Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính protease tái tổ hợp từ chủng escherichia coli BL21 (DE3) và khảo sát khả năng ứng dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính Protease tái tổ hợp từ chủng Escherichia coli BL21(DE3) khảo sát khả ứng dụng PHẠM THỊ HẰNG NGA Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Đặng Thị Thu PGS.TS Trương Quốc Phong Viện: Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 12/2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính Protease tái tổ hợp từ chủng Escherichia coli BL21(DE3) khảo sát khả ứng dụng PHẠM THỊ HẰNG NGA Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Đặng Thị Thu PGS.TS Trương Quốc Phong Viện: Công nghệ thông tin Truyền thông HÀ NỘI, 12/2019 Chữ ký GVHD Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: luận văn tốt nghiệp: “ Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính protease tái tổ hợp từ chủng Escherichia coli BL21 (DE3) khảo sát khả ứng dụng ” thực hướng dẫn khoa học GS TS Đặng Thị Thu PGS.TS Trương Quốc Phong trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên học tập làm việc Trung tâm Nghiên cứu Phát triển CNSH, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo luận văn Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2019 Tác giả Phạm Thị Hằng Nga Phạm Thị Hằng Nga - 2017A Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu PGS.TS Trương Quốc Phong , Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Nhân dịp tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Viện nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, tơi xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ tơi q trình thí nghiệm Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Học Viên Phạm Thị Hằng Nga Phạm Thị Hằng Nga - 2017A Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACE Angiotensin I Converting Enzym ACEI Angiotensin-converting enzym (ACE) inhibitors DPPH 1,1-diphenl-2-picrylhydrazyl KC Kiểm chứng LB Lysogeny broth TYP Môi trường tự cảm ứng M Marker protein LC-MS/MS OPA SDS –PAGE Phạm Thị Hằng Nga - 2017A Liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry O-Phthaladehyde Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis - Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Trang Hình Phản ứng thủy phân liên kết peptide Hình 2: Cấu trúc bậc papain Hình 3: Các bước xúc tác nhóm serine protease Hình 4: Cơ chế xúc tác Cystein protease Hình Quy trình tổng quát thu nhận protease tái tổ hợp 15 Hình Biều đồ hoạt tính sinh học peptide quan tâm 24 nghiên cứu Hình Minh hoạ chế kháng khuẩn peptide có hoạt tính sinh 26 học [37] Hình 8: Cấu trúc vector pJet1.2/blunt 31 Hình 9: Cấu trúc vector pET-28b(+) 32 Hình 10: Đường cong sinh trưởng chủng chế độ nhiệt độ khác 45 Hình 11: Thử vịng hoạt tính đĩa thạch casein sau 24h ni cấy 46 Hình 12: Thử vịng hoạt tính đĩa thạch casein sau 96h ni cấy 47 Hình 13: Ảnh điện di 20oC thể vùi 47 Hình 14 : Thử hoạt tính đĩa thạch casein sau 24h nuôi cấy theo 49 nồng độ lactose thể tan Hình 15 : Thử hoạt tính đĩa thạch casein sau 24h nuôi cấy theo 49 nồng độ lactose thể tan Hình 16 : Thử hoạt tính đĩa thạch casein sau 24h nuôi cấy theo 50 nồng độ lactose thể vùi Phạm Thị Hằng Nga - 2017A Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Hình 17: Ảnh điện di sau tinh 52 Hình 18: Kết làm Western Blot 52 Hình 19: Ảnh hưởng pH tới hoạt độ protease tái tổ hợp 52 Hình 