Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp và kháng khuẩn bằng phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men bia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LÂM THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN PEPTIDE CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG TĂNG HUYẾT ÁP VÀ KHÁNG KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN PROTEASE TỪ BÃ NẤM MEN BIA Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS ĐẶNG THỊ THU Hà Nội – Năm 2015 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu, Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình trực tiếp hƣớng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trƣơng Quốc Phong - Trƣởng phòng Proteomics, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn Nghiên cứu sinh Phạm Thị Thu Hiền- Nghiên cứu viên Trung tâm Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Hà Nội hỗ trợ, tạo điều kiện cho thực luận văn Nhân dịp xin chân thành cảm ơn Thầy, Cơ Viện nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm viện Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ tơi q trình thí nghiệm Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Học Viên Lâm Thị Hải Yến Lâm Thị Hải Yến - 2013B i Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: luận văn tốt nghiệp: “Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp kháng khuẩn phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men bia” kết nghiên cứu nhánh thuộc nhóm nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu cơng nghệ thủy phân protein từ bã nấm men bia thu số peptide thấp phân tử có hoạt tính sinh học để ứng dụng làm thực phẩm chức năng”, đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn khoa học GS TS Đặng Thị Thu trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Hiền giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên học tập làm việc Trung tâm Nghiên cứu Phát triển CNSH, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đƣợc đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo luận văn Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2015 Tác giả Lâm Thị Hải Yến Lâm Thị Hải Yến - 2013B ii Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACE Angiotensin I Converting Enzyme ACEI Angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors DPPH 1,1-diphenl-2-picrylhydrazyl ĐC Đối chứng FAPGG N-[3-(2-Furyl)acryloyl]- L phenylalanyl-glycyl-glycine HHL Hippuryl-Histidyl-Leucine IC50 Inhibitory concentration 50% LB LC-MS/MS Lysogeny broth Liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry OPA O-Phthaladehyde RASS The renin-angiotensin-aldosterone system RT-HPLC Reversed-phase High-performance liquid chromatography SDS –PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Lâm Thị Hải Yến - 2013B - iii Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Trang Hình 1.1 Cấu tạo peptide Hình 1.2 Biều đồ hoạt tính sinh học peptide quan tâm nghiên cứu Hình 1.3 Hệ thống Renin – angiotensin - aldosterone 10 Hình 1.4 : Minh họa chế kháng nấm peptide có hoạt tính sinh 13 học Hình 1.5 Sơ đồ thu nhận tinh ACEIPs từ dịch thủy phân 20 casein Hình 1.6 Đồ thị thể số lượng peptide đưa vào nghiên 22 cứu trung bình thập kỉ Hình 1.7 Hình dạng tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae 28 Hình 3.1 (A) Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến khả tạo 46 peptide sinh học (B) Điện di đồ sản phẩm thủy phân nồng độ E/S khác Hình 3.2 (A) Ảnh hưởng nồng độ chất tới khả tạo 47 peptide (B) Điện di đồ sản phẩm peptide điều kiện nồng độ chất khác Hình 3.3 (A) Ảnh hưởng pH đến khả tạo peptide.