Bài viết này đưa ra những dữ liệu phân tích HLA bằng kỹ thuật sinh học phân tử ở mức độ phân giải 2 chữ số cho các allen HLA lớp I và HLA lớp II, xác định tần suất bắt gặp các allen HLA lớp I và lớp II ở cộng đồng người Kinh Việt Nam.
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 ỨNG DỤNG PCR-SSP XÁC ĐỊNH TẦN SUẤT BẮT GẶP CÁC ALLEN LOCUS HLA LỚP I VÀ LỚP II Ở QUẦN THỂ NGƢỜI KINH VIỆT NAM Lê Xuân Hải* CS TÓM TẮT Nghiên cứu người cho người nhận (đều người Kinh) làm xét nghiệm Viện Huyết học Truyền máu Trung Ương từ tháng - 2010 đến 11 - 2010 Định nhóm HLA-A, -B, -DRB1 từ 761 người HLA-C, -DQB1 từ 185 người kỹ thuật PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction Sequence-specific Primer), đánh giá tần suất bắt gặp allen locus Kết quả: allen có tần suất gặp cao A*02(22.60), A*11(31.41), A*24(18.33), A*33(12.42), B*15(23.52), B*46(11.50), CW*01(18.65), CW*03(24.32), CW*07(18.92, CW*08(16.49), DRB1*09(11.17), DRB1*12(30.09), DRB1*15(10.97), DQB1*02(16.76), DQB1*03(45.95), DQB1*05(19.46), DQB1*06 (15.14) Dữ liệu phân tích HLA chúng tơi cho thấy có tương đồng locus HLA tần suất bắt gặp allen HLA với vùng Nam Trung Hoa nước lân cận vùng Đông Nam Á Việc xác định tần suất phân bổ HLA người Việt Nam giúp có thơng tin định hướng để tiên lượng khả tìm kiếm người cho phù hợp HLA * Từ khóa: HLA; Tần suất; PCR-SSP; Ng-êi ViƯt Nam Applying PCR-SSP in identification of frequent alleles locus HLA typing I and II in Vietnamese summary HLA-A, -B, -DRB1 from 761 Kinh Vietnamese and HLA-C, -DQB1 from 185 Kinh Vietnamese were typed by PCR-SSP method and the frequency of loci were estimated Result: The most frequent alleles were A*02(22.60), A*11(31.41), A*24(18.33), A*33(12.42), B*15(23.52), B*46(11.50), CW*01(18.65), CW*03(24.32), CW*07(18.92, CW*08(16.49), DRB1*09(11.17), DRB1*12(30.09), DRB1*15(10.97), DQB1*02(16.76), DQB1*03(45.95), DQB1*05(19.46), DQB1*06 (15.14), respectively Our HLA typing data showed similarity between neighbor and related countries in Southeat Asia Identifying HLA alleles helps to find suitable donors for patients in need of hematopoietic stem cell and organ transplantation * Key words: HLA; Frequency; PCR-SSP, Vietnamese ĐẶT VẤN ĐỀ Trong gen người, gen kháng nguyên HLA (Human Leukocyte Antigen - Kháng nguyên bạch cầu người, hay gọi phức hợp kháng nguyên hòa hợp tổ chức - Major Histocombility Complex, MHC) locus gen có tính đa hình cao * Viện Huyết học - Truyền máu TW Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS TS Hoàng Văn Lương PGS TS Trần Văn Khoa TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Các kháng nguyên có bề mặt tế bào lympho T đóng vai trò quan trọng điều hòa hoạt động hệ thống miễn dịch Nghiên cứu phân tử HLA liên quan đến nhiều lĩnh vực vai trò bảo vệ thể thông qua chế nhận diện kháng nguyên “của thể” kháng nguyên “không thuộc thể”, khả đậu ghép thành công ca ghép Các phân tử HLA rào cản ghép Trong ghép tế bào gốc tạo máu, vai trò HLA ảnh hưởng rõ rệt trực tiếp đến kết ghép thời gian sống bệnh nhân (BN) bệnh ghép chống chủ Định nhóm HLA công cụ quan trọng để xác định tần suất bắt gặp allen Tần suất bắt gặp allen HLA khác nhóm chủng tộc, vậy, BN dễ dàng tìm người cho phù hợp HLA nhóm chủng tộc [1] Nghiên cứu Jhonson CS cho thấy 25% BN có hội tìm người cho phù hợp hồn tồn HLA người cho có HLA khơng phù hợp từ thành viên