20: Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ protease tái tổ 53 hợp Hình 21: Ảnh hưởng pH đến khả tạo peptide 57 Hình 22: Quy trình cơng nghệ thu chế phẩm protease tái tổ hợp 59 Hình 23: Ảnh hưởng nồng độ enzym đến khả tạo peptide sinh 60 học Hình 24: Ảnh hưởng nồng độ chất tới khả tạo peptide 61 Hình 25: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tạo peptide 62 Hình 26: Ảnh hưởng thời gian khả tạo peptide 63 Hình 27: Điện di đồ sản phẩm peptide thời điểm thủy phân khác 64 Hình 28: Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu để thủy phân bã men bia 69 Hình 29: Quá trình thuỷ phân giới hạn bã nấm men bia protease 70 thu peptide có hoạt tính sinh học Phạm Thị Hằng Nga - 2017A Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1: Ảnh hưởng nồng độ lactose đến sinh tổng hợp protease tái tổ hợp 48 Bảng 2: Tách tinh phương pháp sắc ký lực 49 Bảng 3: Khảo sát độ bền pH 52 Bảng 4: Khảo sát độ bền nhiệt 54 Bảng Ma trận thực nghiệm Box-Benken ba yếu tố hàm lượng peptide 63 thu điều kiện thủy phân khác Phạm Thị Hằng Nga - 2017A Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH iv PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan protease 1.1.1 Khái niệm cấu tạo [1,2] .3 1.1.2 Phân loại chế [1,2] 1.1.3 Nguồn thu nhận protease 1.1.4 Các điều kiện lên men sinh tổng hợp protease 1.1.4.1 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng [5] 1.1.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ [6] 11 1.1.4.3 Ảnh hưởng pH [6] .12 1.1.4.4 Ảnh hưởng tỷ lệ giống 13 1.1.4.5 Ảnh hưởng tốc độ khuấy 13 1.1.5 Quy trình thu nhận protease [7] .13 1.1.6 Khái niệm enzym tái tổ hợp 16 1.1.7 Hệ biểu Ecoli tái tổ hợp [3] .17 1.1.8 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protein tái tổ hợp .17 1.1.8.1 Ảnh hưởng chất cảm ứng [3,10] 17 1.1.8.2 Ảnh hưởng nhiệt độ tổng hợp protein tái tổ hợp 18 1.1.8.3 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng [3] 19 1.1.8.4 Ảnh hưởng tối ưu hóa codons [3] 19 1.1.9 ỨNG DỤNG PROTEASE [7] 20 1.2 Tổng quan peptide 23 1.2.1 Khái niệm peptide peptide sinh học 23 1.2.2 Hoạt tính sinh học peptid 25 Phạm Thị Hằng Nga - 2017A Luận văn thạc sỹ 1.2.2.1 Cơng nghệ sinh học Hoạt tính kìm hãm ACE (Angiotensin Converting Enzym Inhibitory) 25 1.2.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm virut .26 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .31 2.1 Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1 Nguyên liệu 31 2.1.2 Hóa chất 32 2.1.3 Thiết bị 34 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 34 2.2.1.1 Phương pháp hoạt hóa 34 2.2.1.2 Khảo sát điều kiện lên men biểu Protease .35 2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh 35 2.2.2.1 Phương pháp tách chiết protein thể tan thể vùi 35 2.2.2.2 Tách tinh protease tái tổ hợp phương pháp sắc ký lực (HisTrap HP) 36 2.2.2.3 Phương pháp Westernblot 36 2.2.3 Xác định hoạt độ protease phương pháp Anson cải tiến 37 2.2.4 Thủy phân bã nấm men bia protease tái tổ hợp tinh peptide40 2.2.5 Phương pháp điện di gel Polyacrylamide (SDS- PAGE) 41 2.