(B) Điện di 48 đồ sản phẩm thủy phân điểm pH khác Hình 3.4 (A) Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tạo peptide, (B) 49 Điện di đồ sản phẩm peptide điều kiện nhiệt độ khác Hình 3.5 (A) Ảnh hưởng thời gian khả tạo peptide Điện di 50 đồ sản phẩm peptide thời điểm thủy phân khác Hình 3.6 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu để thủy phân bã men bia Lâm Thị Hải Yến - 2013B 55 iv Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Hình 3.7 Sơ đồ mơ tả qui trình thu nhận peptide sinh học từ bã nấm 56 men bia Hình 3.8 Biểu đồ thể hoạt tính kìm hãm ACE peptide với 58 nồng độ khác Hình 3.9 Hình ảnh khuẩn lạc Salmolena Typhi sau 24h nuôi cấy so 61 với mẫu đối chứng khơng bổ sung dịch peptide Hình 3.10 Ảnh khuẩn lạc Listeria monocytogenes sau 24h nuôi cấy so 62 với mẫu đối chứng khơng bổ sung dịch peptide Hình 3.11 Phản ứng dịch peptide làm giảm màu thuốc thử 63 DPPH Lâm Thị Hải Yến - 2013B v Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1 Thành phần chất khô men bia 29 Bảng 1.2 Thành phần amino acid thiết yếu nấm men bia 29 Bảng 3.1 Kết lựa chọn enzym thủy phân 45 Bảng 3.2 Ma trận thực nghiệm Box-Benken ba yếu tố hàm lượng peptide 51 thu điều kiện thủy phân khác Bảng 3.3 Kết phân tích mơ hình phương sai mơ hình ưu phần 53 mềm DX7.1.5 Bảng 3.4 Kết đếm số lượng khuẩn lạc Lâm Thị Hải Yến - 2013B 60 vi Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH iv PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan peptide có hoạt tính sinh học .4 1.1.1 Khái niệm peptide có hoạt tính sinh học 1.1.2 Hoạt tính sinh học peptid 1.1.2.1 Hoạt tính kìm hãm ACE (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory) 1.1.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm virut 1.1.2.3 Peptide có hoạt tính chống oxy hóa .10 1.1.2.4 Peptide có hoạt tính chống ung thƣ 11 1.1.2.5 Các hoạt tính sinh học khác 12 1.1.3 Các nghiên cứu peptide sinh học từ bã nấm men bia 13 1.1.3.1 Xu hƣớng nghiên cứu, sản xuất sử dụng peptide có hoạt tính sinh học 17 1.1.4 Các phƣơng pháp tách, tinh peptide có hoạt tính sinh học 19 1.2 Tổng quan protease 21 1.2.1 Khái niệm .21 1.2.2 Giới thiệu số chế phẩm Protease thƣơng mại 21 1.3 Tổng quan bã nấm men bia 22 1.3.1 Giới thiệu nấm men Saccharomyces 22 1.3.2 Thành phần hóa học bã nấm men bia .23 1.3.3 Sản lƣợng bã nấm men bia trạng sử dụng Việt Nam 25 1.3.4 Một số ứng dụng bã nấm men bia giới Việt Nam 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1 Bã nấm men Saccharomyces cerevisiae 31 2.1.2 Hóa chất 31 2.1.3 Thiết bị 32 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 33 Lâm Thị Hải Yến - 2013B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 2.2.1 Thủy phân bã nấm men bia tinh peptide 33 2.2.2 Phƣơng pháp điện di gel Polyacrylamide (SDS- PAGE) 33 2.2.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng peptide tổng OPA 34 2.2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kìm hãm ACE 34 2.2.5 Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa DPPH 35 2.2.