Nhân bản, biểu hiện tiết và đặc tính của tái tổ hợp β-annanase từ Bacillus circulans NT 6.7

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Nhân bản, biểu hiện tiết và đặc tính của tái tổ hợp β-mannanase từ Bacillus circulans NT 6.7 GVGD: TS.Đỗ Biên Cương SVTT: Bùi Trung Hiếu MSSV: 20112988 Mục lục i. giới thiệu 1. mannan 2.manose 3.beta-mannanase ii. Chuyển gen 1. nuôi cấy và nhân bản 2. xây dựng plasmid tái tổ hợp 3. biểu hiện 4. kết quả 1. mannan -Mannan là một loại polysaccharide không bột với đơn phân là đường mannose. -Là đơn vị lưu trữ polysaccaride trong tế bào. -mannan có ở vách tế bào nấm men, thực vật ( đậu tương, cao lương, cám gạo,…) I. GIỚI THIỆU 2. Mannose điều chỉnh hệ thống miễn dịch - bề mặt của các đại thực bào có thể nắm bắt kháng nguyên. - tăng trong chữa lành vết thương - tác dụng chống viêm - ức chế sự phát triển khối u và di căn, tăng ung thư sống sót - tránh nhiễm khuẩn nhất định, chẳng hạn như nhiễm trùng đường tiết niệu. I. GIỚI THIỆU 3.βeta-mannanase - beta-mannanase là một endohydrolase, xúc tác thủy phân ngẫu nhiên liên kết mannopyranosyl β-1,4-D trong huỗi chính của polysaccharides mannan. - beta-mannanase được sản xuất bởi nhiều loại vi sinh vật Nó có thể được sử dụng rộng rãi trong một loạt các thức ăn dinh dưỡng để cải thiện khả năng tiêu hóa và động vật hoạt động sản xuất để tăng hiệu quả kinh tế. I. GIỚI THIỆU nguyên tắc chung Sinh vật cho gen Vector biểu hiện DNA tái tổ hợp Chuyển vào tế bào đích biểu hiện gen mong muốn II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE Tiến hành chuyển gen mã hóa b-mannanase từ B. circulans NT 6.7 biểu hiện trên tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) sử dụng vector biểu hiện plasmid pET-21D với việc sử dụng vi khuẩn E. coli DH5α làm vật chủ tách dòng gen. II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE Tiến hành 1. nuôi cấy và nhân bản - B. circulansNT 6.7 đã đ c nuôi trong Luria-Bertani (LB) trung bình 37 ° C v i l c 200 rpm đ phân l p các gen DNA.ượ ở ớ ắ ở ể ậ - Gen mannanase c aủ B.circulansNT 6.7 đ c thu th p b ng cách s d ng nhân b n PCR (1083 bp).ượ ậ ằ ử ụ ả II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE 2 Xây dựng các plasmid tái tổ hợp - DNA của B. circulans NT 6.7 được chiết xuất bằng cách sử dụng các vi khuẩn ™ Illustra genomicPrep Thống spin Kit. - Mồi F1 (ATGCTTAAAAAGTTAGC AGTCTGYCT) R1 (TTATTCCGCGATCGGCGTCAA - Khuếch đại được thực hiện bằng cách sử dụng Dream® Taq DNA polymerase - chu kỳ phản ứng: + ban đầu ở 95 ° C trong 5 phút + 30 chu kỳ của 95 ° C trong 1 phút + 55 ° C trong 1 phút và 72 ° C trong 2 phút + cuối cùng ở 72 ° C trong 5 phút. + Các sản phẩm khuếch đại được gắn vào các pGEM-T dễ dàng vector và chuyển đổi thành E. coli DH5α để sắp xếp. II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE 3 Biểu hiện của mannanase - E. coli BL21 (DE3) được cấy vào 100 ml LB trung bình 100 mg / ml ampicillin. - ủ ở 37 ° C và 200 rpm cho đến khi OD600 đạt 1.0 - thêm IPTG với nồng độ là 0,1, 0,5 và 1,0 mM. - Sau khi IPTG cảm ứng, việc nuôi cấy tiến hành ở 18 ° C với 200 rpm trong 16, 18 và 20 giờ. - Các tế bào được thu hoạch bằng ly tâm ở 8000 rpm, 4 ° C trong 30 phút. - rửa hai lần với 50 mM potassium phosphate đệm pH 6,0 và sau đó lơ lửng trong cùng một bộ đệm. - Chiết xuất tế bào bằng ly tâm ở 13.000 rpm trong 3o phút. II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE [...]... zymogram trên b ề m ặt gel Bảng 1 Năng suất tái tổ hợp β-mannanase trong khoang tế bào khác nhau của E. coli  (từ 100 ml )  Hình 1 SDS-PAGE và zymogram phân tích tái tổ hợp β-mannanase từ E.coli hệ thống biểu hiện.    Đặc tính của tái tổ hợp β-mannanase Những ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme được xác định cho cả hai tái tổ hợp β-mannanase ngoại bào và nội bào Thank you ! ... kết quả - Gen mannanase độ dài đầy đủ của B. circulans NT 6.7 bao gồm trình tự tín hiệu ban đầu của nó đã được nhân bản vô tính thành pET21d, và gen có thể đ ược thể hiện thành công trong E. coli BL21 (DE3) điều khiển bởi promoter T7 RNA polymerase.  - Sau khi cảm ứng với nồng đ ộ khác nhau c ủa IPTG, ho ạt động β-mannanase đ ược đo ở c ả hai n ền văn hóa n ổi và tế bào lysate phân s ố.  -Hoạt động... bào và n ội bào 37,1 U m ỗi ml thô và 515 U m ỗi ml chiết xuất tế bào thô, tương ứng, tương ứng với một hoạt động tích của 37.100 và 515.000 U mỗi lít môi tr ường nuôi c ấy. H ầu h ết các t ế bào tái t ổ h ợp βmannanase đã được tìm thấy trong không gian periplasmic c ủa các t ế bào  C ả hai n ội bào và ngo ại bào β-mannanase cho th ấy kích th ước gi ống h ệt nhau đó là khoảng 40 kDa trên SDS-PAGE, và. .. 1.0 mM IPTG, đặc bi ệt là ở phần ngo ại bào, trong khi m ức đ ộ ho ạt đ ộng β-mannanase trong phần tế bào lysate tương tự như không phụ thuộc vào nồng độ IPTG sử dụng. Hơn nữa, hoạt đ ộng trong tế bào β-mannanase gi ảm sau khi ủ h ơn 16 gi ờ mà không có sự gia tăng của hoạt đ ộng β-mannanase bào.  - các điều kiện biểu hiện tối ưu cho sự biểu hi ện gen mannanase là cảm ứng 1,0 mM IPTG và 16 giờ ủ ở . suất tái tổ hợp β-mannanase trong khoang tế bào khác nhau của E.coli7 (từ 100 ml )  Hình 1 SDS-PAGE và zymogram phân tích tái tổ hợp β-mannanase từ E.coli7hệ thống biểu hiện.   Đặc tính của tái. ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Nhân bản, biểu hiện tiết và đặc tính của tái tổ hợp β-mannanase từ Bacillus circulans NT 6. 7 GVGD: TS.Đỗ Biên Cương SVTT: Bùi Trung Hiếu MSSV:. thiện khả năng tiêu hóa và động vật hoạt động sản xuất để tăng hiệu quả kinh tế. I. GIỚI THIỆU nguyên tắc chung Sinh vật cho gen Vector biểu hiện DNA tái tổ hợp Chuyển vào tế bào đích biểu