Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch cellulase từ vi khuẩn ruột mối

e TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ===  === ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TINH SẠCH CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI GV hướng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân SV thực : Nguyễn Thị Quỳnh Hoa : Trịnh Thị Lịch : 52K – Công nghệ thực phẩm Lớp VINH - 5/2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Quỳnh Hoa MSSV 1152043884 Trịnh Thị Lịch MSSV 1152040491 Lớp : 52K Ngành : Công nghệ thực phẩm 1.Tên đề tài : NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TINH SẠCH CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: Cán hướng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2016 Ngày hoàn thành đồ án Ngày tháng năm 2016 : Ngày tháng năm 2016 Chủ nhiệm môn Cán hƣớng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày tháng năm 2016 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XẾT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Quỳnh Hoa MSSV 1152043884 Trịnh Thị Lịch MSSV 1152040491 Lớp : 52K Ngành : Công nghệ thực phẩm Cán hướng dẫn : Cán duyệt ThS Đào Thị Thanh Xuân : Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nhận xét cán hƣớng dẫn: Ngày tháng Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) năm 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XẾT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Quỳnh Hoa MSSV 1152043884 Trịnh Thị Lịch MSSV 1152040491 Lớp : 52K Ngành : Công nghệ thực phẩm Cán hướng dẫn : Cán duyệt ThS Đào Thị Thanh Xuân : Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nhận xét cán duyệt: Ngày tháng năm 2016 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) Lời cảm ơn Trong trình học tập nghiên cứu, thực đồ án tốt nghiệp kỹ sư này, cố gắng thân em nhận hỗ trợ lớn từ thầy cơ, gia đình bạn bè người xung quanh Em xin chân thành cảm ơn ThS Đào Thị Thanh Xuân, giảng viên khoa Hóa học, trường đại học Vinh tận tình hướng dẫn em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy cơ, cán hướng dẫn thí nghiệm Phịng hóa sinh, Phịng hóa hữu cơ, Phịng thực hành sinh học, Trung tâm quản lí phịng thí nghiệm Trường Đại học Vinh tạo điều kiện tận tình giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Cùng với xin gửi lời cám ơn chân thành tới bạn phịng thí nghiệm hóa sinh, bạn lớp gia đình tạo điều kiện giúp đỡ, động viên tơi hồn thành đồ án Trân trọng! Tháng năm 2016 TÓM TẮT ĐỒ ÁN Thu nhận, tinh enzyme cellulase từ ruột mối Nội dung nghiên cứu:  Nghiên cứu thu nhận chủng có hoạt tính cellulase cao để tiến hành nghiên cứu tinh enzyme  Nghiên cứu đăc tính sinh hóa chủng  Nghiên cứu tinh enzyme cellulase từ muối trung tính (NH4)2SO4 bão hịa, aceton cồn tinh khiết  Nghiên cứu định lượng protein, xác định hoạt độ cellulase  Các đặc điểm hóa sinh enzyme ảnh hưởng chất xúc tác kìm hãm enzyme Kết nghiên cứu:  Sử dụng chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối kí hiệu F2 để tiến hành tinh xác định đặc tính enzyme  Xác định đặc tính hóa sinh chủng F2./  Lựa chọn dung môi phù hợp để tiến hành tinh enzyme có độ thu hồi cao Acetone tinh khiết  Xác định hoạt độ enzyme  Nghiên cứu đặc điểm enzyme cellulase chiết tách từ chủng F2  Nhiệt độ tối ưu: 60oC  pH tối ưu:  Ảnh hưởng chất xúc tác kìm hãm enzyme: - Ảnh hưởng cation hóa