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 36 2.2.7 Tối ƣu hóa trình thủy phân bã nấm men bia theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ) .36 3.1 Kết nghiên cứu lựa chọn enzyme thủy phân 38 3.2 Khảo sát nồng độ enzym 39 3.3 Ảnh ƣởng nồng độ chất tới trình thuỷ phân 39 3.4 Khảo sát ảnh hƣởng pH đến trình thủy phân 40 3.5 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình thủy phân 41 3.6 Ảnh hƣởng thời gian tới trình thủy phân bã nấm men bia 42 3.7 Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân bã nấm men bia theo phƣơng pháp quy hoạch bậc Box-Behnken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 43 3.8 Xây dựng quy trình thủy phân giới hạn bã nấm men bia protease thu peptide có hoạt tính sinh học 48 3.9 Nghiên cứu hoạt tính kìm hãm ACE ( chống tăng huyết áp) .50 3.10 Khảo sát hoạt tính ức chế với vi khuẩn Salmolena Typhi Listeria monocytogenes 52 3.11 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa dịch peptide 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Lâm Thị Hải Yến - 2013B Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Peptide có hoạt tính sinh học (Bioactive peptide) peptide giá trị dinh dƣỡng cịn có khả tác động tới chức sinh lý thể, giúp tăng cƣờng nâng cao sức khỏe ngƣời nhƣ khả chống oxi hóa, kháng vi sinh vật, tác dụng kìm hãm enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE) chống tăng huyết áp [26], ngồi cịn có khả điều hịa miễn dịch, chống đơng máu [31] Peptide có hoạt tính sinh học tách chiết từ nguồn tự nhiên (động vật, thực vật), lên men vi sinh vật, thủy phân giới hạn protein từ nguồn khác protease Các nghiên cứu peptide có hoạt tính sinh học nƣớc ta dừng lại quy mơ phịng thí nghiệm khai thác chủ yếu đối tƣợng nguyên liệu từ sữa, đậu tƣơng Trong nguồn bã men bia nƣớc ta dào, chứa hàm lƣợng protein cao, giàu vitamin, đặc biệt vitamin nhóm B khống chất, trở thành nguồn nguyên liệu tốt cho trình sản xuất peptide Thủy phân giới hạn bã nấm men bia tạo peptide có hoạt tính sinh học bổ sung vào thực phẩm chức tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu bã thải, tạo sản phẩm có chất lƣợng cao mà cịn giải đƣợc vấn đề nhiễm môi trƣờng gây lƣợng lớn bã men bia thải hàng năm Chính vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp kháng khuẩn phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men bia” Nội dung bao gồm: - Nghiên cứu xác định điều kiện thủy phân thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzym, nồng độ chất) để thu peptide thấp phân tử - Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân - Xây dựng quy trình thu peptide có hoạt tính sinh học từ bã nấm men bia - Khảo sát số hoạt tính sinh học: chống tăng huyết áp, kháng khuẩn chống oxi hóa peptide sinh học từ bã nấm men bia Lâm Thị Hải Yến - 2013B Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Hình 3.10 Hình ảnh khuẩn lạc Salmolena Typhi sau 24h nuôi cấy so với mẫu đối chứng khơng bổ sung dịch peptide Từ hình ảnh kết bảng 3.3 cho thấy nhìn chung với chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trƣờng có bổ sung peptide giảm số lƣợng khuẩn lạc sau 24h nuôi Với chủng vi khuẩn Salmolena Typhi, lƣợng dịch bổ sung 10 µg/ml 20 µg/ml peptide vào môi trƣờng nuôi cấy làm giảm số lƣợng khuẩn lạc từ 46, 03- 71,18 % Đặc biệt bổ sung 30 µg/ml vào mơi trƣờng ni cấy, số lƣợng vi khuẩn giảm mạnh tới 99,99% Từ kết luận với 30 µg/ml peptide bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy ức chế phát triển vi khuẩn Salmolena Typhi Lâm Thị Hải Yến - 2013B 54 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Hình 3.11 Ảnh khuẩn lạc Listeria monocytogenes sau 24h nuôi cấy so với mẫu đối chứng không bổ sung dịch peptide Đối với vi khuẩn Listeria monocytogenes, bổ sung 10 µg/ml; 20 µg/ml; có làm giảm số lƣợng vi khuẩn mọc sau 24h với tỷ lệ từ 31.80 đến 59.65%, nhiên với 30 µg/ml dịch peptide làm giảm số lƣợng vi khuẩn mạnh 