gia đình, 65% BN tìm người cho khơng huyết thống phù hợp hồn tồn HLA thơng qua chương trình tế bào gốc quốc gia quốc tế [4] Tuy nhiên, có khoảng 10% BN khơng tìm người cho phù hợp HLA khác biệt phân bố nửa nhánh HLA (HLA haplotype) phân bố allen HLA theo chủng tộc, BN ghép Hiện nay, nhiều trung tâm ghép ứng dụng phương pháp định nhóm HLA kỹ thuật ADN cho phép phân tích HLA mức độ allen Với phương pháp cho phép lựa chọn người cho phù hợp HLA mức allen làm giảm nguy GVHD nguy thải ghép, làm tăng thời gian sống cho BN Cho đến có vài nghiên cứu cơng bố tần suất bắt gặp allen HLA nhóm người Kinh Bắc Nam Việt Nam, số liệu thu thập nhỏ, hạn chế khoảng 100 người Trong nghiên cứu này, đưa liệu phân tích HLA kỹ thuật sinh học phân tử mức độ phân giải chữ số cho allen HLA lớp I HLA lớp II, xác định tần suất bắt gặp allen HLA lớp I lớp II cộng đồng người Kinh Việt Nam ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 761 người Kinh đến làm xét nghiệm HLA Khoa Miễn dịch - Di truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương từ - 2010 đến 11 - 2012, đó, 185 người làm HLA ghép tủy (ABCDRDQ) 576 người làm HLA ghép thận (ABDR) Phƣơng pháp nghiên cứu * Lấy mẫu: lấy máu ngoại vi (8 ml) từ tĩnh mạch người cho BN đến làm xét nghiệm Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương * Định nhóm HLA: tách ADN cho định týp HLA từ máu ngoại vi kít chuẩn Qiagen Mini-Blood collection kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, Mü) kít EZ High DNA Extraction Kit (Texas BioGen Inc, Texas, Mỹ) HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ xác định tới chữ số phương pháp PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction Sequence-specific Primer) Kít Morgan HLA ABDR, C DQ SSP Typing (Texas BioGen Inc, Texas, Mỹ), Micro SSP Generic HLA Class I & II DNA ABDR, C DQ Typing Tray (OneLambda Inc, CA, Mỹ) dùng để nhân đoạn gen locus HLA-A, -B, -C, DRB1 -DQB1 theo hướng dẫn nhà sản xuất Phân tách sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% Tất gel đọc, ghi lại kết kiểu hình xuất băng dương tính phân tích phần mềm chun biệt cho loại kít TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tơi thu thập kết phân tích HLA lớp I II 761 người Kinh (Việt Nam) Với HLA-A, -B -DRB1, phân tích 761 người, với tổng số 761 x = allen loại Với HLA-C HLA-DQB1, phân tích 185 người, với tổng số 185 x = 370 allen loại Tần suất bắt gặp allen lớp I (locus HLA-A, HLA-B HLA-C) trình bày bảng Tổng số phát 18 loại allen HLA-A, 28 loại allen HLA-B 12 loại allen HLA-C quần thể người Kinh (Việt Nam) Với locus A, phát 18 loại allen HLA-A Trong đó, A*11 A*02 (31,41% 22,6%) allen hay gặp nhất, sau A*24 (18,33%) A*33 (12,42%) Các allen gặp (tần suất < 5%) A*29(4,6%), A*26 (2,56%), A*03 (1,38%), A*31 (0,85%), A*30 (0,79%), A*68 (0,79%), A*66 (0,53%), A*74 (0,39%), A*32 (0,26%), A*34 (0,26%) A*69 (0,2%) Cũng bắt gặp số allen quần thể người Kinh A*23 A*36 (0,07%) Đã có số nghiên cứu tần suất allen HLA quần thể người Kinh (Việt Nam) Với HLA-A, nghiên cứu Phan Nguyễn Thanh Vân (n = 45) cho thấy allen A hay gặp nhất, A*11 (27,78%), A*24 (20%), A*02 (17,78%) A*33 (8,89%) [7]; nghiên cứu Nguyễn Trường Sơn (n = 86) cho thấy thứ tự allen HLA-A hay gặp nhất, A*11 (31,39%), A*24 (21,51%), A*02 (18,02%) [6] Nghiên cứu (n = 761) thấy locus HLA-A, A*11, A*02, A*24 A*33 allen hay gặp Như vậy, có