Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm vân chi trametes versicolor

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA NGHIÊN CỨU Q TRÌNH THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYM LACCASE TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM VÂN CHI TRAMETES VERSICOLOR Sinh viên thực hiện: Đoàn Thị Luyến MSSV: 107150153 Lớp: 15H2B Đà Nẵng – Năm 2019 TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Sinh viên thực hiện: Đoàn Thị Luyến MSSV: 107150153 Lớp: 15H2B GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật ThS Nguyễn Thị Bích Hằng Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm chương: Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Laccase enzym oxi hóa khử đa đồng oxy hóa nhiều loại chất bao gồm phenol, keton, phosphat, ascorbat, amin lignin Nghiên c ứu tiến hành nhằm xác định yếu tố ảnh hưởng (thành phần môi trường nuôi cấy, thời gian nuôi cấy phương pháp nuôi cấy) đến hoạt độ enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Giống nấm Vân Chi tiến hành nuôi cấy công thức môi trường khác kết cho thấy môi trường tốt môi trường bao gồm: dịch khoai tây, glucose, KH2PO4, MgSO4 , NH4+, Cu 2+ ABTS Thời gian nuôi cấy khảo sát tử – 11 ngày với môi trường đạt hoạt độ cao 2,858 U/ml sau ngày nuôi cấy Nghiên cứu đươc tiến hành để so sánh hiệu phương pháp nuôi cấy dịch thể (lắc, sục khí lên men tĩnh) kết thu phương pháp lắc có hiệu cao Nghiên cứu nhằm xác định ảnh hưởng tác nhân kết tủa đến hiệu kết tủa enzym laccase Tỷ lệ dung dịch enzym thô dung môi hữu (ethanol, acetone) thay đổi từ 1:1 đến 1:5 (v/v), tương tự nồng độ amonium sulfate bão hòa dịch enzym dao động từ 40% đến 100% Thời gian kết tủa thích hợp từ tác nhân lựa chọn khảo sát Kết cho thấy ethanol đạt hiệu kết tủa enzym laccase cao Tỷ lệ dung dịch enzym thô/ethanol 1:3 (v/v) thời gian kết tủa 45 phút cho hiệu suất tủa đạt 78,12% Khối lượng phân tử enzym laccase xác định điện di xấp xỉ 100 kDa SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Đoàn Thị Luyến Lớp: 15H2B Số thẻ sinh viên: 107150153 Khoa: Hóa Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu liệu ban đầu: Nội dung phần thuyết minh tính tốn: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Các bảng, hình ảnh Họ tên người hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật, ThS Nguyễn Thị Bích Hằng Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 18/08/2019 Ngày hoàn thành đồ án: 09/12/2019 Đà Nẵng, ngày … tháng 12 năm 2019 Trưởng Bộ môn Người hướng dẫn Công nghệ thực phẩm PGS.TS Đặng Minh Nhật PGS.TS Đặng Minh Nhật LỜI NÓI ĐẦU Sau tháng thực đề tài: “Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor”, hướng dẫn thầy Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng, tơi hồn thành xong đồ án tốt nghiệp Đầu tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn đến q thầy Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng nói chung, mơn Cơng nghệ thực phẩm nói riêng, tận tâm truyền đạt kiến thức tảng, nhiệt tình giúp đỡ bảo q trình học tập, nghiên cứu để tơi hồn thành chương trình học tập với tiến độ Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến thầy Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, sát cánh suốt trình làm đồ án Trong trình thực hiện, dù bận nhiều công việc thầy cô dành nhiều thời gian hướng dẫn, bảo tận tình bước, từ việc chọn đề tài, thực đề tài báo cáo đề tài Với góp ý, sửa chữa thầy cơ, giúp tơi nắm bắt xác nội dung liên quan đến đồ án từ hồn thành đồ án cách tốt Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bạn sinh viên phịng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, khích lệ động viên tơi suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Hội đồng bảo vệ đồ án tốt nghiệp dành thời gian quý báu để đọc đưa ý kiến đóng góp cho đồ án tốt nghiệp i CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu sử dụng, phân tích đồ án có nguồn gốc rõ ràng, cơng bố theo quy định Các kết nghiên cứu đồ án tơi tự thực hiện, phân tích cách trung thực, khách quan Các kết chưa công bố nghiên cứu khác Các số liệu trích dẫn có ghi nguồn gốc rõ ràng Sinh viên thực Đoàn Thị Luyến ii MỤC LỤC Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp Lời nói đầu i Cam đoan ii Mục lục iii Danh sách bảng v Danh sách hình vi Danh sách chữ viết tắt viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm Vân Chi 1.