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 41 2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng peptide tổng OPA .42 2.2.8 Tối ưu hóa q trình thủy phân bã nấm men bia theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ) .42 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Khảo sát điều kiện nuôi sinh tổng hợp protease tái tổ hợp 45 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh tổng hợp protease tái tổ hợp 45 Phạm Thị Hằng Nga - 2017A Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 16h M 18h 20h 22h 24h Hình 27: Điện di đồ sản phẩm peptide thời điểm thủy phân khác Từ kết hình 27, cho thấy thời gian hàm lượng peptide đạt cực đại 18h Tương ứng với kết thể hình 27 Từ khoảng thời gian 20 đến 24h, hàm lượng giảm dần lượng bã nấm men cung cấp cạn kiệt thời gian thủy phân kéo dài khiến lượng peptide bị chuyển hóa thành axit amin Dựa điện di, ta thấy hàm lượng peptide sinh nhiều vào thời điểm 18h sau 3.5.6.Tối ưu hóa điều kiện thủy phân bã nấm men bia theo phương pháp quy hoạch bậc Box-Behnken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 Dựa sở khảo sát điều kiện thích hợp tạo peptide có hoạt tính sinh học yếu tố ảnh hưởng đơn: nồng độ enzym, pH, nhiệt độ, nồng độ chất, thời gian Nhận thấy để đạt hiệu thủy phân thu peptide sinh học cao, 64 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời số yếu tố theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken đến trình thủy phân giới hạn bã men bia protease nhằm tìm điều kiện tối ưu để thu peptide sinh học Quy hoạch sử dụng yếu tố cần tối ưu (nồng độ enzym, nồng độ chất, thời gian) ma trận thực nghiệm thiết lập gồm 17 thí nghiệm kết hợp mức (cao, thấp, trung bình) yếu tố cần khảo sát Riêng thí nghiệm kết hợp yếu tố mức trung bình ( thí nghiệm tâm ) lặp lại lần cố định nhiệt độ 37oC, thời gian thủy phân 18 Kết thí nghiệm thể bảng Bảng :Ma trận thực nghiệm Box-Benken ba yếu tố hàm lượng peptide thu điều kiện thủy phân khác STT Nồngđộ Enzym Nồng độ Thời chất (%) (%) gian Hàm (giờ) lượng Peptide (mg/ml) X1 X2 X3 25 18 335.01 25 18 390.43 35 18 361.87 35 18 410.88 30 16 410.71 6 30 16 420.89 30 20 435.21 65 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 30 20 465.01 25 16 392.67 10 35 16 418.89 25 20 436.87 35 20 455.12 30 18 466.71 30 18 465.09 30 18 452.02 30 18 441.07 30 18 450.01 11 12 13 14 15 16 17 Kết từ bảng cho thấy, từ số liệu bảng nhận thấy hàm lượng Peptide cao thí nghiệm 13 (466,71 mg/ml) thấp thí nghiệm (335,01 mg/ml) 66 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Bảng 6: Phân tích phương sai ANOVA mơ hình Thơng số Mơ hình SS 21475.11 D f MS Chuẩn F Mức có nghĩa p 92386.12 16.63 0.0006 2606.78 18.17 0.0037 (%) (X2) 1052.95 7.34 0.0302 Thời gian (giờ) (X3) 2776.99 2776.99 19.35 0.0032 Nồng độ bã nấm 2606.78 men (%) (X1) Nồng độ Enzym 1052.95 X1 10.27 10.27 0.072 0.7968 X2 96.24 96.24 0,67 0.4398 X3 15.88 15.88 0,11 0.7491 X1× X2 5665.71 5665.71 39.49 0.0004 X1× X3 8059.21 8059.21 56.17 0.0001 X2× X3 904.60 904.60 6.30 0.0403 Residual 1004.42 7143.49 Lack of Fit 537.67 3179.22 1,54 0.3354 Sai số (pure error) 466.76 4116.69 SS tổng số 22479.53 67 Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học • SS: Tổng phương sai; df: bậc tự do; MS: trung bình bình phương sai: Chuẩn F: chuẩn Fisher; Residual: phần dư; “ Lack of Fit”: chuẩn đánh giá độ khơng tương thích mơ hình với thực nghiệm Kết phân tích phương sai mơ hình tối ưu phần mềm DesignExpert 7.15 (State-Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ) trình bày bảng (bảng ANOVA) cho thấy yếu tố có ảnh hưởng tới trình thủy phân tạo Peptide Giá trị F mơ hình 16,63 với p=0,0006 ( p< 0,05) cho thấy dạng mơ hình lựa chọn hợp lý Giá trị p “Lack of Fit” 0,3354 (p >0,05) cho thấy mơ hình tương hợp với thực nghiệm Phương trình hàm hồi quy biểu