠI LỘI Ở VIỆT NAM

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

1.Vật liệu nghiên cứu

• Mẫu nghiên cứu:

-Tế bào niêm mạc miệng của 54 VĐV điền kinh, 34 VĐV bơi lội

-40 sinh viên tình nguyện từ trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội làm mẫu đối chứng

• ống nghiệm, eppendorf, pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đựng hóa chất,hộp đựng đá…

• Dung dịch nhuộm gel(0.1µg/ml ethidium bromide)

• Loading dye(0.03% brommophenol blue, 100mM Tris-HCl(pH 7.6), 60% Glycerol, 60mM EDTA)

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

2.Quy trình thực hiện Thu tế bào niêm mạc

Tách chiết DNA

Khuếch đại gene ACTN3 với

cặp mồi đặc hiệu Tinh sạch sản phẩm PCR

Cắt bằng enzyme cắt giới

hạn DdeI Điện di trên gel agarose Xác định đa hình gene

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

2.Quy trình thực hiện

Quy trình tách chiết DNA từ mẫu tế bào niêm mạc

miệng(quy trình tách chiết của bộ kit Buccal Swab DNA

extraction kit của hãng GeneShun Biotech)

Phương pháp ly trích DNA

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

Khuếch đại vùng exon 16 của gene ACTN3 R577X bằng kỹ thuật PCR:

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene

ACTN3 R577X:

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

2.Quy trình thực hiện

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

2.Quy trình thực hiện

Tinh sạch sản phẩm PCR: Chuyển sang ống DNA

spin column/ 2ml sạch

Thêm 500 µl đệm rửa PE

Thêm 3 lần thể tích đệm

BD vào, trộn đều

Li tâm tiếp cột lọc 12000rpm/ 2 phút

Chuyển cột vào ống li tâm 1,5 ml sạch

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

2.Quy trình thực hiện

Phương pháp PCR-RFLP

Thành phần và điều kiện phản ứng cắt Enzyme giới hạn DdeI

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

2.Quy trình thực hiện

Sản phẩm PCR tinh sạch tiến hành điện di trên gel agarose với nồng độ khác nhau: 0.8%, 1.5%, 2% Thời gian 30-45 phút, hiệu điện thế 100V

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

3 Kết quả và thảo luận

Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu niêm mạc miệng:

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

Khuếch đại vùng exon 16 của gene ACTN3 thông qua

phản ứng PCR

3 Kết quả và thảo luận

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

3 Kết quả và thảo luận

Tinh sạch sản phẩm PCR:

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

3 Kết quả và thảo luận

Phân tích RFLP-PCR vùng exon 16 của gene ACTN3:

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

3 Kết quả và thảo luận

Kết quả giải trình tự ACTN3 R577X

B11

B9

K18

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

3 Kết quả và thảo luận

Phân bố tần số kiểu gene ACTN3 R577X và tần số alen R/X:

III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN

3 Kết quả và thảo luận

- Kiểu gene RR có liên quan mật thiết với sức nhanh - mạnh của VĐV và kiểu gene XX (gây ra thiếu hụt α-actinin-3, tạo ra nhiều sợi co chậm) được mặc nhiên công nhận có đóng góp vào sức bền về mặt lý thuyết của VĐV

- Tuy nhiên số mẫu ít nên không thể kiểm định chính xác

CÂU HỎI ÔN TẬP

Câu 1 Định nghĩa, ưu điểm và ứng dụng của kỹ thuật RFLP? Phương pháp nào khắc phục được nhược điểm của

kỹ thuật này?

Câu 2: Đa hình gen là gì? Vì sao đoạn exon 16 ACTN3

được sử dụng để nghiên cứu đa hình gene?

Câu 3 Các phương pháp nghiên cứu để xác định đa hình

gene ACTN3 R577X?

Câu 4 Đặc điểm chức năng gen ACTN3?

KYOU SO

MUCH