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái nấm Vân Chi 1.1.3 Chu trình phát triển nấm Vân Chi 1.1.4 Giá trị dược học nấm Vân Chi 1.1.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu sản xuất nấm 10 1.2 Tổng quan enzym laccase 11 1.2.1 Giới thiệu chung laccase 11 1.2.2 Cấu trúc phân tử laccase 12 1.2.3 Cơ chế xúc tác laccase 13 1.2.4 Nguồn thu nhận laccase 15 1.2.5 Ứng dụng laccase 17 1.2.6 Tình hình nghiên cứu laccase 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị thí nghiệm 22 2.2.1 Hóa chất 22 2.2.2 Dụng cụ thí nghiệm 23 2.2.3 Thiết bị thí nghiệm 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy dịch thể 23 iii 2.3.2 Phương pháp thu dịch nuôi cấy 24 2.3.3 Phương pháp tinh 25 2.3.4 Phương pháp xác định hoạt độ laccase 27 2.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 28 2.3.6 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 32 3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 34 3.3 Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 36 3.4 Hiệu kết tủa (NH4 )2SO4 dịch enzym laccase thô thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 39 3.5 Ảnh hưởng dung môi hữu kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 42 3.5.1 Khả kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi dung môi ethanol 42 3.5.2 Khả kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi dung môi acetone 43 3.6 So sánh, lựa chọn chất kết tủa enzym laccase tốt 45 3.7 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hiệu suất kết tủa enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 46 3.8 Xác định khối lượng phân tử enzym laccase 47 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị .49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iv DANH SÁCH CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 22 2.2 Thành phần môi trường khác sử dụng để sản xuất laccase 29 3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 32 3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lắc đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 35 3.3 Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 36 3.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tĩnh đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 38 3.5 Hiệu kết tủa enzym laccase với muối (NH4)2 SO4 40 3.6 Hiệu kết tủa enzym laccase với dung môi ethanol 42 3.7 Hiệu kết tủa enzym laccase với dung môi acetone 44 3.8 So sánh hiệu kết tủa enzym laccase tác nhân tủa khác 45 3.9 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hiệu suất tủa enzym laccase 46 v DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Nấm Vân Chi 1.2 Chu trình phát triển nấm Vân Chi 1.3 Cấu trúc ba chiều enzym laccase từ Melanocarpus albomyces 12 1.4 Trung tâm hoạt động laccase 13 1.5 Cơ chế xúc tác laccase 14 1.6 Q trình oxy hóa tiểu đơn vị phenol lignin laccase 14 1.7 Các kiểu xúc tác laccase 15 1.8 Quá trình oxy hóa phần khơng phenol lignin laccase 15 hợp chất trung gian 2.1 Hiệu nhân giống dịch thể so với nhân giống truyền 24 thống 2.2 Cơ chế phản ứng oxy hóa ABTS enzym laccase 27 3.1 Hoạt độ enzym laccase thu từ môi trường ni cấy khác 33 3.2 Hình ảnh ni cấy nấm Vân Chi môi trường lỏng sau: 34 a) ngày; b) ngày; c) 11 ngày 3.3 Hoạt độ enzym laccase thu thời gian nuôi cấy khác 35 điều kiện ni lắc 3.4 Hình ảnh ni sục khí sau a) ngày; b) ngày; c) ngày 37 ni cấy 3.5 Hình ảnh nuôi cấy tĩnh sau a) ngày, b) 14 ngày, c)22 ngày 38 3.6 Hoạt độ enzym