hàm lượng Peptide mô tả ảnh hưởng yếu tố độc lập mối tương tác chúng biểu diễn: Y= +454.98+ 18.05.X1 +11.47.X2 + 18.63.X3 – 1.60.X1X2 +4.91.X1X3 – 1.99X2X3 – 36.68.X12 – 43.75.X22+ 14.66.X32  Tối ưu hóa điều kiện thủy phân bã men bia protease Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa hàm lượng peptide thu sau q trình thủy phân phần mềm Design-Expert Kết tìm 100 phương án thí nghiệm có phương án tốt để cực đại hàm mục tiêu dự đoán là: Nồng độ enzym 5,24%; nồng độ chất 30,54%; thời gian 18,90 Khi hàm lượng peptide đạt điều kiện theo tính tốn 469,603 mg/ml Kết có độ tương thích cao so với kết kiểm tra thực nghiệm 68 Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Hình 28: Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu để thủy phân bã men bia Hàm lượng Peptide đạt điều kiện theo tính tốn xấp xỉ 469,18 mg/ml Kết có độ tương thích cao với kết kiểm tra lại thực nghiệm (466,71 mg/ml) 3.5.7 Xây dựng quy trình thủy phân giới hạn bã nấm men bia protease thu peptide có hoạt tính sinh học Làm trịn thơng số tối ưu, chúng tơi xây dựng quy trình cơng nghệ thu peptide có hoạt tính sinh học phương pháp thủy phân giới hạn bã nấm men bia nhờ chế phẩm protease tái tổ hợp: 69 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Bã nấm men bia Tiền xử lý (Bã nấm men/nước : ½), Ly tâm 10000v/ph, 4oC, 10 phút, Gia nhiệt 95oC, phút Thủy phân giới hạn enzyme protease nồng độ %, bã nấm men 30 %, pH 7, 37oC, 150v/p, thời gian thuỷ phân 18 Gia nhiệt 95oC, phút Ly tâm 12000v/phút, 4oC, 20 phút Lọc qua màng cut off 10kDa Peptide sinh học Hình 29: Quá trình thuỷ phân giới hạn bã nấm men bia protease thu peptide có hoạt tính sinh học 70 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Bước 1: Tiền xử lý: Nấm men lấy từ nhà máy, rửa với nước lạnh, sau để lắng tự nhiên 30 phút, trình lặp lại lần Tỉ lệ bã nấm men/ nước : 1/2 Mục đích loại bỏ bia vị đắng, số tạp chất Sau rửa, ly tâm loại bớt nước Bước 2: Thủy phân bã nấm men bia: bổ sung lượng nước vào bã nấm men bia cho nồng độ chất 30%, dịch bã nấm men đun cách thủy (gia nhiệt) 95oC phút để diệt nấm men sống Bổ sung lượng enzym nồng độ 5%, chỉnh pH = sau thủy phân 37oC, thời gian 18 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút Bước 3: Kết thúc trình thủy phân, dịch thủy phân đun cách thủy 95oC phút để bất hoạt enzym Sau đó, dịch peptide ly tâm 12000 vòng/ phút, thời gian 20 phút, nhiệt độ oC Loại bỏ bã, thu dịch bên Bước 4: Dịch sau thủy phân lọc qua màng cut off 10 kDa Bước 5: Thu peptide sinh học Tính hiệu suất thuỷ phân theo công thức mục 2.2.1 thu kết thuỷ phân bã nấm men bia thu peptide có khối lượng phân tử < 10kDa điều kiện thuỷ phân nồng độ %, bã nấm men 30%, pH 7, 37oC, 150v/p, thời gian thuỷ phân 18 , hiệu suất đạt xấp xỉ 50 % 71 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN • Đã chứng minh vi khuẩn E.coli BL21 DE3 chứa gen AprN mã hóa sinh tổng hợp protease tái tổ hợp có khối lượng phân tử 40 kDa • Xác định điều kiện lên men chủng E.coli BL21 DE3- AprN tái tổ hợp sinh protease tái tổ hợp: + chất cảm ứng lactose 0,5% + Nhiệt độ 20oC + pH + Thời gian 24 • Đã xác định số đặc tính protease tái tổ hợp + Nhiệt độ tối ưu 37oC; bền vùng nhiệt độ: 25-45oC sau 60 phút hoạt độ lại từ 86,7 % đến 72,1% + pH tối ưu 7; bền vùng pH 7-9 sau 60 phút hoạt độ lại từ 84,5 % đến 84,9 % • Đã tối ưu hóa điều kiện thủy phân giới hạn bã nấm men bia chế phẩm protease tái tổ hợp: nồng độ protease % ( 179,2 U/g ), bã men bia 30%, nhiệt độ 37 oC, pH 7, thời gian thủy phân 18 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học khác dịch thủy phân bã nấm men bia hoạt tính chống ung thư, khả tăng cường sức đề kháng… - Nghiên cứu ứng dụng bổ sung vào thực phẩm chức năng, thuốc chống tăng huyết áp 72 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học PHỤ LỤC I Đồ thị đường chuẩn tyrosin Xây dựng đường chuẩn tyrosin để xác định hoạt độ protease Tyrosin (mg/ml) OD 660nm 10 0,099 0,205 20 30 40 50 60 0,384 0,562 0,707 0,902 1,071 Hình PL1 Đồ thị đường chuẩn tyrosin II Đồ thị đường chuẩn peptone Xây dựng đường chuẩn peptone để xác định hàm lượng peptide theo phương pháp OPA sau: 73 Luận văn thạc sỹ Peptone (mg/ml) OD 340nm Công nghệ sinh học 10 0,508 0,876 1,186 1,406 1,809 Nồng độ peptone mg/ml Hình PL2 Đồ thị đường chuẩn peptone 74 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tham khảo tiếng Việt Bùi Xuân Đông (2015), “Giáo trình cơng nghệ enzym”, NXB Trường Đại Học Bách Khoa- Đại học Đà Nẵng 2.Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, (2003), “Công nghệ enzym”, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội Đỗ Thị Thu Hà ( 2016), “Nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu VP6 ứng dụng cho phát triển que thử phát nhanh VIRUS ROTA”, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Hồ Xưởng (1996), “Công nghệ sản xuất bia”, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi (2002), “Hóa sinh cơng nghiệp”, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội Lê Gia Hy, Đặng Tuyết Phương (2010), “Enzym vi sinh vật chuyển hóa sinh học”, Nhà xuất Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ Lương Minh Khánh (2015), “Thiết kế phân xưởng sản xuất nước mắm ngắn ngày suất 500.000 lít/năm”, Trường đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM Nguyễn Hữu Tuyển, Phạm Tiến Dũng, Phan Thị Kim Ngân, Ngô Võ Kế Thành (2019), “Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis Bs04 xác định đặc tính enzym”, Trung tâm Nghiên cứu triển khai, Khu Cơng nghệ cao TP Hồ Chí Minh 75 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 9.Trần Liên Hà (2010), “Nghiên cứu tổng hợp thu nhận peptide chức kìm hãm enzym chuyển angiotensine từ protein đậu tương”, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 10 Trần Thị Lan Hương (2013), “Nghiên cứu biểu protein VP28 tái tổ hợp vi khuẩn E coli sử dụng Lactose làm chất cảm ứng”, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội II Tài liệu tham khảo tiếng Anh 11 A Quirós, B Hernández-Ledesma (2005), “Angiotensin-Converting EnzymeInhibitory Activity of Peptides Derived from Caprine Kefir”, J Dairy Sci, 88, 3480-3487 12 Alcaide-Hidalgo JM, Pueyo E, Polo MC, Martínez-Rodríguez AJ (2007), “Bioactive peptides released from Saccharomyces cerevisiae under accelerated autolysis in a wine model system”, J Food Sci, 72(7), 276-9 13 Alexandre Panchaud, Michael Affolter and Martin Kussmann (2012), “Mass spectrometry for nutritional peptidomics: How to analyze food bioactives and their health effects”, SciVerse Scienceirect, 75, 3546-3559 14 Brij P S., Shilpa V., Subrota (2014), “Functional significance of bioactive peptides derived from soybean”, Peptide, 54, 171-179 15 GauravPant, AnilPrakash, J.V.P.Pavani, SayantanBera, G.V.N.S.Deviram, AjayKumar, MitaliPanchpuri, Ravi GyanaPrasuna (2018), “Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis”, pages 