trị 2: Co2+ - Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt: EDTA MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Sự phát triển khoa học kĩ thuật ngày mang đến ứng dụng phục vụ nâng cao đời sống người Ngành khoa học tự nhiên vốn từ lâu ngành mang lại nhiều ứng dụng vào thực tế đáp ứng nhu cầu ngày cao người Trong đó, hóa sinh thực phẩm ngành có nhiều ứng dụng triển vọng góp phần khơng nhỏ vào phát triển cơng nghiệp thực phẩm, mang lại sản phẩm chất lượng cao phù hợp yêu cầu người tiêu dùng Trong đó, lĩnh vực nghiên cứu sản xuất enzyme đặc biệt phát triển, mục tiêu nghiên cứu nhiều đề tài có tính ứng dụng, khoa học cao Từ đầu kỷ XX, hàng loạt enzym tìm ứng dụng rộng rãi như: amylase, protease, pectinase, cellulase Hàng năm luợng enzym sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với 500 triệu USD, phân phối lĩnh vực khác Enzym cellulase ứng dụng nhiều công nghiệp sản xuất cồn, công nghiệp chế biến vải, công nghiệp sản xuất giấy bột giấy, sản xuất thức ăn chăn nuôi xử lý môi trường Enzym mang chất protein, có khả xúc tác sinh học không bên thể mà cịn bên ngồi thể tạo cho chúng điều kiện thích hợp để họat động Việc khai thác enzym từ động vật thực vật phức tạp nguồn ngun liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế Do ưu điểm mặt hóa sinh kỹ thật sản xuất từ nguồn vi sinh vật ngày ứng dụng rộng rãi Điều kiện thúc đẩy ngành công nghiệp enzym phát triển khả to lớn vi sinh vật Vi sinh vật có tốc độ phát triển nhanh, có khả đáp ứng nhu cầu người, đồng thời enzyme chúng tạo ta có hoạt lực cao Bên cạnh mơi trường ni cấy vi sinh vật tận dụng phế thải ngành khác Cellulase nhóm enzym quan trọng có nhiều ứng dụng phổ biến đời sống Cellulase ứng dụng rộng rãi ngành lĩnh vực khác nhau: công nghiệp, nông nghiệp, y học hoạt tính chung enzym nói chung chịu ảnh hưởng từ nhiều yếu tố Do để thu nhận enzym có hoạt tính cao cần khảo sát điều kiện kết tủa tối ưu enzym Cùng với ta biết đến mối lồi vi sinh vật có khả tiêu thụ cellulose đặc biệt hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Đây lồi sinh vật dễ tìm kiếm Việc phân lập vi sinh vật ruột mối tìm chủng cellulase hoạt lực cao phân giải cellulose tốt Đề tài nhằm mục đích tinh thu nhận enzym cho hoạt tính cao từ vi sinh vật phân giải cellulose ruột mối để thu nhận cellulase sản phẩm sinh học, có giá trị cao ứng dụng thực tiễn Trên sở chọn đề tài: “Nghiên cứu thu nhận tinh cellulase từ vi khuẩn ruột mối” Nhiệm vụ nghiên cứu Trong đồ án này, chúng tơi có nhiệm vụ: - Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh tổng hợp cellulase cao - Chọn tác nhân tinh cellulase từ chủng vi khuẩn F2 cho hiệu suất thu hồi enzym cao - Nghiên cứu định lượng protein, xác định điều kiện tối ưu hóa hoạt độ enzym Vật liệu, phạm vi nội dung nghiên cứu 3.1 Vật liệu Các chủng vi sinh vật Bacillus kí hiệu F2, G4, G5 cung cấp phịng thí nghiệm cơng nghệ thực phẩm, khoa Hóa học - Trường đại học Vinh 3.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành phịng thí nghiệm cơng nghệ thực phẩm, khoa Hóa Học, trường Đại học Vinh thời gian từ 20/12/ 2016 đến 20/5/2016 3.3 Nội dung nghiên cứu Đề tài tiến hành với nội dung sau: - Thu nhận enzyme từ dịch ni chủng F2 có hoạt tính cao - Tinh cellulase phương pháp kết tủa tác nhân muối trung tính dung mơi hữu nhiệt độ thấp với tỷ lệ khác - khảo sát hoạt độ enzyme tinh - Khảo sát điều kiện ảnh hưởng tới enzyme tinh Từ khảo sát rút dung môi tinh enzyme thích hợp nhất, yếu tố số chất đặc trưng ảnh hưởng đến enzym nhằm ứng dụng cách có hiệu 3.