Nghiên cứu tách chiết và thu nhận exopolysaccharide sinh tổng hợp bởi lactobacillus fermentum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI *** LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 8420201 TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP BỞI LACTOBACILLUS FERMENTUM HỌC VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN NGỌC BẢO NIÊN KHOÁ: 2019-2021 HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ PHƢƠNG KHANH Hà Nội, 03/2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Bảo i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới giảng viên cao học Khoa Công nghệ Sinh học – Trƣờng Đại học Mở Hà Nội, ngƣời bền bỉ truyền đạt cho nhiều kinh nghiệm, kiến thức, kỹ quý báu đa dạng suốt khố học Tơi muốn dành lời cảm ơn đặc biệt tới PGS.TS Tạ Thị Thu Thuỷ, Trƣởng Khoa Cơng nghệ sinh học Khơng có giúp đỡ, định hƣớng kịp thời chuyên môn Cô, khơng thể hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi trân trọng cảm ơn TS Đỗ Phƣơng Khanh ThS Nguyễn Thị Phƣơng Thảo nhiệt tình hƣớng dẫn tơi làm thí nghiệm, trình bày luận văn tập luyện thuyết trình Tơi khắc ghi lịng tất động viên, hỗ trợ thầm lặng đồng nghiệp, bạn bè gia đình suốt q trình tơi học thạc sĩ tìm tịi theo đuổi đề tài thú vị Hà Nội, tháng 03 năm 2022 Học viên Nguyễn Ngọc Bảo ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Lactobacilus fermentum 1.2 Expolysacharide từ vi khuẩn LAB 1.2.1 Cấu trúc EPS 1.2.2 Sinh tổng hợp exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 1.2.3 Sự chuyển hóa tạo nên loại đường trung gian 1.2.4 Sự hoạt hóa liên kết loại đường 1.3 Điều kiện lên men chủng lactobacillus fermentum 1.4 Tình tình hình nghiên cứu exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 10 1.4.1 Quá trình tách chiết tinh chế EPS 10 1.5 Ứng dụng EPS 11 1.5.1 Ứng dụng lĩnh vực y dược .11 1.5.2 Ứng dung EPS công nghệ thực phẩm 12 1.5.3 Ứng dụng tạo vật liệu nghiên cứu thí nghiệm sinh học 12 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu .14 2.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 14 2.2.1 Hóa chất 14 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối 16 2.3.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn phép đo mật độ quang 16 2.3.3 Phương pháp thu nhận tách EPS (Vivek K.B cộng sự, 2016) .16 2.3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ TCA lên khả loại bỏ protein dịch lên men .17 iii 2.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thể tích ethanol thời gian tủa lên q trình thu nhận EPS tủa từ dịch 17 2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng EPS phenol-sulfuric 18 2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 21 2.3.8 Phương pháp phân tích thành phần monosaccharide EPS sắc ký lớp mỏng 23 2.3.9 Phương pháp xử lý thống kê 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 26 3.1 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả thu nhận EPS 26 3.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp EPS 26 3.1.2 Ảnh hưởng thời gian đến sinh tổng hợp EPS 27 3.1.3 Ảnh hưởng môi trường lên men 29 3.2 Khảo sát điều kiện thu nhận EPS từ dịch lên men 30 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ acid trichloroacetic (TCA) tới khả loại bỏ protein 30 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian tủa ethanol đến khả tách EPS .32 3.2.3 Ảnh hưởng thể tích ethanol so với dịch đến khả tách EPS 33 3.3 Xây dựng quy trình tách thu nhận EPS 35 3.4 Phân tích EPS thu sắc ký lớp mỏng: 37 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Abs