86.61 % nhƣng chƣa làm giảm hoàn toàn Đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus số lƣợng khuẩn lạc có giảm sau 24h ni cấy với nồng độ peptide bổ sung 10; 20; 30 µg/ml peptide tƣơng ứng với tỷ lệ 26.40% ; 58.87% ;75.88% Ở nồng độ 30 µg/ml peptide bổ sung số lƣợng vi khuẩn nuôi cấy giảm mạnh Lâm Thị Hải Yến - 2013B 55 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Từ kết trên, đƣa kết luận peptide thấp phân tử thủy phân từ bã nấm men bia có hoạt tính ức chế phát triển chủng vi khuẩn gây hại Salmolena Typhi , Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus 3.11 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa dịch peptide Hoạt tính chống oxy hóa dịch peptide đƣợc xác định thông qua làm giảm màu thuốc thử DPPH, đƣợc xác định phép đo độ hấp thụ bƣớc sóng 517 nm máy quang phổ Dung dịch DPPH đƣợc chuẩn bị với nồng độ 0,5 mM Ethanol (EtOH) CoQ10 đƣợc pha Ethanol 100% cho nồng độ cuối đạt đƣợc dãy nồng độ 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05, 0,025 mM Thực phản ứng với gốc tự DPPH thời gian 30 phút 370C, đọc mật độ hấp thụ DPPH chƣa phản ứng máy đọc Biotek bƣớc sóng 517 nm Kết cho thấy với nồng độ peptide cao khả làm giảm màu thuốc thử lớn, Hình 3.11 Phản ứng dịch peptide làm giảm màu thuốc thử DPPH với nồng độ khác (A:10µg/ml peptide, B: 20 µg/ml, C: 40 µg/ml, D: 60 µg/ml, E: 80 µg/ml) Từ kết hình ảnh 3.11, chúng tơi nhận thấy peptide đƣợc thủy phân từ bã nấm men bia có khả chống oxi hóa, nồng độ 10 µg/ml hoạt tính chƣa thể rõ, hoạt tính chống oxi hóa tăng dần nồng độ tăng dần làm màu thuốc thử chuyển dần sang màu vàng Với nồng độ 80 µg/ml, thuốc thử DPPH bị đổi màu mạnh Lâm Thị Hải Yến - 2013B 56 Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Hình 3.12 Khả chống oxi hóa peptide Hệ số chống oxi hóa đƣợc xác định cách bổ sung dịch peptide với nồng độ khác từ 10- 80 µg/ml vào dung dịch DPPH 0.5M, sau ủ 37oC 30 phút, đo lƣợng DPPH lại xác định hệ số EC50 62.4 µg/ml Lâm Thị Hải Yến - 2013B 57 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN  Điều kiện tối ƣu thủy phân giới hạn bã nấm men bia chế phẩm protease Neutrase với nồng độ % (290 U), nồng độ bã men bia 25%, nhiệt độ 50oC pH 6.5 với thời gian thủy phân 16h  Đã xác định số hoạt tính sinh học peptide từ bã men bia: - Có hoạt tính kìm hãm ACE với nồng độ từ 10-50 µg/ml ức chế từ 65.29% đến 72.85 % so với đối chứng captoril Giá trị IC50: 72.5 µg/ml - Có khả ức chế số vi khuẩn gây hại nồng độ 30 µg/ml: Với Salmolena Typhi 99.99 %, cịn với Listeria monocytogenes ức chế 86.61 % Với Staphylococcus aureus ức chế 75.88 % - Có hoạt tính chống oxi hóa với giá trị EC50: 62.4 µg/ml KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học khác dịch thủy phân bã nấm men bia nhƣ hoạt tính chống ung thƣ, khả tăng cƣờng sức đề kháng… - Nghiên cứu ứng dụng bổ sung vào thực phẩm chức năng, thuốc chống tăng huyết áp… Lâm Thị Hải Yến - 2013B 58 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tham khảo tiếng Việt Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trịnh Vinh Hiển, Bùi Thị Thu Huyền, 2008 Chế biến nấm men từ phế phụ phẩm sản xuất bia làm ngun liệu thức ăn chăn ni, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, 16, 64 – 67 Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thƣ, 2009 Stress oxi hóa chất chống oxi hóa tự nhiên, Tạp chí Khoa học phát triển 2009: Tập 7, số5: tr.667-677 Trần Bích Lam, 2012 Tổng quan peptide có hoạt tính sinh học, Đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm 2003 