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đề tài mang lại số ý nghĩa khoa học thực tiễn cho nghiên cứu sâu enzym cellulase từ vi sinh vật Bacillus Kết đề tài bổ sung cho nghiên cứu trước vi sinh vật Bacillus, đồng thời làm sở cho nghiên cứu vi sinh vật Bacillus sp Kết nghiên cứu nguồn tham khảo tốt cho nghiên cứu ứng dụng cụ thể enzym cellulase thu nhận từ ruột mối để đưa vào thực tiễn sản xuất đời sống nhằm nâng cao hiệu sử dụng, phát triển theo quy mô công nghiệp giảm giá thành chế phẩm enzym chế phẩm enzym CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 HỆ ENZYM CELLULASE Enzym cellulase enzym quan trọng chuyển hóa chất hữu có thiên nhiên có ý nghĩa lớn công nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường… Hình 1.1: Cấu trúc enzyme cellulase Cellulase hệ enzym xúc tác cho q trình chuyển hóa thành sản phẩm hòa tan Phức hệ enzym Cellulase enzyme phức tạp Một mặt chúng enzym cảm ứng (mà Cellulase lại chất cảm ứng không chặt chẽ), mặt chúng lại chịu tác động chế điều khiển sản phẩm cuối chịu kiểm sốt chế kiểm chế dị hóa Hệ thống enzym thủy phân Celluase bao gồm enzym khác nhau: Endoglucanase (1,4-β-D- glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.3.1,4), Exoglucanase (1,4- β-D-glucanCellobiohydrolase, EC3.2.1.91) β-glucosid glucohydrolase, EC 3.2.1.21) Các enzym có tính đặc hiệu khác hoạt động hỗ trợ cho Đầu tiên, Exoglucanase phá vỡ liên kết 1,4-β-D-glucosid phân tử Cellulose, sau Endoglucanase tiếp tục thủy phân Cellulose thành phần Cellobiose sau β-glucosidase phân cắt Cellubiose thành glucose 1.1.1 Cấu tạo Cellulase có chất protein cấu tạo từ đơn vị acid amin, acid amin phối với liên kết peptid-Co-NH-, nhiên cấu trúc có gắn 0.7 0.6 Mật độ quang OD 0.5 y = 0.604x + 0.049 R² = 0.999 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Nồng độ albumin Đồ thị 3.1.2 Đƣờng chuẩn albumin - Kết xác định hoạt tính enzym thơ Mẫu Tổng hoạt độ Hàm lượng Hoạt độ riêng (UI/ml) protein 0.68 2.39 0.25 0.72 2.47 0.29 0.65 2.36 0.15 Sau xác định chủng có hoạt tính cao dựa vào phương pháp định lượng đường khử DNS tiến hành sàng lọc để thu enzyme thô chuẩn bị cho tinh enzyme - Ly tâm mơi trường ni cấy chứa chủng có hoạt tính nhiệt độ thấp C với tốc độ 4500 vòng/phút thời gian 20 phút - Loại bỏ tạp chất đáy ống ly tâm, thu dịch phía ta enzyme thô tiến hành tinh enzyme muối trung tính bão hịa dung mơi hữu 3.4 NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM BẰNG PHƢƠNG PHÁP KẾT TỦA PHÂN ĐOẠN - Mục đích tinh enzym loại bỏ tạp chất dạng hòa tan, cặn mịn, protein không hoạt động khỏi dịch enzym thơ nhằm thu dịch enzym thơ có độ tinh cao, thuận lợi cho việc sử dụng nghiên cứu sau - Chủng Bacillus F2 nuôi cấy sau ngày cho hoạt tính cao ly tâm tách cặn 40C với vận tốc 4500v/phút 10 phút tiến hành kết tủa tác nhân khác 3.4.1 Kết tủa Enzyme cellulase muối (NH4)2S04 - Tiến hành tủa dịch chiết enzym thô với muối (NH4)2SO4 bão hòa điều kiện lạnh nồng độ 40, 50, 60, 70, 80, 90% - Thu tủa hòa tan đệm citrate 0.05M pH = 4.8 đem xác định hoạt tính hàm lượng protein - Kết thu sau: Bảng 3.2 Tinh enzyme cellulase tinh muối (NH4)2SO4 Tác nhân (NH4)2SO4 Hoạt độ Hàm lượng Hoạt độ Độ tinh Hoạt