ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN

Nhiễm khuẩn Salmonella trong các sản phẩm thực phẩm, đặc biệt là các sản phẩm thủy sản là một trong những nguyên nhân chính, đứng thứ hai chỉ sau tác nhân Campylobacter, gây ra các vụ n

I MỞ ĐẦU

Sử dụng thực phẩm chế biến sẵn, ăn hải sản tươi sống, hiện nay đang dần trở thành những thói quen của người tiêu dùng Các mặt hàng thực phẩm từ tươi sống, sơ chế đến chế biến sẵn đang có mặt ngày càng đa dạng trên các quầy hàng, siêu thị Công việc bếp núc ngày càng được nhẹ nhàng, tiện lợi hơn Tuy nhiên, điều này cũng đặt ra cho các nhà sản xuất, các nhà quản lý một trách nhiệm, làm sao để các sản phẩm thực phẩm phải thật sự an toàn, vệ sinh

Nhiễm khuẩn Salmonella trong các sản phẩm thực phẩm, đặc biệt là các sản phẩm

thủy sản là một trong những nguyên nhân chính, đứng thứ hai chỉ sau tác nhân

Campylobacter, gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh Sự nhiễm khuẩn Salmonella có thể xảy ra ở bất kỳ công đoạn nào của quá trình chế biến thực phẩm.

Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ban hành ngày 31/8/2001 của Bộ Y Tế về giới

hạn ô nhiễm vi sinh trong thực phẩm qui định không cho phép có Salmonella trong 25g

(ml) bất kỳ loại thực phẩm nào

Trước đây, khâu kiểm nghiệm vi sinh mẫu tốn rất nhiều thời gian Phương pháp

định tính Salmonella truyền thống bằng nuôi cấy định danh mất từ 4-6 ngày, nhiều khi

ảnh hưởng đến hoạt động sản xuất kinh doanh của doanh nghiệp, ảnh hưởng đến vấn đề tầm soát an toàn vệ sinh thực phẩm

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học, công nghệ sinh học được ứng dụng rộng

rãi, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) cũng được áp dụng để chẩn đoán nhanh

Salmonella trong thực phẩm và cho kết quả trong vòng 24 giờ Các bộ kít PCR còn có

khả năng giúp người thi hành công vụ giám sát được vệ sinh an toàn thực phẩm mà không tốn nhiều thời gian, việc kiểm tra chất lượng vi sinh qua từng khâu sản xuất trở nên dễ dàng, thuận lợi

Schweinittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây nên và

đã xác định S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.

- Năm 1888, A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người

bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là S.enteritidis Vi khuẩn này cũng được gọi bằng nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner…

- Năm 1889, Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được S.pullorum năm 1909 Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai bệnh khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) và căn bệnh có tên chung là S.gallinarum –pullorum.

- Năm 1896, C.Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn

S.paratyphi equi và S.paratyphi bacilus Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là S.paratyphi B và đến năm 1898, S.paratyphi A đã tìm được do N.Guyn và H Keyser

- Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của chúng như S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó), hoặc theo vật chủ như S.typhimurium gây bệnh ở chuột (murine = chuột), về sau người ta

thấy rằng 1 loài Salmonella có thể gây ra nhiều hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài khác nhau Vì những lý do đó mà các chủng Salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập như S.teheran, S.congo, S.london.

- Salmonella đã từng được chia thành các chi phụ và nhiều loài, mỗi loài

lại có khả năng có chi phụ Ví dụ như loài Salmonella enterica được chia thành 6 loài

phụ gồm S.enterica, S.salamae, S.arizonae, S.diarizonae, S.houtenae và S.indica.

- Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, những nghiên cứu sau này

cho phép xếp tất cả các loại Salmonella vào 1 loài duy nhất Mặc dù ý kiến này đã được

nêu ra nhưng cách truyền thống đã được sử dụng quá quen và có ý nghĩa riêng nên nó không được chấp nhận

- Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu là kháng nguyên thân O và

kháng nguyên lông H, Salmonella được chia thành các nhóm và các type huyết thanh Hiện nay được xác định gồm trên 2500 type huyết thanh Salmonella.

2.2.3 Đặc điểm

2.2.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy

- Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ 2 – 3 x 0,5 – 1 µm,

di chuyển bằng tiên mao trừ S gallimarum và S pullorum, không tạo bào tử, chúng phát

triển tốt ở nhiệt độ 60C – 420C, thích hợp nhất ở 350C – 370C, pH từ 6 – 9 và thích hợp nhất ở pH = 7,2 Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày

- Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi phát triển được trên các môi trường nuôi

cấy thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn

nên thường được dùng để phân lập Salmonella Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên

môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ

Hình 1: Vi khẩn

Salmonella

men lactose, lên men đường glucose và sinh hơi Thường không lên men sucrose, salicin

và inositol, sử dụng được citrate ở môn trường Simmons

- Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các ngoại lệ được xác định là S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và S.Cholerasuis không

sinh H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại

E.Coli, Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác.