Công nghệ enzym NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội Hồ Xƣởng, 1996 Công nghệ sản xuất bia Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Trần Liên Hà, 2010 Nghiên cứu tổng hợp thu nhận peptide chức kìm hãm enzyme chuyển angiotensine từ protein đậu tương, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội II Tài liệu tham khảo tiếng Anh Alcaide-Hidalgo JM, Pueyo E, Polo MC, Martínez-Rodríguez AJ, 2007 Bioactive peptides released from Saccharomyces cerevisiae under accelerated autolysis in a wine model system J Food Sci 72(7): pp 276-9 A Quiroùs, B Hernaùndez-Ledesma, 2005 Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitory Activity of Peptides Derived from Caprine Kefir J Dairy Sci, 88, pp.3480-3487 Lâm Thị Hải Yến - 2013B 59 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Anja Klančnik,Saša Piskernik, Barbara Jeršek, Sonja Smole Možina, 2010 Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts J Microbiol Methods 2010 May;81(2):pp.121-6 10 Bachere, E , D., B., P., 2000.Penaeidins, antimicrobial peptides of shrimp: a comparison with other effectors of innate immunity Aquaculture 191(2000):pp.71– 88 11 Brij P S., Shilpa V., Subrota H., 2014 Functional significance of bioactive peptides derived from soybean,Peptide 54, pp171-179 12 Bulet,P., Hetru, C., Dimarcq, J.L., Hoffmann, D.,1999 Antimicrobial peptides in insects; structure and function.Dev Comp Immunol.Jun-Jul;23(4-5):pp.329-44 13 Chae HJ, Joo H, In MJ., (2001), Utilization of brewer's yeast cells for the production of food-grade yeast extract Part 1: Effects of different enzymatic treatments on solid and protein recovery and flavor characteristics Bioresource technology, 76, pp.253-258 14 Charajit Kaur and Harish C.Kapoor, 2001 Antioxidants in fruits and vegetables - the millennium's health International Journal of Food Science and Technology 2001, 36, pp.703-725 15 Chibuike C Udenigwe, 2014 Bioinformatics approaches, prospects and challenges of food bioactive peptide research Trends in Food Science & Technology,36: pp 137–143 16 Diane F Birt, Suzanne Hendrich, Weiqun Wang, 2001 Dietary agents in cancer prevention: flavonoids and isoflavonoids Pharmacology & Therapeutics, 90, pp.157-177 17 Eunice A Yamada ,Valdemiro C Sgarbieri *, 2005.Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Protein Concentrate:  Lâm Thị Hải Yến - 2013B Preparation, Chemical Composition, and 60 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Nutritional and Functional Properties J Agric Food Chem , 53 (10), pp 3931– 3936 18 Eunice C Y, Li-Chan, 2015 Bioactive peptides and protein hydrolysates: research trends and challenges for application as nutraceuticals and functional food ingredients Food Science 02/2015; 1:28-37 19 Frank C.C., Harold E S., David H.P., George L.C., 1982 Spectrophotometric Assay Using o-Phthaldialdehyde for Determination of Proteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins, Journal of Dairy Science, 66, pp.6 20 Hasan Tanguler, Huseyin Erten, 2008 Utilisation of spent brewer's yeast for yeast extract production by autolysis: The effect of temperature Food and bioproducts processing, 86, pp.317-321 21 Hazem M.M Hassan, 2011 Antioxidant and Immunostimulanting Activities of Yeast ( Saccharomyces cerevisiae) Autolysates World applied Sciences Journal, 15(8), pp.1110-1119 22 I.M.P.L.V.O Ferreira, O Pinhoa, E Vieiraa, J.G Tavarelaa, 2010 Brewer's Saccharomyces yeast biomass: characteristics and potential