laccase thu thời gian nuôi cấy 39 tĩnh khác 3.7 Hiệu suất tủa enzym laccase nồng độ muối (NH4 )2SO4 bão hòa khác vi 41 3.8 Hiệu suất kết tủa enzym laccase tỷ lệ ethanol khác 43 3.9 Hiệu suất kết tủa enzym laccase tỷ lệ acetone khác 44 3.10 Hiệu suất kết tủa enzym laccase ethanol thời gian 47 tủa khác 3.11 Diện di đồ PAGE 48 vii Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Hoạt độ laccase (U/ml) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 14 ngày 16 ngày 18 ngày 20 ngày 22 ngày Thời gian nuôi cấy tĩnh Hình 3.6 Hoạt độ enzym laccase thu thời gian nuôi cấy tĩnh khác Kết từ bảng 3.4 cho thấy thời gian nuôi cấy tĩnh ảnh hưởng lớn đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Hoạt độ enzym laccase đạt giá trị cao 2,847 U/ml sau 18 ngày nuôi cấy tiếp đến 2,808 U/ml sau 16 ngày ni cấy Có thể thấy, khoảng 16 – 18 ngày nuôi cấy thu enzym có hoạt độ cao Nếu tiếp tục ni cấy hoạt độ enzym giảm cho dù sinh khối tiếp tục phát triển Cụ thể sau 22 ngày ni cấy, hoạt độ enzym giảm cịn 1,851 U/ml So sánh với hoạt độ enzym thu từ phương pháp ni lắc hoạt độ enzym sau 18 ngày nuôi tĩnh tương đương với hoạt độ enzym sau ngày nuôi lắc Điều chứng minh hiệu cao sử dụng nuôi lắc để thu enzym laccase rút ngắn thời gian ni cấy so với ni tĩnh từ 18 ngày ni cấy cịn ngày Nhưng đồng thời, kết luận dùng phương pháp lên men tĩnh để thu enzym nghiên cứu enzym laccase từ nấm Vân Chi thay cho nuôi lắc nuôi sục khí Ưu điểm phương pháp ni cấy tĩnh ni cấy nhiều mẫu lúc, tiết kiệm chi phí lượng chi phí thiết bị so với phương pháp lắc sục khí Tuy nhiên nhược điểm phương pháp thời gian nuôi cấy kéo dài Ngược lại, phương pháp lên men động tốn chi phí lượng chi phí cho thiết bị thời gian nghiên cứu giảm nửa so với lên men tĩnh 3.4 Hiệu kết tủa (NH4)2SO4 dịch enzym laccase thô thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Mỗi enzym có mức độ ion hóa, hydrat hóa lực với nước khác SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 39 Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Do enzym có khoảng nồng độ muối (NH4)2SO4 thích hợp để tủa Mặt khác, sử dụng muối amonium sulfate (NH4)2 SO4 có ưu điểm có khả làm ổn định (làm bền) hầu hết loại enzym Hơn nữa, loại muối lại rẻ phổ biến Độ hịa tan lại lớn (bão hịa 767g/l 250C) Vì vậy, việc nghiên cứu khoảng nồng độ muối (NH4)2SO4 thích hợp để kết tủa enzym có ý nghĩa Thí nghiệm tiến hành theo bước nêu mục 2.3.5 Kết khảo sát nồng độ muối thích hợp để kết tủa enzym đánh giá hiệu kết tủa thu thập, xử lý tổng hợp bảng 3.5 mơ tả hình 3.7 Bảng 3.5 Hiệu kết tủa enzym laccase với muối (NH4 )2SO4 Nồng độ muối Hoạt độ laccase (NH4)2SO4 tổng số (U) 40% 0,000 a 0,000 a 50% 14,58 ± 0,06b 17,01 ± 0,45b 60% 25,27 ± 0,10d 29,48 ± 0,16d 70% 31,20 ± 0,08g 36,39 ± 0,6g 80% 3,129 ± 0,07g 36,50 ± 0,54g 85% 27,89 ± 0,08f 32,53 ± 0,65f 90% 26,73 ± 0,11 e 31,18 ± 1,17e 100% 21,83 ± 0,06c 25,45 ± 0,42c Đối chứng 87,74 ± 0.05 h 100 h Hiệu suất (%) (Số liệu bảng trung bình lần lặp lại Các chữ khác cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD độ tin cậy 95%) SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 40 Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor 40 Hiệu suất (%) 35 30 25 20 15 10 40% 50% 60% 70% 80% 85% 90% 100% Nồng độ muối (NH4)2SO4 Hình 3.7 Hiệu suất tủa enzym laccase nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa khác Từ kết nghiên cứu bảng 3.5 cho thấy phân đoạn từ 40% muối (NH4)2 SO4 bão hịa trở xuống khơng xuất kết tủa Trong phân đoạn 50 – 100% muối bão hịa có tủa xuất nồng độ 50% (NH4)2SO4, hoạt độ enzym hiệu suất tủa enzym laccase thấp, đạt 17,01% Mẫu kết tủa phân đoạn 70 – 80% (NH4)2SO4 đạt hiệu suất cao Và hiệu suất đạt cao 36,5% 80% (NH4)2SO4 bão hòa Khi nồng độ (NH4)2SO4 sử dụng nồng độ cao hiệu kết tủa giảm dần Kết thí nghiệm giải thích thêm muối vào dung dịch enzym laccase thô, phân tử muối phân ly thành ion, ion liên kết với phân