Bước đầu nghiên cứu điều kiện sản xuất và xác định khả năng kháng salmonella enteritidis của muối chitosan lactate

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN SẢN XUẤT VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG Salmonella enteritidis CỦA MUỐI CHITOSAN LACTATE Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Thị Đan Phượng PGS TS Trang Sĩ Trung Sinh viên thực : Lê Ti Gôn Mã số sinh viên : 56136690 Khánh Hịa, tháng 7/2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan kết đề tài: “Bước đầu nghiên cứu điều kiện sản xuất xác định khả kháng Salmonella enteritidis muối chitosan lactate” cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, tháng năm 2019 Lê Ti Gôn i LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu quý thầy cô trường Đại học Nha Trang giúp đỡ tận tình truyền đạt cho kiến thức năm học qua Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy PGS TS Trang Sĩ Trung người định hướng truyền đạt kinh nghiệm cho tơi, giáo viên hướng dẫn thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô ThS Phạm Thị Đan Phượng, thầy ThS Nguyễn Công Minh giúp đỡ hướng dẫn tơi nhiều q trình thực đề tài nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô cán quản lý Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Thiết bị cao tạo điều kiện thuận lợi hỗ trợ cho tơi thực tập phịng thí nghiệm Xin gửi lời cảm ơn đến bạn nhóm nghiên cứu “Sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu tôm” PGS TS Trang Sĩ Trung chủ trì Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ bạn bè động viên suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, tháng năm 2019 Lê Ti Gôn ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC BẢNG vii LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ DẪN XUẤT CỦA NĨ 1.1.1 Tìm hiểu chitosan 1.1.2 Tìm hiểu muối chitosan .8 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƢỚC LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 12 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nƣớc liên quan đến đề tài .12 1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc liên quan đến đề tài .14 1.3 TỔNG QUAN VỀ SALMONELLA ENTERITIDIS 15 1.3.1 Phân loại 16 1.3.2 Đặc tính nơi sinh sống 16 1.3.3 Bệnh triệu chứng 17 1.3.4 Cách phòng vệ vật chủ 19 1.3.5 Chẩn đoán nhiễm Salmonella 19 1.3.6 Kiểm soát Salmonella .20 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.1 Chitosan .22 2.1.2 Chủng vi khuẩn Salmonella enteritidis .24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .25 2.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 25 2.2.2 Bố trí thí nghiệm chi tiết 27 2.2.3 Các phƣơng pháp phân tích 36 2.2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 37 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO U N .38 3.1 Tính chất chitosan nguyên liệu 38 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ chitosan/dung môi phản ứng (lactic/ethanol) đến độ nhớt, độ tan muối chitosan lactate 38 iii 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian phản ứng đến độ nhớt, độ tan muối chitosan lactate 41 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng kích thƣớc chitosan đến độ nhớt, độ tan muối chitosan lactate 44 3.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng chế độ sấy đến độ tan, độ nhớt muối chitosan lactate 46 3.6 Đề xuất quy trình điều chế muối chitosan lactate 49 3.7 Đánh giá khả kháng Salmonella enteritidis muối chitosan lactate 51 KẾT LU N VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ ỤC .60 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Mw: Khối lượng phân tử DD: Độ deacetyl MMWC: Chitosan khối lượng phân tử trung bình (Medium molecular weight chitosan) TSB: Môi trường Tryptic Soy Broth TSA: Môi trường Tryptic Soy Agar v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học chitin (a), chitosan (b) Hình 1.2 Cấu tạo chitosan (a) muối chitosan (b) (Qing cộng sự, 2014) Hình 1.3 Cơ chế tạo muối chitosan 10 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan 22 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 25 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ chitosan so với dung môi phản ứng đến độ tan, độ nhớt muối chitosan lactate 27 Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian phản ứng đến độ tan, độ nhớt muối chitosan lactate 29 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng kích thước chitosan đến độ tan, độ nhớt muối chitosan lactate .31 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng chế độ sấy đến chất lượng muối chitosan lactate 32 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả kháng Salmonella enteritidis muối chitosan lactate .34 Hình 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ chitosan/dung môi đến độ nhớt, độ tan muối chitosan lactate 39 Hình 3.2 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian phản ứng đến độ tan, độ nhớt muối chitosan lactate .42 Hình 3.3 Đồ thị thể sử ảnh hưởng kích thước chitosan đến độ tan, độ nhớt muối chitosan lactate 45 Hình 3.4 Đồ thị thể ảnh hưởng chế độ sấy đến độ tan, độ nhớt muối chitosan lactate .47 Hình 3.5 Mẫu muối với phương pháp sấy khác .48 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình điều chế muối chitosan lactate .49 Hình 3.7 Sản phẩm muối chitosan lactate 50 Hình 3.8 Khả kháng Salmonella enteritidis chitosan lactate 24h 51 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các dung dịch acid thường sử dụng để hòa tan chitosan Bảng 1.2 Một số ứng dụng chitosan (Trung cộng sự, 2018) .8 Bảng 3.1 Tính chất chitosan .38 Bảng 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ chitosan so với dung môi phản ứng lactic/cồn đến pH dung dịch muối chitosan lactate 41 Bảng 3.3 Mối tương quan thời gian phản ứng với pH mẫu muối 44 Bảng 3.4 Độ ẩm mẫu muối với chế độ sấy khác .48 Bảng Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm muối chitosan lactate .50 vii LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Chitosan sản phẩm trình deacetyl hóa chitin, có chất polyme sinh học không độc chứa đơn vị D-glucosamine N-acetyl-glucosamine liên kết với liên kết β-1,4-glycoside, có khả kháng khuẩn, kháng nấm chống oxy hóa ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực bao gồm thực phẩm, nông nghiệp, môi trường, y học,…(Trang Sĩ Trung cộng sự, 2018 Rinaudo, 2006) Chitosan thường hòa tan trước ứng dụng, nhiên chitosan tan số dung dịch acid yếu (acid hữu acid acetic, acid formic, acid lactic,…) acid lỗng có pH < (như acid HCl 1%) Do hạn chế khả ứng dụng chitosan Để cải thiện khả hòa tan cho chitosan đề tài thực nghiên cứu bước đầu để sản xuất muối chitosan lactate, có khả hịa tan nước Chitosan hịa tan nước tồn dạng muối chitosan chitosan oligosaccharide Chitosan hịa tan nước có ưu điểm dễ sử dụng giữ hoạt tính sinh học chitosan ban đầu (Yan cộng sự, 2007) Hơn muối chitosan hịa tan có tính chất tương tự hịa tan chitosan dung dịch acid tương ứng Có nhiều loại muối chitosan (như chitosan sulphate, chitosan chloride, chitosan actate, chitosan ascorbate,…) nghiên cứu sản xuất đánh giá hoạt tính sinh học đặc biệt khả kháng khuẩn kháng nấm Như trình bày trên, chitosan tạo muối với nhiều loại acid khác Tuy nhiên nghiên cứu này, em lựa chọn nghiên cứu điều chế muối chitosan lactate mục đích ứng dụng chitosan lactate sản xuất thực phẩm Bản thân muối chitosan hữu khác ứng dụng thực phẩm, nhiên em lựa chọn nghiên cứu điều chế chitosan lactate acid lactic acid hữu phổ biến có nhiều ứng dụng Trong cơng nghiệp thực phẩm, acid lactic sử dụng chất phụ gia, hỗ trợ chế biến hay đóng vai trị chất bảo quản nhiều sản phẩm rượu, bia, nước giải khát, sản phẩm từ sữa, sản phẩm bánh ngọt, thịt sản phẩm từ thịt,… Hơn nữa, acid lactic ứng dụng nhiều y dược mỹ phẩm (Vijayakumar cộng sự, 2008) Bản thân acid lactic có mùi dễ chịu acid acetic (mùi chua mạnh) sản phẩm muối chitosan tạo giảm mùi Xét phương thức sử dụng, so với acid citric acid lactic thuận tiện sử dụng acid lactic dạng lỏng acid citric dạng rắn cần phải pha thành dạng lỏng trước sử dụng Với khả ứng dụng rộng rãi chitosan acid lactic liên kết để tạo thành muối chitosan lactate tạo sản phẩm có khả ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực đặc biệt cơng nghiệp thực phẩm Hiện giới có nhiều cơng trình nghiên cứu sản xuất muối chitosan lactate nhiên cơng trình nghiên cứu quy trình sản xuất tạo chitosan lactate tối ưu đánh giá khả kháng khuẩn cịn hạn chế Các cách thường dùng để sản xuất chitosan hòa tan chitosan acid lactic sau đem sấy phun cho