tính tổng protein riêng cịn lại (%) (UI/ml) (mg/ml) (UI/ml) Enzyme thô 0.72 2.47 0.29 100 (NH4)2SO4 90% 0.34 0.64 0.5 1.71 47.2 (NH4)2SO4 80% 0.45 0.88 0.51 1.76 62.5 (NH4)2SO4 70% 0.40 0.89 0.44 1.51 55.55 (NH4)2SO4 60% 0.38 0.75 0.5 1.72 52.78 (NH4)2SO4 50% 0.35 0.72 0.48 1.65 48.6 (NH4)2SO4 40% 0.24 0.68 0.35 1.2 33.3 Biểu đồ tính hoạt tính cịn lại cellulase với tác nhân (NH4)2SO4 bão hịa Hoạt tính cịn lại (%) 120 100 100 80 60 40 48.6 52.78 55.55 50 60 70 62.5 47.2 33.3 20 0 40 80 90 Nồng độ muối (%) Nhận xét: - Với nồng độ muối (NH4)2SO4 80 % ta thu hoạt tính cịn lại enzyme cao (62.5%) với độ tinh 1.76 3.4.2 Kết tủa enzyme cellulase dung môi hữu 3.4.2.1 Kết tủa enzyme cồn tinh khiết  Tiến hành tủa dịch chiết enzym thô với cồn điều kiện lạnh nồng độ 40, 50, 60, 70, 80, 90%  Thu tủa hòa tan đệm citrate 0.05M pH = 4.8 đem xác định hoạt tính hàm lượng protein  Kết thu sau: Bảng 3.3 Tinh enzyme cellulose tinh cồn Tác nhân Cồn Hoạt độ Hàm lượng Hoạt độ Độ tinh Hoạt tính tổng protein riêng cịn lại (%) (UI/ml) (mg/ml) (UI/ml) Enzyme thô 0.72 2.47 0.29 100 Cồn 90% 0.38 0.72 0.52 1.79 52.77 Cồn 80% 0.45 0.76 0.59 2.01 62.6 cồn 70% 0.43 0.94 0.46 1.58 59.72 Cồn 60% 0.32 0.72 0.44 1.52 44.44 Cồn 50% 0.21 0.69 0.3 1,03 29.17 Cồn 40% 0.22 0.68 0.32 1.1 30.5 Biểu đồ tính hoạt tính cịn lại cellulose với tác nhân cồn Hoạt tính cịn lại (%) 120 100 100 80 59.72 60 62.6 52.77 44.44 40 30.5 29.17 40 50 20 0 60 70 80 90 Nồng độ cồn (%) Nhận xét: - Với nồng độ cồn 80 % ta thu hoạt tính enzym cao - Tại nồng độ cồn 80% ta tính hoạt độ riêng cao nhất, độ tinh gấp 2,03 lần so với enzym trước tinh đạt hiệu suất thu hồi enzym cao (62.6%) 3.4.2.2 Kết tủa Enzyme cellulose aceton tinh khiết Bảng 3.3 Tinh enzyme cellulase tinh aceton Tác nhân Hoạt độ Hàm lượng Hoạt độ Độ tinh Hoạt tính Acetone tổng protein riêng lại (%) (UI/ml) (mg/ml) (UI/ml) Enzyme thô 0.72 2.47 0.29 100 Aceton 90% 0.59 0.9 0.65 2.26 81.94 Aceton 80% 0.57 1.08 0.52 1.79 79.12 Aceton 70% 0.48 1.06 0.45 1.55 66.67 Aceton 70% 0.46 0.99 0.46 1.58 63.9 Aceton 50% 0.42 0.8 0.52 1.79 58.3 Aceton 40% 0.31 1.0 0.31 1.07 43.1 Biểu đồ tính hoạt tính cịn lại cellulose với tác nhân aceton Hoạt độ lại (%) 120 100 100 79.12 80 60 58.3 63.9 66.67 50 60 70 81.94 43.1 40 20 0 40 80 90 Nồng độ aceton (%) Nhận xét: - Hoạt tính cịn lại cao kết tủa acetone 90%, nồng độ cho độ tinh cao cấp 2.26 lần so với enzyme trước tinh - Hoạt tính cịn lại độ tinh giảm dần giảm nồng độ acetone bão hòa Bảng 3.4 Kết tinh enzyme với dung môi hữu nồng độ tối ƣu Hoạt độ Hàm lượng Hoạt độ Độ tinh Hoạt tính tổng protein riêng cịn lại (UI/ml) (mg/ml) (UI/ml) Enzyme thô 0.72 2,47 0.29 100 Ethanol 80% 0.46 0.76 0.59 2.03 62.6 Acetone 90% 0.59 0.9 0.65 2.26 81.94 Muối (NH4)2SO4 80% 0.45 0.88 0.51 1.76 62.5 Tác nhân (%) Nhận xét:  Về hoạt tính cịn lại: tủa aceton> cồn> muối (NH4)2SO4  Về hàm lượng protein : tủa acetone> muối (NH4)2SO4> cồn  Về hoạt độ riêng: tủa acetone> cồn > muối (NH4)2SO4  Về độ tinh : tủa aceton > cồn > muối (NH4)2SO4 Lựa chọn tác nhân thích hợp để kết tủa enzyme cellulase Độ tinh enzym 2.5 2.26 1.76 1.5 2.03 0.5 muối aceton cồn Tác nhân kết tủa Nhận xét: So sánh hoạt tính cịn lại thu nồng độ kết tủa tối ưu tác nhân chọn acetone tác nhân tinh enzyme cho hoạt tính cao (81.94%) 3.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘ ENZYM 3.5.