tương đồng kết nhóm nghiên cứu khác Bảng 1: Tần suất bắt gặp allen HLA lớp I người Kinh (Việt Nam) n TẦN SUẤT (%) ALLEN n TẦN SUẤT (%) ALLEN n TẦN SUẤT (%) A*01 38 2,50 B*07 107 7,03 CW*01 69 18,65 A*02 344 22,60 B*08 0,39 CW*02 0,27 A*03 21 1,38 B*13 81 5,32 CW*03 90 24,32 A*11 478 31,41 B*14 0,20 CW*04 35 9,46 A*23 0,07 B*15 358 23,52 CW*05 0,54 A*24 279 18,33 B*18 22 1,45 CW*06 2,16 A*26 39 2,56 B*27 39 2,56 CW*07 70 18,92 A*29 70 4,60 B*28 0,07 CW*08 61 16,49 A*30 12 0,79 B*35 70 4,60 CW*10 0,27 A*31 13 0,85 B*37 0,53 CW*12 12 3,24 A*32 0,26 B*38 97 6,37 CW*14 1,08 A*33 189 12,42 B*39 37 2,43 CW*15 17 4,59 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 (1) (2) (3) (4) (5) (6) A*34 0,26 B*40 106 6,96 A*36 0,07 B*41 0,20 A*66 0,53 B*44 63 4,14 A*68 12 0,79 B*46 175 11,50 A*69 0,20 B*47 0,07 A*74 0,39 B*48 18 1,18 B*50 0,07 B*51 60 3,94 B*52 12 0,79 B*53 0,20 B*54 45 2,96 B*55 33 2,17 B*56 27 1,77 B*57 33 2,17 B*58 111 7,29 B*73 0,13 28 allen 1.522 100% 18 allen 1.522 100% Với locus B, phát 28 loại allen HLA-B Trong đó, B*15 B*46 (23,52% 11,5%) allen hay gặp nhất, tần suất bắt gặp lớn nhiều so với allen có tần suất bắt gặp nhiều B*58, B*07, B*40 B*38 (7,29%, 7,03%, 6,96%, 6,37%) Các allen B*28, B*47, B*50 gặp quần thể người Kinh (Việt Nam) với tần suất bắt gặp 0,7% (1 1.522) Kết phù hợp với nghiên cứu Bạch Khánh Hòa (hay gặp B*15, B*46) [2], khác với nghiên cứu Nguyễn Trường Sơn (hay gặp B*15, sau B*07) [6] Các allen B (7) (8) (9) 12 allen 370 100% gặp B*28 (0,07%), B*47 (0,07%), B*50 (0,07%), B*73(0.,3%), B*53(0,2%), B*41 (0,2%), B*14 (0,2%) Với locus HLA-C, phát 12 loại allen người Kinh (Việt Nam) Trong đó, loại allen hay gặp Cw*03(24.32%), Cw*07(18.92%), Cw*01(18.65%), Cw*08(16.49%) Có allen hiếm, phát tổng số 370 allen, chiếm 0,27% Cw*02 Cw*10 Trong nghiên cứu Bạch Khánh Hòa (n = 170), allen hay gặp Cw*01 Cw*07 Tần suất bắt gặp allen lớp II (locus HLA-DRB1 HLA-DQB1) trình bày bảng Tổng số phát 13 loại TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 allen HLA-DRB1 loại allen HLA-DQB1 quần thể người Kinh (Việt Nam) Bảng 2: Tần suất bắt gặp allen HLA lớp II người Kinh Việt Nam n n (%) (%) DRB1*01 0,46 DQB1*02 62 16,76 DRB1*03 102 6,70 DQB1*03 170 45,95 DRB1*04 114 7,49 DQB1*04 2,43 DRB1*07 96 6,31 DQB1*05 72 19,46 DRB1*08 87 5,72 DQB1*06 56 15,14 DRB1*09 170 11,17 DQB1*08 0,27 DRB1*10 76 4,99 DRB1*11 45 2,96 DRB1*12 458 30,09 DRB1*13 88 5,78 DRB1*14 81 5,32 DRB1*15 167 10,97 DRB1*16 31 2,04 13 allen 1522 100% allen 370 100% Với kiểu hình HLA-DRB1, chúng tơi xác định 13 kiểu hình allen khác Các kiểu hình allen HLA-DRB1 hay gặp DRB1*12 (30,09%), DRB1*09 (11,17%) DRB1*15 (10,97%) Các allen DRB1*01, DRB1*16 DRB1*11 allen HLADRB1 bắt gặp với tỷ lệ thấp Kết phù hợp với nghiên cứu Phan Nguyễn Thanh Vân Nguyễn Trường Sơn Với kiểu hình HLA-DQB1, chúng tơi xác định kiểu hình allen khác DQB1*02, DQB1*03, DQB1*04, DQB1*05, DQB1*06 DQB1*08 Tần suất bắt gặp cao DQB1*03 (45,95%) sau DQB1*05 (19,46%), DQB1*02 (16,76%) DQB1*06 (15,14%) Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Trường Sơn Chúng thấy 185 người khảo sát, khơng có mang kiểu hình allen DQB1*07, hai kiểu hình DQB1*04 DQB1*08 gặp quần thể người Kinh miền Bắc Việt Nam (tần suất bắt gặp tương ứng 2,43% 0,27%) A*11, A*24, A*33, A*02, B*15, B*46 allen hay gặp quần thể người châu Á, đặc biệt miền Nam Trung