chitosan ngâm cồn sau lọc tách cồn cho acid lactic vào phản ứng tạo muối với chitosan Trong nghiên cứu này, em tìm cách rút ngắn trình điều chế muối cách tạo dung môi phản ứng bao gồm acid lactic cồn theo tỷ lệ ¼ Sau đó, cho chitosan phản ứng với dung mơi để tạo muối chitosan lactate Việc làm rút ngắn thời gian phản ứng, hạn chế tổn thất có lọc tách cồn (chitosan cịn lại giấy, vải lọc) So với việc hòa tan chitosan acid lactic đem sấy phun để tạo muối việc sản xuất muối chitosan lactate cách cho chitosan phản ứng với dung môi lactic/cồn đơn giản, dễ thực hiện, tiết kiệm chi phí sản xuất việc đầu tư máy sấy phun tốn nhiều chi phí đầu vào cho doanh nghiệp Mục đích nghiên cứu tìm quy trình thích hợp để sản xuất chitosan lactate, nâng cao khả ứng dụng cho chitosan đánh giá khả kháng vi khuẩn Salmonella enteritidis Chính vậy, em thực đề tài: “Bước đầu nghiên cứu điều kiện sản xuất xác định khả kháng Salmonella enteritidis muối chitosan lactate” Mục tiêu nghiên cứu: Bước đầu nghiên cứu quy trình sản xuất đánh giá khả kháng Salmonella enteritidis muối chitosan lactate Nội dung nghiên cứu: DD (%) = Trong đó: m1: khối lượng N-acetyl-D-glucosamine 1ml dung dịch chitosan đượcsu y từ đường chuẩn bước sóng 203nm m2: khối lượng glucosamine 1ml dung dịch chitosan m2 = M - m1, với M khối lượng chitosan 1ml dung dịch chitosan M = (M1 * M3)/(M1 + M2) M1: khối lượng mẫu chitosan rắn lấy để phân tích (100 ± 10 mg) M2: khối lượng 20ml acid phosphoric 85% (34g) M3: khối lượng 1ml dung dịch chitosan dung dịch acid phosphoric đậm đặc Phƣơng pháp xác định protein phƣơng pháp Biuret  Pha thuốc thử Biuret: Hòa tan 1,5g copper sunfat (CuSO4) 6,0g sodium potassium tatrate (KNaC4H4O6.4H2O) 500ml nước cất, khuấy cho vào thêm 300ml NaOH 10% Dung dịch khuấy trộn làm đầy lên đến 1000ml nước cất  Dựng đƣờng chuẩn: Chuẩn bị ống nghiệm sạch, đánh số từ đến sau cho dung dịch hóa chất vào ống nghiệm với thể tích thức tự bảng: Bảng P 1.1 Dựng đường chuẩn phương pháp Biuret Ống nghiệm Dung dịch hóa chất BSA chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 Nước cất (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 62 Hàm lượng BSA (mg/ml) 10 Sau cho đầy đủ hóa chất, ủ ống nghiệm nhiệt độ phòng 30 phút Sau ủ, dung dịch ống nghiệm đo mật độ quang học bước sóng 570nm để đọc giá trị OD570 (sử dụng ống làm mẫu blank)  Kết xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Biuret Bảng P 1.2 Kết OD chạy đường chuẩn Biuret Ống nghiệm Hàm lượng BSA (mg/ml) Giá trị OD570 0 0,104 0,218 0,332 0,427 10 0,532  Phương trình đường chuẩn  Cơng thức tính hàm lượng protein 63 Hàm lượng protein (%) Trong : V: Tổng thể tích dịch lọc (ml) C: Hàm lượng protein ml dịch lọc (mg/ml) C xác định theo cơng thức sau : Từ phương trình đường chuẩn ta có : C = -0.051 +18.756A A độ hấp thụ quang học bước sóng 570nm m : khối lượng mẫu ban đầu (g) w : hàm lượng mẫu (%) 1000 : hệ số chuyển đổi từ đơn vị mg sang g (mg/g) Phƣơng pháp xác định độ tan muối chitosan lactate Giấy lọc sấy không đổi 105°C, cân xác định khối lượng W1 Cân 1g chitosan muối chitosan lactate (tính theo hàm lượng chất khơ tuyệt đối) đem hịa tan dung mơi tương ứng để 24h, sau lọc qua giấy lọc Đem sấy giấy lọc phần không tan 105oC/24h, cân xác định khối lượng W2 Phần trăm chitosan/muối chitosan lactate không tan tính theo cơng thức: % 𝑘ℎơ𝑛𝑔 𝑡𝑎𝑛 = *100% = (W2 – W1)* 100% Từ đó, tính độ tan chitosan chitosan lactate là: Độ tan (%) = 100%−% 𝑘ℎô𝑛𝑔 𝑡𝑎𝑛 Phƣơng pháp xác định pH muối chitosan lactate Cân 1g chitosan lactate (tính theo hàm lượng chất khơ tuyệt đối) hịa tan 100ml nước cất ta dung dịch chitosan lactate 1%, đo pH dung dịch máy pH Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, trường Đại học Nha Trang 64 Phụ lục Kết thí nghiệm Bảng PL1 Ảnh hƣởng tỷ lệ chitosan/dung môi phản ứng (lactic/cồn) đến độ tan, độ nhớt, pH muối chitosan lactate Tỷ lệ chitosan/acid 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 Độ nhớt 102,5A ± 4,33 180,83B ± 3,82 152,92C ± 4,73 130D ± 2,5 115E ± 2,5 Độ tan 70,17a ± 1,85 90,9b ± 1,71 95,2c ± 1,25 96c ± 1,59 98,1c ± 1,32 pH 5,06 ± 0,05 4,83bb ± 0,03 4,54cc ± 0,09 4,32dd ± 0,04 4ee ± 0,05 aa *Các giá trị bảng có ký tự giống khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p