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme tinh  Để khảo sát nhiệt độ tối ưu, tiến hành khảo sát xác định hoạt độ enzym nhiệt độ 30, 40, 50, 60, 70 80oC  Kết thu bảng sau: Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt độ enzyme Nhiệt độ Hoạt độ enzyme (0C) (UI/ml) 30 0.65 40 0.73 50 0.95 60 1.09 70 1.03 80 0.76 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ enzym tinh Hoạt độ enzyme (UI/ml) 1.2 1.09 1.03 0.95 0.8 0.76 0.73 0.65 0.6 0.4 0.2 0 20 40 60 80 100 Nhiệt độ Nhận xét: Từ kết ta thấy enzym tinh enzym chịu nhiệt tương đối tốt, tăng nhiệt độ hoạt độ tăng lên đáng kể tối ưu nhiệt độ 60 C hoạt độ đạt tới 1.09( UI/ml) Nếu tăng nhiệt độ lên 800C hoạt độ cịn lại 31% so với hoạt độ cực đại Nhiệt độ tối ưu enzyme tinh chủng Bacillus F2 thu hoàn toàn tương đồng với nhiệt độ tối ưu hệ cellulase 3.5.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ enzym tinh  Sử dụng dung dịch đệm có pH = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Để khảo sát pH tối ưu, tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme nồng độ pH khác  Kết thu bảng sau: Bảng 3.6: Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ enzyme pH Hoạt độ (UI/ml) 0.32 0.41 0.87 0.84 0.75 0.65 0.45 10 0.43 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ enzym tinh 0.87 Hoạt độ enzyme (UI/ml) 0.9 0.8 0.84 0.75 0.7 0.65 0.6 0.45 0.5 0.4 0.32 0.43 0.41 0.3 0.2 0.1 0 10 12 pH pH làm cho hoạt tính xúc tác enzym thay đổi Từ kết nghiên cứu cho thấy pH thích hợp cho hoạt động enzym tinh điều kiện nhiệt độ 500C từ đến 3.6 NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÌM HÃM VÀ CHẤT HOẠT HĨA ENZYM  Chất hoạt hóa chất có mặt mơi trường làm tăng hoạt độ enzym  Chất kìm hãm chất có mặt mơi trường làm giảm hoạt độ enzym 3.6.1 Ảnh hƣởng cation hóa trị II đến hoạt độ enzym  Ủ enzym với cation hóa trị II khác 30 phút trước tiến hành khảo sát hoạt tính cịn lại enzym  Xác định hoạt độ lại phương pháp Miller Kết thu bảng sau Bảng 3.7 Ảnh hƣởng cation kim loại tới hoạt độ enzym Cation Hoạt độ (UI/ml) Ba2+ 0.43 Ca2+ 0.72 Fe2+ Mg2+ 0.47 Cu2+ Zn2+ Co2+ 0.77 Enzym tinh 0.67 Nhận xét: Các cation gây ức chế hoạt động enzym : Zn2+ ,Cu2+ ,Fe2+ Mg2+, Ba2+gây ức chế nhẹ enzym Ca2+ Co2+ làm tăng hoạt độ enzym 3.6.2 Ảnh hƣởng chất hoạt động bề mặt đến hoạt độ enzym tinh  Để nghiên cứu ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt đến hoạt độ enzym, sử dụng chất Tween 80, EDTA, SDS nồng độ 10mM  Ủ enzym với chất hoạt động bề mặt nồng đồ khác 30 phút trước tiến hành khảo sát hoạt độ lại enzym  Hoạt độ lại xác định phương pháp Miller  Kết thu bảng sau: Bảng 3.8 Khảo sát chất hoạt động bề mặt Chất hoạt động bề mặt (10mM) Hoạt độ (UI/ml) Tween80 0.56 EDTA 3.48 SDS 0.71 Enzyme thô 0.67 120 100 Hoat độ (UI/ml) 100 80 58.3 60 43.1 40 20 0 40 50 Chất hoạt động bề mặt Nhận xét: - EDTA (ethylene diamine axit axetic tetra) cho hiệu tốt làm tăng hoạt độ enzyme lên 3.48 (UI/ml), bên cạnh SDS làm tăng hoạt độ chậm Tween 80 gây giảm hoạt độ enzym KẾT LUẬN Kết thu nhận Thu nhận chủng F2 cho hoạt độ cellulase cao từ vi khuẩn phân lập ruột - mối xác định số đặc tính sinh hóa chủng Đã lựa chọn dung mơi thích hợp để tinh enzyme cho hoạt tính cịn lai - (81.94%) độ tinh cao (2.26) acetone 99.7% chủng vi sinh vật Bacillus F2 Enzyme tinh từ chủng Bacillus F2 điều kiện sau cho hoạt độ cuối - cao 1: pH: 2: Nhiệt độ tối ưu :60C 3: Cation xúc tác phản ứng cho hoạt tính cịn lại cao Co2+ 4: Chất hoạt động bề mặt tối ưu: EDTA Kiến nghị Thực kết tủa protein tác nhân hóa học khác để tìm tác nhân - tối ưu giá thành rẻ Sử dụng enzyme cho mục đích thương mại ứng dụng thực tiễn - Tùy vào yêu cầu sản phẩm để tạo chế phẩm enzyme phù hợp dạng viên lỏng với độ tinh tùy thuộc - Tiến hành khảo sát tìm enzyme cellulase có hoạt tính từ mơi trường khác chủng vi sinh vât khác TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, 2004 Công nghệ Enzyme Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường Thí nghiệm cơng nghệ sinh học Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Lê Hồng Phú Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng h p enzyme pectinase cellulase ứng dụng sản xuất cà phê nhân theo ph ơng pháp lên men PTS Nguyễn Đức Lượng - Nguyễn Chúc - Lê Văn Việt Mẫn, Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa TP HCM Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Công nghệ enzym, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh, 2004 Khưu Phương Yến Anh (2007), “Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase c a số ch ng nấm s i phân lập từ rừng ngập mặn Cần Thơ”, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh,tr - 26 Phạm Thị Trân Châu Phan Tuấn Nghĩa (2006), công nghệ sinh học tập - enzyme ứng dụng, Nxb Giáo dục Việt Nam, tr 121 -141 Hoàng Quốc Khánh (2003), “Khả sinh tổng h p đặc điểm cellulase c a Aspergillus niger Rnnl - 363”, Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc Hà Nội, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 304 - 307 Trần Thạnh Phong, Hoàng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phượng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân Thu nhận enzyme cellulsae c a trichoderma reesei môi tr ờng bán rắn Tạp chí phát triển Khoa học Cơng Nghệ, tập 10, số 07-2007 Nguyễn Văn Tuân Tuyển chọn, nuôi cấy ch ng Aspergillus awamori sinh tổng h p endo -β-1,4-Glucanase đánh giá tính chất lý hóa c a endo -β-1,4-Glucanase Luận văn thạc sĩ khoa học Viện khoa học công nghệ Việt Nam 2009 10 Nguyễn Trần Nhật Minh Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei Khóa luận tốt nghiệp 11 Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy (2010), “Khảo sát điều kiện nuôi cấy phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis”, Hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ 7, trường Đại học Đà Nẵng, tr 378 - 384 TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 12 J Environ Biol Optimization of solid state fermentation conditions for the production of cellulase by Trichoderma reesei Journal of Environmental Biology January 2012 13 Ramin M, Alimon A R and Abdullah (2009), “ Identification ò cellulolytic bacteria isolated from the termite Coptotermes curvignathus (homgren)”, Journal ò Rapid Methods & Automation in Microbiology (17), pp 103 - 116 14 M M V Baig Cellulolytic enzymes of trichoderma lignorum produced on banana ogro-waste: optimisation of culture medium and conditions Journal of Scientific and Industrial Research, January 2005, pp 57-66 15 Elberson M A., Malekzadeh f., Yazdi M T., Kameranpour N., Noori Daloii M R., Matte M H., Shahamat M., Colwell R R., Sowers K R (2000), “ Cellulomonas persica sp Nov., mesophilic cellulose-degrading bacteria isolated from