applications Trends in Food Science & Technology, 21(2), pp: 77–84 23 Jorge,A Masso-Silva, Gill Diamond, 2014 Antimicrobial Peptides from Fish Pharmaceuticals 7(3): pp.265-310 24 Korhonen H, Pihlanto A, 2006 Bioactive peptide: production and functionality Int Dairy J, 16(9), pp.945-60 25 Klancnik A1, Piskernik S, Jersek B, Mozina SS 2010 Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts, J Microbiol Methods 2010 May;81(2):pp 121-126 Lâm Thị Hải Yến - 2013B 61 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 26 Mala, B.R., Aparna M.T., Mohini, S.G.,Vasanti, V D, 1998 Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases Microbiol Mol Biol Rev.62(3): pp.597–635 27 Man-Jin In, Dong Chung Kim, Hee Jeong Chae, 2005 Downstream process for the production of yeast extract using brewer's yeast cells, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10, pp.85-90 28 Nagpal R., Behare P., Rana R., Kumar A., Kumar M., Arora S., Morotta F., Jain S., Yadav H., 2011.Bioactive peptides derived from milk proteins and their health beneficial potentials Food Funct, 2(1), pp.18-27 29 Nielsen P.M., Petersen D and Dambmann C., 2006 Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis, Journal of Food Science, 66, pp.5 30 Nora Khaldi, 2012 Bioinformatics approaches for identifying new therapeutic bioactive peptides in food Functional Foods in Health and Disease, 2(10), pp.325338 31 Paula.J.P.E., Nilda.F.F.S., Jane.S.R.C., Nélio J.A., Renato S.C and Eber.A.A.M., 2012 Bioactive Peptides: Synthesis, Properties, and Applications in the Packaging and Preservation of Food, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 11 32 Raikos V., Dassios T., 2014 Health-promoting properties of bioactive peptides derived from milk proteins in infant food, Dairy Sci Technol, 94, pp.91-101 33 Reddy KVR, Yedery RD, Aranha C, 2004 Antimicrobial peptides: premises and promise Ins J Antimicrob Agents, 24 (6),pp.536-47 33 Saito Koichiro et al, 2003 Antioxidative Properties of Tripeptide Libraries Prepared by the Combinatorial Chemistry Journal of Agricultural and Food Chemistry, 21, pp.3668-3674 Lâm Thị Hải Yến - 2013B 62 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 34 Wiegand I1, Hilpert K, Hancock RE, 2008 Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances Nat Protoc 2008;3(2):pp.163-75 35 Yamada EA, Sgarbieri VC, 2005 Yeast (Saccharomyces cerevisiae) protein concentrate: preparation, chemical composition, and nutritional and functional properties J Agric Food Chem 2005 May 18;53(10):3931-6 Website: 36 http://doan.edu.vn/do-an/luan-van-nghien-cuu-tan-dung-ba-men-bia-de-che- bien-men-chiet-xuat-dung-lam-thanh-phan-bo-sung-vao-moi-truong-nuoi-cay24108/ 37 http://123doc.org/document/193213-buoc-dau-nghien-cuu-tan-dung-ba-men- bia-de-san-xuat-nuoc-cham-len-men.htm 38 http://vast.ac.vn/1.0/index.php?option=com_detai&view=detai&id=494:khao- sat,-xac-dinh-mot-so-peptide-co-hoat-tinh-sinh-duoc-quy-tu-sinh-vat-bien-dac-huu(oc-coi,-hai-mien)-bang-cac-ky-thuat-proteomics.