Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch bacteriocin từ vi khuẩn lactobacillus plantarum nghiên cứu khoa học

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THU NHẬN VÀ TINH SẠCH BACTERIOCIN TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM MÃ SỐ ĐỀ TÀI: Thuộc nhóm ngành khoa học: Sinh hóa TP.Hồ Chí Minh, Tháng 04, Năm 2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THU NHẬN VÀ TINH SẠCH BACTERIOCIN TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM MÃ SỐ ĐỀ TÀI: Thuộc nhóm ngành khoa học: Sinh hóa Sinh viên thực hiện: Lƣơng Thị Mơ Nam, Nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: Công nghệ sinh học Năm thứ: Số năm đào tạo: Ngành học: Công nghệ thực phẩm Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Nguyễn Thị Lệ Thủy ThS Nguyễn Thị Phƣơng Khanh TP.Hồ Chí Minh, Tháng 04, Năm 2013 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan bacteriocin 1.1.1 Định nghĩa bacteriocin 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Tính chất bacteriocin 1.1.4 Cơ chế hoạt động 11 1.1.5 Ứng dụng bacteriocin 14 1.1.6 Các nghiên cứu 16 1.2 Sơ lƣợc Lactobacillus plantarum 19 1.2.1 Đặc điểm hình thái Lactobacillus plantarum 19 1.2.2 Đặc điểm Lactobacillus plantarum 20 1.2.3 Chức 21 1.2.4 Cấu trúc tế bào, chuyển hóa 22 1.2.5 Ứng dụng 23 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 25 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 25 2.1.2 Hóa chất thiết bị 25 2.1.3 Môi trƣờng sử dụng 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 28 2.2.2 Quy trình thu nhận tinh bacteriocin 28 2.3 Nội dung nghiên cứu 30 2.3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng tác nhân tủa đến hoạt tính bacteriocin 30 2.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện đến trình thu nhận bacteriocin 34 2.3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng trình sắc ký lọc gel Sephadex G-50 đến chất lƣợng Bacteriocin 36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết trình sinh tổng hợp bacteriocin 41 3.2 Kết khảo sát ảnh hƣởng tác nhân tủa đến hoạt tính bacteriocin 41 3.2.1 Kết khảo sát ảnh hƣởng tác nhân tủa dung môi hữu đến trình thu nhận bacteriocin 41 3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng tác nhân tủa muối (NH4)2SO4 đến trình thu nhận bacteriocin 45 3.3 Kết khảo sát ảnh hƣởng điều kiện đến trình thu nhận bacteriocin 49 3.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ thời gian tủa đến trình thu nhận bacteriocin 49 3.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng pH đến trình thu nhận bacteriocin 54 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng trình sắc ký lọc gel Sephadex G-50 đến chất lƣợng Bacteriocin 57 3.4.1 Kết khảo sát ảnh hƣởng tốc độ dòng chảy đến chất lƣợng bacteriocin thu đƣợc 57 3.4.2 Kết khảo sát ảnh hƣởng lƣợng mẫu nạp vào cột đến chất lƣợng bacteriocin thu đƣợc 64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận: 65 4.2 Kiến nghị: 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC i DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại Bacteriocin theo hƣớng Heng Tagg Bảng 1.2: Tính chất hóa lý vài bacteriocins vi khuẩn gram dƣơng 10 Bảng 2.3: Tác nhân tủa tỉ lệ tủa để thu nhận bacteriocin 31 Bảng 2.4: Các khoảng nhiệt độ thời gian tủa để thu nhận bacteriocin 34 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng dung môi hữu đến khả thu nhận bacteriocin 42 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng muối (NH4)2SO4 đến trình thu nhận bacteriocin 46 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng thời gian tủa đến trình thu nhận bacteriocin 49 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng nhiệt độ tủa đến trình thu nhận bacteriocin 50 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng thời gian nhiệt độ tủa đến trình thu nhận bacteriocin 50 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng pH đến trình thu nhận bacteriocin 55 Bảng 3.7: Hoạt tính riêng bacteriocin thu đƣợc sau sắc ký với tốc độ dòng chảy khác 62 Bảng 3.8: Hoạt tính riêng bacteriocin thu đƣợc sau sắc ký với lƣợng mẫu khác 66 DANH MỤC HÌNH/ SƠ ĐỒ/ BIỂU ĐỒ Hình 1.1: Cấu trúc Nisin Hình 1.2: Cấu trúc ba chiều Leucocin Hình 1.3 : Cấu tạo Nisin Hình 1.4 : Cơ chế hoạt động bacteriocin nhóm I II 13 Hình 1.7: Trực khuẩn L plantarum 19 Hình 1.6: Khuẩn lạc L plantarum 19 Hình 1.8: Sơ đồ mạch hệ lƣợng trao đổi chất lƣợng quy định pH tế bào cách decarboxylation antiport electrogenic 22 Hình 3.1 Kết kiểm tra tính đối kháng dịch chứa bacteriocin 41 Hình 3.2: Ảnh hƣởng tác nhân dung môi hữu đến hoạt tính kháng khuẩn bacteriocin 45 Hình 3.3: Ảnh hƣởng tác nhân tủa muối (NH4)2SO4 đến hoạt tính kháng khuẩn bacteriocin 48 Hình 3.4: Ảnh hƣởng thời gian tủa đến hoạt tính kháng khuẩn bacteriocin 54 Hình 3.5: Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính kháng khuẩn bacteriocin 57 Hình 3.6: Khả kháng khuẩn bacteriocin phân đoạn sau sắc ký với tốc độ giọt / phút 63 Hình 3.7: Khả kháng khuẩn bacteriocin phân đoạn sau sắc ký với lƣợng mẫu sử dụng 3ml 67 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ giai đoạn nghiên cứu trình thu nhận tinh bacteriocin từ Lactobacillus plantarum 28 Sơ đồ 2.2: Quy trình thu nhận tinh bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum 29 Sắc ký đồ 3.7: Sắc ký đồ dịch bacteriocin sau tủa qua cột Sephadex G-50 với tốc độ chảy 12 giọt/ phút 58 Sắc ký đồ 3.8: Sắc ký đồ dịch bacteriocin sau tủa qua cột Sephadex G-50 với tốc độ chảy giọt/ phút 60 Sắc ký đồ 3.9: Sắc ký đồ dịch bacteriocin sau tủa qua cột Sephadex G-50 với tốc độ chảy giọt/ phút 61 Sắc ký đồ 3.10: Sắc ký đồ dịch bacteriocin sau tủa qua cột Sephadex G-50 với lƣợng mẫu 5ml 64 Sắc ký đồ 3.11: Sắc ký đồ dịch bacteriocin sau tủa qua cột Sephadex G-50 với lƣợng mẫu 3ml 65 DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Kí hiệu viết tắt Diễn giải C Carbon CFU Colony Forming Unit ĐK Đƣờng kính E coli Escherichia coli h Hour (Giờ) LAB Lactic Acid Bacteria (vi khuẩn lactic) L Lactobacillus MRS De man, Rogosa, Sharpe OD Optical density pH Potential Hydrogen Pr Protein Ctv Cộng tác viên BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THU