forest soils”, International journal ò Systematic and Evolutionary Microbiology (50), pp 993 - 996 16 Pasti M B., Belli M L (1985)), (Cellulolytic activity of Actinomycetes isolated from Termites (Termitidae) gut” FEMS Microbiol, 41 pp 107 - 112 17.Tran Thanh Phong, Hoang Quoc Khanh,Vo Thi Hanh, Le Bich Phuong, Nguyen Duy Long, Le Tan Hung, Truong Thi Hong Van Institute of Tropical Biology, Vietnamese Academy of Science and Technology “ Optimization of cellulase production by trichoderma reesei on solid substrate medium ” development magazine most, volume 10, number 07 - 2007 18 BY K Selby and C C.Maitland The Cellulase of Trichoderma viride separation of the components involved in the solubilization off cotton Shirley Institute, Didebury, Marnche8ter 20(Received 16 December 1966) 19 T K GHOSE Measurement of cellulase activities Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute of Technology, New Delhi-110016, India 20 Shazia Shafique, Rukhsana Bajwa and Sobiya Shafique Cellulase biosynthesis by selected trichoderma species Institute of Mycology and Plant Pathology,University of the Punjab, Quaid-e-Azam Campus Lahore, Pakistan 21 M Moosavi-Nasab and M Majdi-Nasab Cellulase Production by Trichoderma reesei using Sugar Beet Pulp Department of Food Science and Technology, College of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, I R Iran 22 Anikó Brumbauer, Gote Johansson & KatiRéczey Fractionation of cellulase and  glucosidase in a Trichoderma reesei culture liquid by use of two-phase partitioning Department of Biochemistry, Lund University, P.O Box 124, S-221 00 Lund 23.MacFaddin J F (1980), Biochemical test for dentification of medical bacteria Lippincott Williams and Wilkins, pp 150 - 376 24 T Nakari-Setala and M Penttila Production of Trichoderma reesei cellulases on glucose-containing media Appl Environ Microbiol, 1995 25 Schwarz W H (2001), “The cellulose degradation by anaerobic bacteria”, Appl Microbiol Biotechnol (56), pp 634 - 64.9 26 Linder, M., et al (1995) The difference in affinity between two fungal cellulosebinding domains is dominated by a single amino acid substitution FEBS letters, 372(1), pp 96-98 27 Kleywegt, G.J., et al (1997) The crystal structure of the catalytic core domain of endoglucanase I from Trichoderma reesei at 3.6 Å resolution, and a comparison with related enzymes1 Journal of molecular biology, 272(3), pp 383-397 28 Schaefer A., Konrad R., Kuhnigk T., Kaempfer P., Hertel H., Koenig H.(1996), “Hemi ellulose-degrading bacteria and yeasts from the termite gut”, Journal Of Applied Bacteriology 80(5), pp 471 - 478 29 Montenecourt, B.S (1983) Trichoderma reesei cellulases Biotechnology, 1(5), pp 156-161 Trends in ... Các nghiên cứu thu nhận vi sinh vật từ ruột mối Trong năm gần có nhiều báo cáo phân lập vi sinh vật thu nhận enzym cellulase từ ruột mối cho kết chủng có hoạt tính cao, hoạt độ thu hồi khả tinh. .. đỡ, động vi? ?n tơi hồn thành đồ án Trân trọng! Tháng năm 2016 TÓM TẮT ĐỒ ÁN Thu nhận, tinh enzyme cellulase từ ruột mối Nội dung nghiên cứu:  Nghiên cứu thu nhận chủng có hoạt tính cellulase. .. từ vi sinh vật phân giải cellulose ruột mối để thu nhận cellulase sản phẩm sinh học, có giá trị cao ứng dụng thực tiễn Trên sở chúng tơi chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu thu nhận tinh cellulase từ vi khuẩn