2.2.4 Cấu trúc của Salmonella

- Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K

Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào

giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu

- Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O)

+ Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp Trong cùng

là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide

+ Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố của Nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu Kháng nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide (LPS) Tính đặc hiệu

của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau : kháng nguyên

O ngoài LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm 3 thành phần : Lipid A, polysaccharide lõi, kháng nguyên O Màng ngoài còn có thêm các protein: Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô

cơ Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài

- Kháng nguyên lông (kháng nguyên H)

+ Kháng nguyên H: Chỉ có ở các Salmonella có lông Hầu hết Salmonella đều có lông chỉ trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm Kháng nguyên H là một loại

kháng nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên O Kháng nguyên H rất

dễ bị phá huỷ ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu

+ Kháng nguyên H chia làm 2 phase :

 Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị bằng chữa số La tinh thường: a, b, c…

 Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại

khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở E.coli Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng

chữa số Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x…

- Kháng nguyên vỏ K

+ Kháng nguyên K: Không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ là kháng nguyên

Vi và cũng có ở 2 type huyết thanh S.typhi và S.paratyphi Kháng nguyên Vi – angtigen

được Felix và các cộng sự phát hiện năm 1935 Kháng nguyên Vi gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt vỏ, kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên

2.2.5 Yếu tố độc lực

- Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố + Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét,

độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật

+ Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột

2.2.6 Nguồn gốc lây nhiễm

- Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn Tất cả các thức ăn

tươi sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn này sống tự do trong ruột động vật và có trên lông Gia cầm có nhiều Salmonella nhất, tiếp

theo là các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa, chó, ếch, chim mông biển, loài gặm nhấm, rắn) Vi khuẩn này có thể có trong thành phần dẫn xuất các chất từ động vật như gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi côn trùng, loài gặm nhấm, chim hoặc các sản phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm Ngoài ra có thể bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này Thực phẩm có nguồn gốc thực vật ít có nguy cơ nhiễm khuẩn Vì lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt vi khuẩn lactic nên các sản phẩm lên men ít bị nhiễm Trứng và các sản phẩm trứng ví dụ như bột nhào, nước sốt

mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn mang nhiều Salmonella, nên

trứng của nó cũng bị nhiễm vì vi khuẩn này có thể xuyên qua vỏ trứng và sinh sản trong lòng đỏ trứng

- Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kem chất béo sữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các thiết bị đều có thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi choSalmonella, và từ đó gây nhiễm độc cho sản phẩm sữa Nếu tiến hành axit hóa chậm thì vi khuẩn dễ dàng sinh sản trong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5 Những sản phẩm có sữa phải được

giám sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh trùng nữa, vì vậy nếu có Salmonella

trong sữa bột thì chúng vẫn có thể sinh sản được bởi chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khô hạn và lây nhiễm sang các sản phẩm khác

2.2 Phương pháp định tính Salmonella bằng nuôi cấy truyền thống

Phương pháp này chỉ dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện

Salmonella trên lượng mẫu đã lấy

Qui trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải trải qua bốn giai đoạn: tăng sinh, tăng sinh

chọn lọc, phân lập và khẳng định; và phải sử dụng chủng chứng trong toàn bộ quá trình phân tích Với tổng thời gian thực hiện quá trình từ 4- 6 ngày

- Tiền tăng sinh: Mẫu được tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn

lọc (peptone đệm) Nguyên tắc là trộn 1 phần mẫu với 9 phần nước pepton đệm Nếu dùng 25g mẫu cần làm dập và hòa đều lượng mẫu đó với 225ml nước pepton đệm, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu từ 15-30 giây Ủ ở 37oC trong 18- 24 giờ

- Tăng sinh: Mẫu sau khi tiền tăng sinh chuyển qua tăng sinh trong môi trường

tăng sinh chọn lọc Cấy chuyền 0,1ml dịch tiền tăng sinh sang môi trường Rapparport Vassiliadis soy pepton Ủ ở 42oC trong khoảng 24 ± 3 giờ

- Phân lập: cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang hai môi

trường rắn chọn lọc (XLD và BPLS) sao cho có thể tạo được những khuẩn lạc tách rời Lật ngược đĩa ủ ở 370C khoảng 24 ± 3 giờ

+ Trên môi trường XLD: khuẩn lạc Salmonella điển hình trong, hơi nhuốm đỏ do sự

thay đổi chất chỉ thị trong môi trường, phần lớn có tâm đen Bao giờ cũng nhận thấy một vùng môi trường đỏ lớn hoặc nhỏ (đặc biệt khi salmonella mọc dày) quanh khuẩn lạc