NHẬN VÀ TINH SẠCH BACTERIOCIN TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM - Sinh viên thực hiện: Sinh viên Lớp Khoa Năm thứ Số năm đào tạo Nguyễn Đức Khắng SH09TP CNSH 4 Lƣơng Thị Mơ SH09TP CNSH 4 Võ Đình Trung SH09TP CNSH 4 Trần Thị Toán SH10A2 CNSH - Ngƣời hƣớng dẫn: ThS NGUYỄN THỊ LỆ THỦY ThS NGUYỄN THỊ PHƢƠNG KHANH Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến trình thu nhận tinh bacterion từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum Tính sáng tạo: Sử dụng số sản phẩm ngoại bào vi sinh vật sinh tổng hợp làm phụ gia bảo quản thực phẩm Phụ gia bảo quản có nguồn gốc sinh học, khơng gây tác dụng phụ cho ngƣời sử dụng, kéo dài thời gian bảo quản không làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm Nghiên cứu khoa học sinh viên Bảng 1.14: Multiple Range Tests for DK khang khuan by nghiem thuc -Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -0 10.0 X 30 15.0 50 16.1667 90 17.6667 X 70 18.0 X X X Kết khảo sát ảnh hƣởng điều kiện đến trình thu nhận bacteriocin 2.1 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ thời gian tủa đến trình thu nhận bacteriocin xii Nghiên cứu khoa học sinh viên Bảng 2.1: Ảnh hƣởng nhiệt độ thời gian tủa đến hàm lƣợng protein tổng thu đƣợc Nhiệt độ (0C) Thời gian (giờ) HSPL Thể tích (ml) Hàm lƣợng protein tổng (mg) 0,147 0,166 0,169 0,174 0,149 0,167 0,168 0,172 200 200 200 200 200 200 200 200 3 3 3 3 46,53 52,53 53,26 54,84 47,16 52,74 52,95 54,21 0,00 Nghiệm thức L1 L2 L3 TB M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 0,147 0,165 0,168 0,173 0,15 0,167 0,168 0,172 0,147 0,167 0,169 0,174 0,149 0,167 0,168 0,171 0,148 0,167 0,169 0,174 0,149 0,167 0,167 0,172 M9 0 16 24 30 16 24 Đệm acetate pH= 3,8 (ĐC) Kết xử lý thống kê đƣợc sử lý phần mềm Statgraphic plus 3.0 Bảng 2.2: Analysis of Variance for protein - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:NT1 206.563 68.8542 631.08 0.0000 B:NT2 0.00426667 0.00426667 0.04 0.8453 19 0.109105 RESIDUAL 2.073 xiii Nghiên cứu khoa học sinh viên TOTAL (CORRECTED) 208.64 23 Bảng 2.3: Multiple Range Tests for protein by thoi gian Method: 95.0 percent Duncan thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups 46.8417 52.635 16 53.105 24 54.5283 X X X Bảng 2.4: Multiple Range Tests for protein by nhiet -Method: 95.0 percent Duncan nhiet Count LS Mean Homogeneous Groups -30 12 51.7642 X 12 51.7908 X xiv Nghiên cứu khoa học sinh viên Bảng 2.5: Multiple Range Tests for protein by nghiem thuc -Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -9 0.0 X 46.5267 47.1567 52.53 X 52.74 XX 52.9467 XX 3 53.2633 X 54.2133 54.8433 X X X X Bảng 2.6: Ảnh hƣởng nhiệt độ thời gian tủa đến chất lƣợng bacteriocin thu đƣợc Nghiệm thức M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 Lần Lần Lần TB 17,0 19,0 18,5 18,0 16,0 18,0 17,0 16,0 17,0 19,0 18,0 17,0 16,0 18,0 17,5 16,0 17,0 19,5 19,0 17,0 16,0 18,0 17,5 16,0 17,0 19,2 18,5 17,3 16,0 18,0 17,3 16,0 xv Nghiên cứu khoa học sinh viên M9 10,0 10,0 10,0 a) 10,0 b) Hình 2.1: Ảnh hƣởng nhiệt