tử nước bao quanh protein enzym làm cho protein enzym lớp áo nước, liên kết lại với hình thành kết tủa Tuy nhiên, nồng độ muối cao (>80% muối bão hòa), hiệu suất tủa giảm dần việc sử dụng nồng độ muối (NH4)2 SO4 cao làm biến tính khơng thuận nghịch protein enzym Kết tương đối khớp với kết nghiên cứu Zhijie Qin cộng (2017) có hiệu suất kết tủa enzym laccase từ nấm Vân Chi kết tủa phân đoạn 40 – 80% muối amonium sulfate bão hòa (w/v) qua đêm đạt 38% [37] So sánh với nghiên cứu Nguyễn Thị Phương Mai cộng (2012), hiệu suất kết tủa enzym laccase từ nấm mốc Aspergillus Niger D15#26 lcc1 1.8B kết tủa phân đoạn 40 – 80% muối amonium sulfate bão hòa (w/v) qua đêm đạt 39% [16] Kết thí nghiệm cho thấy hoạt độ riêng hiệu suất thu hồi không quan hệ tuyến tính với nồng độ muối (NH4)2 SO4 sử dụng Nồng độ muối thích hợp SVTH: Đồn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 41 Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor để tủa enzym laccase từ nấm Vân Chi phân đoạn 70 – 80% muối amonium sulfate bão hòa 3.5 Ảnh hưởng dung môi hữu kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Phương pháp kết tủa dung môi hữu tiến hành dựa độ hòa tan protein, phụ thuộc vào tương tác nhóm tích điện phân tử protein với phân tử nước Các dung môi hữu thường dùng ethanol, acetone, ngồi cịn thường sử dụng isopropanol hỗn hợp loại rượu 3.5.1 Khả kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi dung môi ethanol Ethanol loại dung môi hữu sử dụng nhiều không nghiên cứu kết tủa enzym phịng thí nghiệm mà cịn sản xuất cơng nghiệp Thí nghiệm tiến hành theo bước nêu mục 2.3.5 Hiệu ethanol việc kết tủa enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi thu thập, xử lý tổng hợp bảng 3.6 mơ tả hình 3.8 Bảng 3.6 Hiệu kết tủa enzym laccase với dung môi ethanol Tỷ lệ dịch enzym Hoạt độ laccase thô/ethanol tổng số (U) 1:1 9,92 ± 0,07 a 34,71 ± 1,55 a 1:2 14,43 ± 0,05 b 50,49 ± 1,15 b 1:3 22,33 ± 0,06 e 78,12 ± 1,24 e 1:4 20,78 ± 0,05 d 72,69 ± 0,98 d 1:5 18,23 ± 0,06 c 63,79 ± 1,10 c Đối chứng 28,58 ± 0,05f 100,00 f Hiệu suất (%) (Số liệu bảng trung bình lần lặp lại Các chữ khác cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD độ tin cậy 95%) SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 42 Hiệu suất kết tủa (%) Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor 90 80 70 60 50 40 30 20 10 1:1 1:2 1:3 1:4 Tỷ lệ dung dịch enzym thô/ethanol 1:5 Hình 3.8 Hiệu suất kết tủa enzym laccase tỷ lệ ethanol khác Từ kết nghiên cứu bảng 3.6 cho thấy hiệu sử dụng ethanol trình kết tủa enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Hiệu kết tủa enzym laccase đạt giá trị cao sử dụng tỷ lệ dịch enzym thô/ethanol 1:3 với hiệu suất 78,12% Tiếp đến tỷ lệ 1:4 với hiệu suất 72,69% Ngược lại kết tủa enzym với tỷ lệ dịch enzym thô/ethanol 1:5, hiệu suất tủa enzym giảm cịn 63,79% Kết thí nghiệm giải thích thêm ethanol vào dung dịch làm giảm số điện môi dung dịch chứa enzym, làm giảm lực đẩy tĩnh điện protein mang điện tích dấu nên chúng có khả dính kết lại với Khi tăng tỷ lệ dung dịch enzym thơ/ethanol lên số điện môi dung dịch thay đổi nhiều, phân tử dung môi loại lớp phân tử nước bao lấy xung quanh phân tử protein, làm kết tủa nhanh protein Với tỷ lệ dung dịch enzym thô/ethanol 1:1 1:2 số điện mơi thay đổi khơng đáng kể, dẫn tới hoạt độ enzym thấp Ở tỷ lệ 1:3 số điện mơi thay đổi nhiều làm protein kết tủa nhiều Trong khi tỷ lệ dung dịch enzym thơ/ethanol vượt 1:3, số điện môi dung dịch thay đổi mức, thúc đẩy phá hủy enzym, gây biến tính khơng thuận nghịch dẫn đến hiệu suất giảm Do tăng lượng dung mơi hiệu suất giảm dần Vậy lượng dung mơi ethanol thích hợp để tủa enzym laccase tỷ lệ dung dịch enzym thô/ethanol 1:3 (v/v) 3.5.2 Khả kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi dung mơi acetone Thí nghiệm tiến hành theo bước nêu mục 2.3.5 Hiệu SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 