+ Trên môi trường BPLS: khuẩn lạc Salmonella điển hình trong suốt và hơi đỏ trong môi

trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc

Kinh nghiệm là rất quan trọng trong việc nhận biết khuẩn lạc Salmonella Hình thái của

chúng ít nhiều có biến động, không chỉ theo kiểu kháng huyết thanh mà còn theo sự khác biệt giữa các lô môi trường được sử dụng

- Khẳng định: Cấy chuyền khuẩn lạc nghi Salmonella sang môi trường thích hợp,

thẩm tra bằng các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc điển hình hay nghi ngờ ở mỗi đĩa cấy chuyển sang môi trường rắn không chọn lọc (TSA), ủ ở 370C trong khoảng 18-24 giờ

+ Thử nghiệm sinh hóa: Cần tiến hành kiểm tra khẳng định bằng các thử nghiệm sinh

hóa phù hợp Có thể kết luận mẫu có Salmonella khi có chứa những trực khuẩn gram âm

tạo khuẩn lạc đặc trưng trên các môi trường phân lập và cho những kết quả sinh hóa sau: Lactose (-), sucrose (+), urease (-), Indol (-), VP (-), TDA (-), Mannitol (+) Để bổ sung

có thể dùng thêm một số thử nghiệm như LDC, ODC và amygdaline

+ Khẳng định bằng huyết thanh kháng: Thử nghiệm huyết thanh kháng nên được dùng song song với nước muối sinh lý; huyết thanh kháng dùng là Salmonella polyvalent O-antiserum và Salmonella polyvalent H-antiserum

Kết quả: Phát hiện (hay không phát hiện) Salmonella trong 25g mẫu.

2.3 Giới thiệu về kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993 Kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới.

2.3.2 Nguyên lý

Nguyên lý nhân gen trong tế bào:

DNA là vật chất di truyền của cơ thể sống quy định lên đặc tính của cơ thể (ngoại trừ một số loại virus có vật chất di truyền là RNA) Đối với những sinh vật có cấu trúc tế bào nhân chuẩn, các phân tử DNA tồn tại dưới dạng kết hợp với protein thành các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào Ngoài ra, tại các cơ quan như ty thể và lạp thể (ở thực vật) cũng chứa DNA ở dạng plasmid

Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thường chỉ được nhân lên trong quá trình phân bào nguyên nhiễm Để thực hiện được quá trình này, đòi hỏi phải có mặt enzym DNA polymerase, sự tham gia của các đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn vào vào sợi DNA khuôn và các dNTPs làm nguồn cung cấp nucleotit Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép được mở xuắn tách thành các sợi DNA sợi đơn Dưới tác dụng của enzim DNA polymerase, quá trình tổng hợp DNA được xảy ra theo cách gắn lần lượt các nucleotit vào đoạn mồi để kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn

Nguyên lý của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:

+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzim helicase

+ Kết hợp với enzim DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp

+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt, chủ động.

Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng) Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 1000C Ở nhiệt độ này DNA sẽ bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng)

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau

Chu kỳ của phản ứng PCR: gồm ba giai đoạn

- Giai đoạn biến tính: Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến t1inh ở

nhiệt độ cao (thường từ 94-950C, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn

- Giai đoạn lai: nhiệt độ được hạ thấp (thường 40-700C, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-50C) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng

cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Các thành phần của phản ứng PCR:

- Primer (mồi):

+ Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA Chúng bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reserse primer)

+ Mồi là một chỉ tiêu quan trọng của phản ứng PCR để quyết định tính đặc trưng và hiệu quả của phản ứng Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định: dài khoảng 8-24base; nhiệt độ gắn mồi của 2 mồi gần nhau; thành phần nucleotic của các mồi cần trách các cặp GC lặp

đi lặp lại nhiều lần; mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại; không hình thành primer dimer, không phải là trình tự lặp lại

- DNA bản mẫu (DNA template): hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch,

không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS), chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin …) PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay những mẫu DNA không được bảo quản tốt

- Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động của Tag polymerase, hàm lượng quá cao sẽ

tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì giảm hiệu quả nhân bản của enzym, Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều lần thử nghiệm

- dNTP (deoxy nucleoside triphosphate): thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng,

sự mất cân bằng làm tăng các lỗi sao chép của polymerase Hàm lượng thường không đổi nhưng có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế

- Enzym polymerase chịu nhiệt: Là enzim xúc tác cho quá trình lắp ráp các

nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp, phải là men polymerase chịu được nhiệt độ cao Taq polymerase là DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường Taq polymerase được nhà vi sinh vật học Thomas Brock phát hiện ở Thermus aquaticus một loài vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao Enzym chịu nhiệt này giúp giải quyết vấn đề của enzym biến tính sau mỗi chu kỳ Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người ta đã tách chiết thêmđược các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR như Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UITma DNA polymerase (Thermotoga maritima) …