&Itemid=54&lang=vi 39 http://baodatviet.vn/kinh-te/thi-truong/viet-nam-vao-top-5-nuoc-co-tieu-thu-bianhieu-nhat-3268299/ 40 http://kinhdoanh.vnexpress.net/tin-tuc/quoc-te/viet-nam-tro-thanh-diem-sang- tieu-thu-bia-trong-khu-vuc-3240206.html 41 http://www.sggp.org.vn/khoahoccongnghe/2007/12/137060/ 42.http://www.novozymes.com/en/solutions/biopharma/Brochures/Documents/2014 -12715-01_Biocatalysis-Product-Sheet-Protease-3.pdf Lâm Thị Hải Yến - 2013B 63 Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Phụ lục Phụ lục 1: Thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme Bước Mẫu thí nghiệm Mẫu kiểm chứng ml dung dịch chất casein 1% ml dịch enzim 2 ml dịch enzim ml TCA 0,3 M Trộn Để phản ứng 10 phút nhiệt độ thích hợp Dừng phản ứng ml TCA 0,3M ml dung dịch chất casein 1% Khuấy trộn nhanh để yên hỗn hợp 20 phút Lọc, thu đƣợc dịch lọc thí nghiệm Lọc, thu đƣợc dịch lọc kiểm chứng Bước Mẫu thí nghiệm Mẫu kiểm chứng 0,3 ml dịch lọc thí nghiệm 0,3 ml dịch lọc kiểm chứng 1,5 ml 0,5M Na2CO3 Trộn đều, để 10 phút Thêm 0,3 ml dung dịch Folin, trộn Để 20 phút Đo A( =660nm) đối ngược với mẫu kiểm chứng Phụ lục : Hóa chất Dung dịch OPA - 8mg OPA hòa tan 0,2ml Methanol - 0,5ml SDS 20% - 20µl β-mercaptoethanol Lâm Thị Hải Yến - 2013B 64 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học - Định mức đến 10ml nƣớc cất Phụ lục 3: Dựng đƣờng chuẩn Peptone - 0,1g peptone + 10ml H2O -> dung dịch Peptone 10mg/ml - Từ dung dịch Peptone 10mg/ml tiến hành pha loãng nồng độ 2, 4, 6,8,10mg/ml theo bảng dƣới Dựng đường chuẩn Peptone Nồng độ Peptone(mg/ml) 10 Dung dịch peptone 10 20 30 40 50 H2O (µl) 40 30 20 10 Dung dịch OPA (µl) 200 200 200 200 200 10mg/ml (µl) Lắc phút đo OD bƣớc sóng 340nm Lâm Thị Hải Yến - 2013B 65 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Phụ lục 3: Hóa chất phƣơng pháp Phân tích Peptide điện di SDS-PAGE Chuẩn bị đệm mẫu: Sử dụng nƣớc khử ion, 0.5M Tris pH 6.8, glycerol, 20% SDS, Bromophenol Blue, β-mercaptoethanol Thành phần gel phân tách (18%): H2O, Tris-HCl (pH 8.8), acrylamide 30%, SDS 10%, APS 10%, Temed Thành phần Gel cô (4%): H2O, Tris-HCl (pH6.8), acrylamide 30%, SDS 10%, APS 10%, Temed Dung dịch nhuộm gel (DYE) gồm: Coomassie brilliant blue G250, methanol, acetic acid Dung dịch tẩy m àu gel: Methanol, acetic acid, H2O Phụ lục Đồ thị đường chuẩn DPPH (mM) DPPH (mM) OD 0.0313 0.0625 0.032 Lâm Thị Hải Yến - 2013B 0.163 0.125 0.25 0.5 0.28 0.564 0.951 1.769 66 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Phụ lục Nồng độ peptide từ bã nấm men bia trung hòa gốc tự DPPH Nồng độ phần trăm trung hịa gốc tự DPPH (%) Tên mẫu Peptide có hoạt tính sinh học µg/ml %DPPH cịn lại 100 10 20 40 60 80 EC 50 (mM) 100 62.5 µg/ml 89.3 77.1 65.72 55.4 40.21 12.98 Phụ lục 7: Kết đo OD hoạt tính ức chế ACE peptide sau thủy phân Nồng độ peptide A10 A30 Delta A 10 0.416 0.293 0.123 20 0.457 0.321 30 0.517 40 50 Ac 10 Ac30 Delta Ac %ACE 0.453 72.85 0.136 0.453 69.98 0.359 0.158 0.453 65.12 0.597 0.421 0.176 0.453 61.15 0.598 0.4 0.198 0.453 56.29 Lâm Thị Hải Yến - 2013B 0.769 0.316 67 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Phụ lục 8: Thành phần môi trƣờng LB Thành phần Hàm lượng Trypton 10 g NaCl 10 g Cao nấm men 5g Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml Agar 9g Chỉnh pH 7.0 Hấp khử trùng 121oC 30 phút Bảo quản tủ 4oC Lâm Thị Hải Yến - 2013B 68 ... nghiệp: ? ?Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp kháng khuẩn phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men bia? ?? kết nghiên cứu nhánh thu? ??c nhóm nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu cơng... bã men bia thải hàng năm Chính vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp kháng khuẩn phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men. .. dựng quy trình thu peptide có hoạt tính sinh học từ bã nấm men bia - Khảo sát số hoạt tính sinh học: chống tăng huyết áp, kháng khuẩn chống oxi hóa peptide sinh học từ bã nấm men bia Lâm Thị Hải