43 Nghiên cứu q trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor ethanol việc kết tủa enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi thu thập, xử lý tổng hợp bảng 3.7 mơ tả hình 3.9 Bảng 3.7 Hiệu kết tủa enzym laccase với dung môi acetone Tỷ lệ dịch Hoạt độ laccase tổng enzym/ethanol số (U) 1:1 9,38 ± 0,03 a 32,81 ± 1,05 a 1:2 14,22 ± 0,04 b 49,78 ± 1,31b 1:3 16,40 ± 0,02 d 57,38 ± 0,81 d 1:4 21,01 ± 0,04 e 73,58 ± 1,12 e 1:5 16,88 ± 0,04 c 59,01 ± 1,09 c Đối chứng 28,58 ± 0,05f 100,00 f Hiệu suất (%) (Số liệu bảng trung bình lần lặp lại Các chữ khác cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD độ tin cậy 95%) 80 Hiệu suất kết tủa(%) 70 60 50 40 30 20 10 1:1 1:2 1:3 1:4 Tỷ lệ dung dịch enzym thơ/acetone 1:5 Hình 3.9 Hiệu suất kết tủa enzym laccase tỷ lệ acetone khác Kết bảng 3.7 hình 3.9 cho thấy, acetone tương tự ethanol, tỷ lệ dịch enzym thô/acetone tăng hiệu suất kết tủa enzym tăng đạt giá trị cao 73,58% tỷ lệ dịch enzym thô/acetone 1:4 Nguyên nhân số phân tử dung môi hỗn hợp tăng, chúng tách triệt để lớp phân tử nước bao lấy SVTH: Đồn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 44 Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor xung quanh phân tử protein, làm giảm tính tan protein, tăng khả kết tủa chúng Ở tỷ lệ dung dịch enzym thô/acetone cao hơn, hiệu suất kết tủa enzym laccase giảm 59,01% Cũng giống với dung mơi ethanol, điều giải thích enzym laccase thơ thu bền vững, đồng thời chất enzym protein nên gặp dung mơi hữu có tính phân cực mạnh acetone, enzym dễ dàng bị phá hủy bổ sung lượng aceton nhiều vào để kết tủa Vậy lượng dung mơi acetone thích hợp để tủa enzym laccase tỷ lệ dung dịch enzym thô/acetone 1:4 (v/v) 3.6 So sánh, lựa chọn tác nhân kết tủa enzym laccase tốt Bên cạnh việc tìm tỷ lệ sử dụng thích hợp loại dung mơi q trình kết tủa enzym laccase, hiệu sử dụng loại dung môi cần so sánh nhằm kết tủa enzym laccase với hiệu suất cao nhất, làm gia tăng khả ứng dụng enzym laccase Bảng 3.8 So sánh hiệu kết tủa enzym laccase tác nhân khác Tác nhân tủa Hiệu suất (%) Muối (NH4 )2SO4 (80% bão hòa) 36,50 ± 0,54 Ethanol (1:3 v/v) 78,12 ± 1,24 Acetone (1:4 v/v) 73,58 ± 1,12 (Số liệu bảng trung bình lần lặp lại Các chữ khác cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD độ tin cậy 95%) Từ kết bảng 3.8 cho thấy hiệu kết tủa enzym laccase dung môi hữu cao so với sử dụng muối amonium sulfate (NH4 )2SO4 Khi so sánh hiệu suất tủa hai dung môi ethanol acetone cho thấy, tủa ethanol tỷ lệ 1:3 đạt hiệu suất thu hồi cao tủa acetone tỷ lệ 1:4 Điều giải thích ethanol có số điện mơi cao acetone, dẫn đến độ phân cực ethanol cao acetone Do khả loại bỏ phân tử nước bao quanh protein enzym cao nên hiệu suất tủa cao Đồng thời acetone có độ phân cực thấp ethanol nên cần lượng dung môi lớn (tỷ lệ 1:4) để đạt hiệu suất thu hồi lớn dung môi ethanol cần với tỷ lệ 1:3 đạt hiệu suất thu hồi cao SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 45 Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Vậy tác nhân tủa thích hợp với enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi ethanol với tỷ lệ dung dịch enzym thô/ethanol 1:3 (v/v) 3.7 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hiệu suất kết tủa enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Bên cạnh việc xác định tác nhân tủa tỷ lệ dung mơi thích hợp thời gian thực kết tủa ảnh hưởng đến hiệu suất hoạt độ laccase sau kết tủa Thí nghiệm tiến hành theo bước nêu mục 2.3.5 Kết nghiên cứu tổng hợp xử lý bảng 3.9 mô tả hình 3.10 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hiệu suất tủa enzym laccase Hoạt độ laccase tổng Hiệu suất tủa số (U) (%) 15 phút 18,19 ± 0,06 c 64,62 ± 0,86 c 30 phút 21,46 ± 0,08 d 76,23 ± 1,47 d 45 phút 22,47 ± 0,06 e 79,81 ± 1,32 e 60 phút 15,28 ± 0,05 b 54,29 ± 1,16 b 75 phút 12,77 ± 0,04 a 45,37 ± 0,94 a Đối chứng 28,15 ± 0,04 f 100,00 f Thời gian tủa (Số liệu bảng trung bình lần lặp lại Các chữ khác cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD độ tin cậy 95%) SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 46 Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Hiệu suất thu hồi (%) 100 80 60 40 20 15 phút 30 phút 45 phút 60 phút Thời gian tủa 75 phút Hình 3.10 Hiệu suất kết tủa enzym laccase ethanol thời gian tủa khác Từ kết bảng 3.9 hình 3.10 cho thấy thời gian kết tủa ảnh hưởng lớn đến hiệu suất kết tủa hoạt độ enzym laccase Hiệu kết tủa enzym laccase đạt giá trị cao thời gian kết tủa ethanol 45 phút với hiệu suất tủa 79,81 % Khi tiếp tục tăng thời gian kết tủa ethanol, hiệu suất tủa giảm dần Khi tủa thời gian 75 phút, hiệu suất kết tủa giảm rõ rệt 45,37% Kết thí nghiệm giải thích tăng thời gian kết tủa, lượng enzym thu nhận nhiều Tuy nhiên thời gian kết tủa dài, lại làm tăng khả lớp nước liên kết với protein, gây biến tính protein dung mơi nên hiệu kết tủa giảm Vậy thời gian kết tủa thích hợp cho enzym laccase từ nấm Vân Chi 45 phút sử dụng dung môi ethanol có tỷ lệ dung dịch enzym/ethanol 1:3 (v/v) 3.8 Xác định khối lượng phân tử enzym laccase Dịch enzym thô sau tinh phương pháp kết tủa tiến hành xác định khối lượng phân tử phương pháp điện di khơng biến tính gel polyacrylamide Kết điện di thể hình 3.11 SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 47 Nghiên cứu q trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Hình 3.11 Diện di đồ PAGE Kết điện di khơng biến tính cho thấy xuất vùng oxy hóa xung quanh băng protein cho thấy enzym laccase (băng sáng màu xanh) Khối lượng phân tử so sánh với thang protein chuẩn xấp xỉ 100 kDa So sánh với nghiên cứu khác khối lượng phân tử enzym laccase thu từ nấm Vân Chi cao so với loại enzym laccase thu từ nguồn khác Trong nghiên cứu Nguyễn Thị Phương Mai cộng (2012) enzym laccase từ nấm mốc Aspergillus Niger D15#26 lcc1 1.8B xác định khối lượng phân tử enzym laccase khoảng 70 kDa [16] Nghiên cứu Huifang Xie cộng (2013) tạo laccase tái tổ hợp từ chủng nấm men Pichia pastoris GS115-lccC, loại nấm men sử dụng rộng rãi để sản xuất protein kỹ thuật DNA tái tổ hợp Enzym tái tổ hợp tinh chế cách kết tủa thẩm tách thành đồng điện di, ước tính có khối lượng phân tử khoảng 58 kDa [24] SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 48 Nghiên cứu q trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu, rút kết luận sau: - Các mơi trường khảo sát có khả sinh tổng hợp laccase mơi trường thích hợp để thu enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi môi trường CT5: 200g khoai tây + 20g glucose + 1g MgSO4 7H2 O + 1g KH2PO4 + 0,02g CuSO4 + 0,27g NH4 Cl + 0,5ml ABTS 0,01% Sau ngày nuôi cấy môi trường này, hoạt độ enzym đạt cao 2,803 U/ml - Thời gian thích hợp để ni trồng nấm Vân Chi sinh enzym laccase với công thức môi trường CT5 ngày với hoạt độ đạt 2,858 U/ml - Hiệu sinh enzym laccase phương pháp nuôi lắc cao phương pháp ni sục khí ni tĩnh - Q trình kết tủa enzym laccase muối amonium sulfate đạt hiệu cao nồng độ 80% (NH4)2 SO4 bão hòa với hiệu suất đạt cao 36,50% - Kết tủa enzym laccase dung môi ethanol đạt hiệu suất tủa cao (78,12%) sử dụng tỷ lệ dịch enzym laccase thô/ethanol 1:3 Kết tủa enzym dung môi acetone đạt giá trị hiệu suất cao 73,58% tỷ lệ dung dịch enzym thô/acetone 1:4 Vậy loại dung mơi thích hợp để kết tủa enzym laccase ethanol thời gian kết tủa thích hợp 45 phút - Khối lượng phân tử enzym laccase từ nấm Vân Chi khoảng 100 kDa 4.2 Kiến nghị Công nghệ thu nhận tinh enzym laccase mang lại nhiều hiệu kinh tế ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhau: công nghiệp giấy, công nghiệp dệt, công nghệ thực phẩm đặc biệt ứng dụng enzym hướng đến bảo vệ mơi trường enzym Vì thời gian điều kiện nghiên cứu, trang thiết bị hạn chế, đề tài cần nghiên cứu sâu thêm với kiến nghị sau: - Khảo sát thêm yếu tố mơi trường ni cấy khác ảnh hưởng đến q trình nuôi cấy