độ thời gian tủa đến hoạt tính kháng khuẩn bacteriocin thu đƣợc – 0, 30; Nhiệt độ tủa (0C) – ĐC: Dung dịch đệm acetate pH = 3,8 Kết xử lý thống kê đƣợc sử lý phần mềm Statgraphic plus 3.0 xvi Nghiên cứu khoa học sinh viên Bảng 2.7: Analysis of Variance for Dk khang khuan - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:thoi gian 18.0833 6.02778 72.33 0.0000 B:nhiet 8.16667 8.16667 98.00 0.0000 RESIDUAL 1.58333 19 0.0833333 TOTAL (CORRECTED) 27.8333 23 Bảng 2.8: Multiple Range Tests for Dk khang khuan by thoi gian Method: 95.0 percent Duncan thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups 16.5 X 24 16.6667 X 16 17.9167 18.5833 X X xvii Nghiên cứu khoa học sinh viên Bảng 2.9: Multiple Range Tests for Dk khang khuan by nhiet Method: 95.0 percent Duncan nhiet Count LS Mean Homogeneous Groups -30 12 16.8333 12 18.0 X X Bảng 2.10: Multiple Range Tests for Dk khang khuan by nghiem thuc Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -9 10.0 X 16.0 X 16.0 X 17.0 X 17.3333 X 17.3333 X 18.0 3 18.5 19.1667 X X X xviii Nghiên cứu khoa học sinh viên 2.2 Khảo sát ảnh hƣởng pH đến trình thu nhận bacteriocin Bảng 2.11: Ảnh hƣởng pH đến hàm lƣợng protein tổng thu đƣợc Nghiệm thức OD HSPL L1 L2 L3 TB 0,166 0,167 0,167 0,162 0,165 0,167 0,167 0,165 0,165 0,166 0,165 0,166 0,165 0,167 0,166 0,164 200 200 200 200 Thể tích (ml) Hàm lƣợng protein tổng 3 3 52,21 52,63 52,53 51,89 (mg) Kết xử lý thống kê đƣợc sử lý phần mềm Statgraphic plus 3.0 Bảng 2.12: ANOVA Table for protein tong by nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.998567 0.332856 Within groups 1.259 0.157375 2.12 0.1766 Total (Corr.) 2.25757 11 xix Nghiên cứu khoa học sinh viên Bảng 2.13: Multiple Range Tests for protein tong by nghiem thuc Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups 51.8947 X 52.2105 X 52.5263 X 3 52.6316 X xx Nghiên cứu khoa học sinh viên Bảng 2.14: Ảnh hƣởng pH đến chất lƣợng bacteriocin thu đƣợc Nghiệm thức Lần 16,0 19,0 16,5 13,0 Lần 16,0 19,0 17,0 13,0 Lần 16,0 20,0 17,0 13,0 TB 16,00 19,33 16,83 13,00 Hình 2.2: Ảnh hƣởng pH tủa đến hoạt tính kháng khuẩn bacteriocin thu đƣợc – 2, 3, 4, 5: pH tủa – ĐC: Dung dịch đệm acetate pH = 3,8 xxi Nghiên cứu khoa học sinh viên Kết xử lý thống kê đƣợc sử lý phần mềm Statgraphic plus 3.0 Bảng 2.15: ANOVA Table for DK khang khuan by nghiem thuc Analysis of Variance -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -Between groups 61.3958 20.4653 Within groups 0.833333 0.104167 196.47 0.0000 -Total (Corr.) 62.2292 11 Bảng 2.16: Multiple Range Tests for DK khang khuan by nghiem thuc Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups 13.0 16.0 16.8333 3 19.3333 X X X X xxii Nghiên cứu khoa học sinh viên Kết nghiên cứu ảnh hƣởng trình sắc ký lọc gel Sephadex G50 đến chất lƣợng Bacteriocin 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng tốc độ dòng chảy đến chất lượng bacteriocin thu Bảng 3.1: Ảnh hƣởng tốc độ dòng chảy 12 giọt / phút đến chất lƣợng bacteriocin thu đƣợc Phân đoạn Hàm lƣợng protein tổng (mg) ĐK kháng khuẩn (mm) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 0,000 0,000 0,000 0,000 0,143 0,225 0,331 0,614 2,365 7,228 8,526 10,175 14,947 20,561 18,596 18,035 16,632 15,965 11,0 11,0 11,0 11,0 13,0 14,0 14,0 14,0 14,7 15,0 15,2 17,0 18,0 18,0 19,0 20,0 19,0 18,0 Phân đoạn Hàm lƣợng protein tổng (mg) ĐK kháng khuẩn (mm) 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 12,772 10,368 8,667 6,526 5,782 2,639 1,600 0,514 0,356 0,110 0,093 0,086 0,085 0,083 0,041 0,036 0,037 17,7 17,0 17,0 14,0 14,0 14,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 xxiii Nghiên cứu khoa học sinh viên Bảng 3.2: Ảnh hƣởng tốc độ dòng chảy giọt / phút đến chất lƣợng bacteriocin thu đƣợc Phân đoạn Hàm lƣợng protein tổng (mg) ĐK kháng khuẩn (mm) Phân đoạn 10 11 12 13 14 15 16 17 0,000 0,000 0,039 0,127 0,154 1,011 1,418 4,404 9,333 15,018 19,719 24,561 22,386 20,772 15,544 10,912 8,211 11,0 11,0 11,0 11,0 12,0 13,3 14,3 16,0 16,0 17,7 18,0 18,7 20,7 21,7 23,7 20,7 19,3 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Hàm lƣợng ĐK kháng protein tổng khuẩn (mg) (mm) 5,509 4,596 3,930 2,912 2,439 1,333 0,982 0,354 0,125 0,099 0,086 0,081 0,046 0,042 0,042 0,039 18,0 14,0 13,0 13,0 12,0 12,0 12,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 xxiv Nghiên cứu khoa học sinh viên Bảng 3.3: Ảnh hƣởng tốc độ dòng chảy giọt / phút đến chất lƣợng bacteriocin thu đƣợc Phân đoạn Hàm lƣợng protein tổng (mg) ĐK kháng khuẩn (mm) 10 11 12 0,000 0,000 0,968 6,053 18,000 28,632 26,735 24,421 18,211 13,474 7,8421 4,579 11,0 11,0 11,0 11,0 12,3 14,7 17,7 19,0 20,7 25,3 22,3 20,3 Phân đoạn Hàm lƣợng protein tổng (mg) ĐK kháng khuẩn (mm) 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 3,053 2,695 2,189 1,937 1,789 1,621 1,568 1,516 1,389 1,221 1,011 0,863 17,7 15,3 13,0 12,3 12,0 11,3 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 11,0 xxv Nghiên cứu khoa học sinh viên 2.2 Kết khảo sát ảnh hưởng lượng mẫu nạp vào cột đến chất lượng bacteriocin thu Bảng 2.4: Ảnh hƣởng lƣợng mẫu ml nạp vào cột đến chất lƣợng bacteriocin thu đƣợc Phân đoạn Hàm lƣợng protein tổng (mg) ĐK kháng khuẩn (mm) 0,000 0,095 2,368 4,807 17,579 36,491 32,913 24,491 13,053 11,0 11,0 11,0 11,0 13,0 15,0 17,0 23,3 26,3 Phân đoạn Hàm lƣợng protein tổng (mg) ĐK kháng khuẩn (mm) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 10,140 7,123 5,018 3,982 2,561 0,982 0,881 0,6140 0,514 24,0 18,0 15,7 13,3 12,3 12,0 11,0 11,0 11,0 xxvi ... bacteriocin Sơ đồ 2.1: Sơ đồ giai đoạn nghiên cứu trình thu nhận tinh bacteriocin từ Lactobacillus plantarum 2.2.2 Quy trình thu nhận tinh bacteriocin a) Quy trình: Trang 28 Nghiên cứu khoa học. .. Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: Giỏi Sơ lƣợc thành tích: Đã bắt đầu tham gia nghiên cứu khoa học Tham gia nghiên cứu trình thu nhận tinh bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus. .. ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VI? ?N THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VI? ?N CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THU NHẬN VÀ TINH