5055, published online apr 76 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 16 Hamid Mukhtar, Ikram-ul-Haq (2012), “Concomitant production of two proteases and alpha-amylase by a novel strain of Bacillus subtilis in a microprocessor controlled bioreactor” Jul-Sep; 43(3): 1072–1079 17 I.M.P.L.V.O Ferreira, O Pinhoa, E Vieiraa, J.G Tavarelaa (2010), “Brewer's Saccharomyces yeast biomass: characteristics and potential applications”, Trends in Food Science & Technology, 21(2), 77–84 18 Jessika G dos S Aguilar1 (2019), ALKALINE PROTEASE PRODUCTION BY Bacillus licheniformis LBA 46 IN A BENCH REACTOR: EFFECT OF TEMPERATURE AND AGITATION 19 Klancnik A1, Piskernik S, Jersek B, Mozina SS (2010), “Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts”, J Microbiol Methods, 81(2), 121-126 20 Kunamneni Adinarayana, poluri ellaiah (2003), “Purification and partical characterization of thermostable serine alkaline protease from a newly isolated Bacillus subtilis PE-11”; 4(4): 440–448 21 Mala, B.R., Aparna M.T., Mohini, S.G.,Vasanti, V D (1998), “Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases”, Microbiol Mol Biol Rev, 62(3), 597–635 22 Man-Jin In, Dong Chung Kim, Hee Jeong Chae (2005), “Downstream process for the production of yeast extract using brewer's yeast cells”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10, 85-90 23 Oksana G Travkova, Helmuth Moehwald, Gerald Brezesinski (2017), “The interaction of antimicrobial peptides with membranes”, Advances in Colloid and Interface Science, 247, 521-532 77 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 24 Raikos V., Dassios T (2014), “Health-promoting properties of bioactive peptides derived from milk proteins in infant food”, Dairy Sci Technol, 94, 91-101 25 Rawlings, Fraser R.Morton, chai y.kok and alan J Barrett (2008), “The peptide database” 26 San-Miguel T1, Pérez-Bermúdez P, Gavidia I (2013), “Production of soluble eukaryotic recombinant proteins in E coli is favoured in early log-phase cultures induced at low temperature”;2(1) 27 Walther B, Sieber R (2011), “”Bioactive proteins and peptides in food”, Int J Vitam Nutro Res, 81 (2-3), 181-102 28 Wiegand I1, Hilpert K, Hancock RE (2008), “Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances”, Nat Protoc;3(2), 163-75 29 Winograd E1, Pulido MA, Wasserman M (1993), “Production of DNArecombinant polypeptides by tac-inducible vectors using micromolar concentrations of IPTG”, Biotechniques;14(6):886, 890 30 Yamada EA, Sgarbieri VC (2005), “Yeast (Saccharomyces cerevisiae) protein concentrate: preparation, chemical composition, and nutritional and functional properties”, J Agric Food Chem, 53(10), 3931-6 Website 31 http://123doc.org/document/193213-buoc-dau-nghien-cuu-tan-dung-ba-men- bia-de-san-xuat-nuoc-cham-len-men.htm 78 ... tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính protease tái tổ hợp từ chủng Escherichia coli BL21 (DE3) khảo sát khả ứng dụng? ?? Nội dung bao gồm:  Nghiên cứu xác định điều... tốt nghiệp: “ Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính protease tái tổ hợp từ chủng Escherichia coli BL21 (DE3) khảo sát khả ứng dụng ” thực hướng dẫn khoa học GS TS Đặng Thị Thu PGS.TS Trương Quốc... ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính Protease tái tổ hợp từ chủng Escherichia coli BL21( DE3) khảo sát khả ứng dụng PHẠM THỊ HẰNG NGA Ngành : Công nghệ