nấm Vân Chi để thu enzym bổ sung chất cảm ứng, nghiên cứu kết hợp phương pháp sục khí phương pháp lắc - Khảo sát thêm loại muối khác dung môi hữu với nồng độ, tỷ lệ thích hợp cho trình kết tủa enzym đạt hiệu suất cao SVTH: Đồn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 49 Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor - Khảo sát kết hợp thêm phương pháp tinh enzym laccase khác lọc màng, sắc ký để thu enzym với độ tinh cao SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 50 Nghiên cứu q trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Nguyễn Thị Sơn, Zan Fderico, Nấm ăn – sở khoa học công nghệ nuôi trồng, Nhà xuất Nông nghiệp, 2002 [2] Klaus Piontek, Matteo Antorini, and Thomas Choinowski, 2002, “Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1,90 Å resolution containing a full complement of coppers”, The Journal of biological chemistry, 277(40), trang 37663 – 37669 [3] Adinarayana Kunamneni, Antonio Ballesteros, Francisco J Plou and Miguel Alcalde, 2007, “Fungal laccase - a versatile enzyme for biotechnological applications”, Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology [4] Bukola Christianah Adebayo-Tayo and Edwin Emeka Ugwu, 2011, “Influence of Different Nutrient Sources on Exopolysaccharide Production and Biomass Yield by Submerged Culture of Trametes versicolor and Coprinus sp ”, 15(2), pp 63 - 69 [5] Nguyễn Thị Bích Thùy, Luận án: Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơng nghệ nhân giống, ni trồng nấm sị vua (Pleurotus eryngii) nấm Vân Chi (Trametes versicolor) Việt Nam Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, 2014 [6] Trịnh Tam Kiệt, Nguyễn Thị Bích Thùy, 2010, “Nghiên cứu đặc điểm sinh học kỹ thuật nuôi trồng nấm Vân Chi”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp, 1(1), trang 77 - 85 [7] Lê Xuân Thám, Nguyễn Giang, Nguyễn Thị Diệu Hạnh, 2009, “Nghiên cứu tích tụ Selenium nấm Vân Chi Trametes versicolor phân tích kích hoạt neutron”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, tập 47, số 1, trang 73 - 79 [8] http://khoahocphattrien.vn/suc-khoe/san-xuat-nam-van-chi-gop-phan-chongung-thu-va-hivaids/20181025023931116p1c784.htm [9] Nguyễn Lân Dũng, 2002, Công nghệ nuôi trồng nấm tập 2, Nhà xuất Nông nghiệp [10] https://linhchinonglam.com/cong-dung-cua-nam-van-chi-voi-benh-ung-thuhiv/ (Truy cập lần cuối ngày 1/12/2019) [11] Oba K., Teramukai S., Kobayashi M., Matsui T and Kodera Y., 2007, “Efficacy of adjuvant immunochemotherapy with polysaccharide K for patients with curative resections of gastric cancer”, Cancer Immunology Immunotherapy, 56(6), pp 905 - 1111 [12] Kidd P.M, 2000, “The Use of Mushroom Glucans and Proteoglycans in Cancer Treatment”, Alternative Medicine Review, 5(1), pp - 27 [13] http://namvanchi.com/nam-van-chi/cong-dung-cua-nam-van-chi-trong-dieutri-ung-thu.html (Truy cập lần cuối ngày 1/12/2019) SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 51 Nghiên cứu q trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor [14] https://lanhao.vn/kem-nam-nam-van-chi/ (Truy cập lần cuối ngày 1/12/2019) [15] http://namvanchi.com/nam-van-chi/cac-nghien-cuu-ve-cong-dung-cua-namvan-chi.html (Truy cập lần cuối ngày 1/12/2019) [16] Nguyễn Thị Phương Mai, Lê Quang Hòa, and Tô Kim Anh, 2012 , “Tinh xác định đặc tính laccase tái tổ hợp từ Aspergillus Niger D15#26 lcc1 1.8B”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, 50(3), trang 297 - 304 [17] Santhanam N and Vivanco J.M, Decker SR, 2011, “Expression of industrially relevant laccases: prokaryotic style”, Trends in Biotechnolo gy, pp 480 - 489 [18] Christopher F Thurston, 1994, “The structure and function of fungal laccases”, Microbiology, 140, pp 19 - 26 [19] Susana Rodríguez Couto and José Luis Toca Herrera, 2006, “Industrial and biotechnological applications of laccase: A review”, Biotechnology advances, 24(5), pp 500 - 513 [20] Adinarayana Kunamneni, Francisco J Plou, Antonio Ballesteros and Miguel Alcalde, 2008, Recent Patents on Biotechnology, “Laccase and their applications”, 2(1), pp 10 - 24 [21] Kurniawati S and Nicell JA, 2008, “Characterization of Trametes versicolor laccase for the transformation of aqueous phenol”, Bioresources Technology, 99(16), pp 7825 - 7834 [22] Tugba Aydınoglu and Sayıt Sarg, 2013, “Production of laccase from Trametes versicolor by solid-state fermentation using olive leaves as a phenolic substrate”, Bioprocess and biosystems Engineering, 36(2), pp 215 - 223 [23] Daniela Chmelova and Miroslav Ondrejovic, 2015, “Effect of metal ions on triphenylmethane dye decolorization by laccase from Trametes Versicolor”, Nova Biotechnological et Chimica, 14(2), pp 191 - 199 [24] Xie, Huifang, Qi Li, Minmin Wang and Linguo Zhao, 2013, “Production of a Recombinant Laccase from Pichia pastoris and Biodegradation of Chlorpyrifos in a Laccase/Vanillin System”, J Microbiol Biotechnol, 23(6), pp 864 - 871 [25] Dương Minh Lam Trương Thị Chiên, 2013, “Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng nấm Đảm Trametes maxima CPB30 sinh laccase ứng dụng xử lý màu nước ô nhiễm thuốc nhuộm”, Tạp chí sinh học, 35(4), trang 477 - 483 [26] Ngụy Thị Mai Thảo, Trần Văn Khuê Lương Bảo Uyên, 2014, “Ảnh hưởng số ion kim loại lên khả sinh tổng hợp laccase nấm Pleurotus sp.”, Tạp chí sinh học, 36(1se), trang 107 - 111 [27] Trần Thị Thu Hiền, Lê Thị Hiền, Nguyễn Văn Huynh, Đinh Thị Thu Hằng Đặng Thị Cẩm Hà, 2016, “Phân lập, nghiên cứu mơi trường thích hợp sinh tổng hợp Laccase chủng nấm Đảm thu thập từ vườn quốc gia Bidoup - Núi SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 52 Nghiên cứu q trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Bà khả loại màu thuốc nhuộm chúng”, Tạp chí cơng nghệ sinh học, 14(2), trang 313 - 325 [28] Muhammad Asgher, Sadia Noreen and Muhammad Bilal, 2017, “Enhancing catalytic functionality of Trametes versicolor IBL-04 laccase by immobilization on chitosan microspheres”, Chenical Engineering Research and design, 119, pp - 11 [29] Myleidi Vera, Gibson S.Nyanhongo, Georg M.Guebitz and Bernabe L Rivas, 2019, “Polymeric microspheres as support to co-immobilized Agaricus bisporus and Trametes versicolor laccases and their application in diazinon degradation”, Arabian Journal of Chemistry [30] http://iasvn.org/homepage/Dot-pha-trong-SX-giong-nam-6725.html.(Truy cập lần cuối ngày 1/12/2019) [31] https://www.vnua.edu.vn/cong-nghe-ung-dung-trong-nong-nghiep/congnghe-nhan-giong-nam-dich-the-32280.html (Truy cập lần cuối ngày 1/12/2019) [32] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Anh Tạ Thu Hằng, Công nghệ enzym, Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, 2004 [33] Bùi Xn Đơng, Giáo trình cơng nghệ enzym, Đại học Bách khoa Đà Nẵng [34] Đỗ Quý Hai, Phương pháp nghiên cứu enzym [35] https://slideshare.vn/sinh-hoc/chuong-2-dien-di-gel-3cpptq.html (Truy cập lần cuối ngày 1/12/2019) [36] Lars Rehmann, Ekaterina Ivanova and Jamie L Ferguson, 2012, “ Measuring the effect of ionic liquids on laccase activity using a simple, parallel method”, Green Chemistry, 14, pp 725 - 733 [37] Zhijie Qin, Qiulin Yue, Orlando Borras-Hidalgo and Xinli Liu, 2017, “Laccase Enzyme from Trametes versicolor with a High Decolorizing Ability on Malachite Green”, EC Microbiology, 10.3, pp 127 - 133 SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật Nguyễn Thị Bích Hằng 53 ... 37 Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Để mở rộng phạm vi nghiên cứu cho nghiên cứu thu enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm. .. 36 Nghiên cứu q trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor Bảng 3.3 Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy. .. Nghiên cứu trình thu nhận tinh enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Giống nấm Vân Chi lấy từ