Hoa, Hồng Kông, Đài Loan [3] Thái Lan [5] Như vậy, nói phân bổ HLA người Kinh (Việt Nam) có nhiều nét tương đồng với nước láng giềng Việc xác định nhóm HLA giúp tìm người cho phù hợp cho BN cần ghép tế bào gốc tạo máu Việc kết nối trao đổi thông tin với chương trình đăng ký quản lý quốc tế có giá trị việc tìm kiếm nguồn tế bào gốc tạo máu phù hợp Nghiên cứu tần suất cho thấy phân bố allen HLA khác chủng tộc quần thể dân TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 tộc khác Đây vấn đề cần lưu ý làm chương trình đăng ký tế bào gốc tạo máu từ người không huyết thống KẾT LUẬN Qua phân tích HLA-A, -B, -DRB1 từ 761 trường hợp người Kinh (Việt Nam) kỹ thuật PCR-SSP, thu kết sau: Đã xác định 18 họ allen HLA-A, 28 họ allen HLA-B, 12 họ allen HLA-C, 13 họ allen HLA-DRB1 06 họ allen HLA-DQB1 Trong đó, allen HLA hay gặp quần thể người Kinh (Việt Nam) là: - HLA-A: có A*11, A*02, A*24, A*33 - B*15, B*46, B*58, B*07 - Cw*03, Cw*07, Cw*01 - DRB1*12, DRB1*09, DRB1*15 - DQB1*03, DQB1*05 Xác định tồn số allen gặp người Kinh (Việt Nam) là: - HLA-A: A*30, A*31, A*32, A*34, A*66, A*68, A*69 A*74 - HLA-B: B*14, B*28, B*41, B*47, B*50, B*53, B*73 - HLA-C: Cw*02, Cw*10 - HLA-DRB1 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Trường Sơn, Trần Văn Bảo, Phạm Thị Hồng Ngọc, Huỳnh Thị Thanh Hà CS Áp dụng phương pháp PCR-SSO để xác định kháng nguyên bạch cầu người (HLA) Bệnh viện Chợ Rẫy Y học Việt Nam 2012, (396), tr 354-358 Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh Kỹ thuật xác định HLA phương pháp PCR-SSP Bệnh viện Huyết học -Truyền máu Y học Việt Nam 2008, (344), tr.815-820 Ghashghaie A, Alimoghaddam K, Ostadali MR, et al Allele frequencies of HLA class-I loci in the normal Iranian population IJHOSCR 2009, Vol 3, No Hoa BK HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population in Viet Nam 2008 Hu SP, Luan JA, Li B, Chen JX, Cai KL, Huang LQ, Xu XY Genetic link between Chaoshan and other other Chinese Han populations: Evidence from HLA-A and HLA-B allele frequency distribution Am J Phys Anthropol 2007, 132 (1), pp.140-150 Jhonson HA, Hurley CK, et al Human leukocyte antigen: The major histocompatibility complex of man In JB Henry editor Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods New York: Saunders 2001, pp.927-948 Kupatawintu P, Pheancharoen S, Srisuddee A, Tanaka H, Tadokoro K, Nathalang O HLA-A, -B, -DR haplotype frequencies in the Thai stem cell donor registry Tissue Antigen 2010, Jun, 75 (6), pp.730-736 - HLA-DQB1: DQB1*04, DQB1*08 Có tương đồng phân bổ HLA người Kinh (Việt Nam) với nước xung quanh Ngày nhận bài: 1/11/2012 Ngày giao phản biện: 30/11/2012 Ngày giao thảo in: 28/12/2012 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 ... t i đưa liệu phân tích HLA kỹ thuật sinh học phân tử mức độ phân gi i chữ số cho allen HLA lớp I HLA lớp II, xác định tần suất bắt gặp allen HLA lớp I lớp II cộng đồng ngư i Kinh Việt Nam Đ I. .. CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 allen HLA- DRB1 lo i allen HLA- DQB1 quần thể ngư i Kinh (Việt Nam) Bảng 2: Tần suất bắt gặp allen HLA lớp II ngư i Kinh Việt Nam n n (%) (%) DRB1*01 0,46 DQB1*02... lo i Tần suất bắt gặp allen lớp I (locus HLA- A, HLA- B HLA- C) trình bày bảng Tổng số phát 18 lo i allen HLA- A, 28 lo i allen HLA- B 12 lo i allen HLA- C quần thể ngư i Kinh (Việt Nam) V i locus A,