BSA C CFU/mL EPS EtOH Fruc FTF Gal GalNAc GDP Glc Glc-1-P Glc-6-P GlcNAc GlcA Tiếng Anh Absorbance Bovine Serum Albumin Carbon Colony-Forming Unit/Ml Exopolysaccharide Ethanol Fructose Fructosyltransferase Galactose N-acetyl-D-galactosamine Galactose 1-phosphateuridyltransferase Guanosine diphosphate Glucose Glucose-6-phosphate Glucose-1-phosphate N-acetyl-D-glucosamine Glucuronic acid GRAS Generally Recognized As Safe GTF Glycosyltransferase HePS Heteropolysaccharide HMBC Heteronuclear Multiple – Bond Correlation HoPS Homopolysaccharide La Lactococcus GalT Tiếng Việt Độ hấp thụ quang Cacbon số lƣợng tế bào/mL Cồn etylic Đƣợc công nhận an toàn Polysaccharide phức tạp Polysaccharide dị thể Polysaccharide Polysaccharide đồng thể v LAB Lac Lb Leu Man-6-P Man-1-P MRS N NDP OD PEP-PTS PGM PMM PS Rha S Suc TCA TDP TFA TGP TLC TMS UDP Lactic Acid bacteria Lactose Lactobacillus Leuconostoc Mannose-6-Phosphate Mannose-1-Phosphate Man Rogosa Sharpe Nitrogen Diphosphate nucleoside Optical Density Phosphoenolpyruvatephosphotransferase Phosphoglucomutase Phosphomannomutase Polysaccharide Rhamnose Streptococcus Sucrose Trichloroacetic acid Tyrosine diphosphate Ttrifluoroacetic acid TDP-glucose pyrophosphorylase Thin Layer Chromatography Tetramethylsilan Uridine diphosphate vi Vi khuẩn lactic Nitơ Mật độ quang Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thiết bị, dụng cụ sử dụng thí nghiệm 14 Bảng 2.2: Nồng độ dung dịch dùng xây dựng đƣờng chuẩn D-glucose 19 Bảng 2.3: Nồng độ dung dịch dùng xây dựng đƣờng chuẩn BSA 21 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng thời gian lên men đến sinh trƣởng tổng hợp EPS 27 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng hàm lƣợng cacbon đến sinh tổng hợp EPS: 29 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả loại bỏ protein hàm lƣợng EPS thu đƣợc 31 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng thể tích ethanol so với dịch nuôi cấy đến khả tách chiết EPS 34 Bảng 3.5: Kết phân tích thành phần EPS TLC 37 vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Sơ đồ lên men thu nhận tách EPS 17 Hình 3.1: Ảnh hƣởng nhiệt độ ni cấy lên q trình sinh tổng hợp EPS 26 Hình 3.2: Ảnh hƣởng thời gian thuỷ phân lên khả thu nhận EPS 32 Hình 3.3: Ảnh hƣởng thể tích ethanol so với dịch đến khả tách EPS 33 Hình 3.4 Hình ảnh EPS sau tinh s ạch thu nhận 35 Hình 3.5: Sơ đồ qui trình cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ chủng Lb.fermentum 36 Hình 3.6: Kết chạy TLC Trong đó: 1-Mẫu EPS; 2-Chất chuẩn Glucose; 3-Chất chuẩn Mantose; 4-Chất chuẩn Galactose 37 viii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài: Exopolysaccharid (EPS) đƣợc phân lập từ vi sinh vật đặc biệt từ vi khuẩn Lactobacillus fermentum (LAB) có nhiều ứng dụng quan trọng Nhiều ứng dụng thực tế đƣợc rõ tác dụng chống ung thƣ, điều hòa miễn dịch kháng khuẩn nhƣ ức chế tế bào ung thƣ biểu mô (dịng SiHa) kích thích sản xuất Il-6 TNF- α dòng đại thực bào THP-1 Các nghiên cứu khác tính kháng khuẩn đặc tính khử trùng tốt exopolysaccharid đƣợc nghiên cứu chống lại S aureus V fischeri Một số ứng dụng hoạt tính sinh học đƣợc mơ tả có tác dụng hạ cholesterol máu Việc thu nhận, tạo chế phẩm từ EPS đáp ứng nhu cầu sử dụng gia tăng polymer tự nhiên ứng dụng công nghệ thực phẩm cơng nghệ mỹ phẩm, EPS đóng vai trò tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel Những hoạt tính sinh học khác liên quan đến EPS nhƣ khả chống oxy hóa, chống ung thƣ, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic đƣợc nghiên cứu Do đặc điểm đa dạng cấu trúc nhƣ an toàn sức khỏe ngƣời vi khuẩn lactic lactic (LAB) đƣợc "cơng nhận vi sinh vật an tồn" (GRAS-Generally Recognized As Safe) Vì chủng LAB đƣợc quan tâm nhiều để lên men sinh tổng hợp EPS đồng thời chủng có lợi với EPS từ loài khác (Vivek cộng sự, 2016) Bên cạnh nhiều đóng góp quan trọng cơng nghiệp y học đƣợc ghi nhận, EPS từ vi khuẩn tồn nhƣợc điểm suất thu nhận thấp lý khiến khả thƣơng mại hóa EPS từ vi khuẩn nói chung từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) nói riêng Nhiều vi khuẩn tổng hợp polysaccharide (PS) ngoại bào tiết bên ngồi mơi Kết Bảng 3.1 cho thấy sau 48 lên men, trình sinh tổng hợp EPS chủng Lb fermentum BR11 đạt đƣợc cao với hàm lƣợng EPS 445,42 µg/ml Từ 12 đến 36 lên men, lƣợng EPS tạo có tăng nhƣng chậm Sau đạt cực đại 48 giờ, lƣợng EPS đo đƣợc giảm mạnh sau 72 lên men Kết phân tích thống kê cho thấy sai khác lớn không xảy với lƣợng EPS tạo thành chủng Lb.fermentum BR11 thời điểm 66 đến 72 Nguyên nhân tăng giảm trình lên men chủng có lẽ liên quan đến giai đoạn quy luật phát triển vi sinh vật Sau đƣợc ni cấy vào mơi trƣờng, chủng vi khuẩn thích nghi dần bắt đầu phát triển (từ 12 đến 36 giờ) Tốc độ sinh sản đƣợc tăng lên cực đại, số OD môi trƣờng tƣơng ứng tăng mạnh với lƣợng chất dinh dƣỡng giảm (từ 36 đến 48 giờ) Từ sau 48 giờ, lƣợng sản phẩm tạo thành không tăng mà bắt đầu có xu hƣớng giảm Sự giảm sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật mơi trƣờng lƣợng chất dinh dƣỡng môi trƣờng giảm, số enzyme phân giải sản phẩm tạo thành chúng để làm nguồn thức ăn Mặt khác, trình sinh trƣởng vi sinh vật, bên cạnh việc sử dụng chất dinh dƣỡng mơi trƣờng đồng thời chúng thải số chất gây ức chế trình hấp thụ chất dinh dƣỡng thân, ức chế hoạt động enzyme tổng hợp vi sinh vật phát triển chậm lại chuyển sang trạng thái cân dần suy vong Những nguyên nhân làm cho lƣợng EPS thu đƣợc giảm xuống thời gian nuôi cấy kéo dài 28 3.1.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng lên men a Ảnh hƣởng hàm lƣợng cacbon Bảng 3.2 Ảnh hƣởng hàm lƣợng cacbon đến sinh tổng hợp EPS: Lƣợng glucose 18 20 22 24 26 OD600nm (72 giờ) 3,23 3,53 3,77 3,86 3,84 EPS µg/ml 405,24 425,15 449,38 449,92 448,11 bổ sung (g/lít) Dựa vào kết khảo sát đƣợc: Ta thấy với hàm lƣợng Glucose 22g/l ta thấy lƣợng EPS thu đƣợc cao Cùng với đơi lƣợng EPS số OD thay đổi thay đổi lƣợng Glucose 449,38 µg/ml giá trị cao khảo sát đƣợc Tóm lại, trình sinh trƣởng phát triển xảy khoảng thời gian định phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ, nguồn C, nguồn N, v.v.) chất lƣợng tế bào nuôi cấy Khả phát triển chủng Lb.fermentum BR11 môi trƣờng xảy chậm chất dinh dƣỡng môi trƣờng giảm đến hết Mặt khác, tế bào đến giai đoạn già hóa sản phẩm trao đổi chất mơi trƣờng q nhiều gây ức chế q trình trao đổi chất tế bào Với mục đích thu sản phẩm trao đổi chất q trình ni cấy nên kết thúc vào thời điểm cuối pha log phù hợp b Ảnh hƣởng hàm lƣợng nito đến sinh trƣởng sinh EPS Ta có bảng thông số nhƣ sau: Hàm lƣợng OD600nm- 72 3,49 3,56 3,97 3,95 3,96 EPS µg/ml 423,22 435,53 441,11 451,56 451,33 Cao nấm men (N) (g) 29 Khi thay đổi hàm lƣợng Cao nấm men cho vào môi trƣờng ta thấy khác biệt rõ rệt khả sinh EPS hàm lƣợng cao nấm men bổ sung khác vào môi trƣờng lên men Khi lên men giữ nguyên điều kiện đƣợc tối ƣu nhiệt độ, thời gian lên men, nồng độ glucose thu đƣợc kết khác biệt Cụ thể với 7g/l cao nấm men môi trƣờng ta thấy vi khuẩn phát triển tốt sinh tổng hợp EPS với hàm lƣợng cao 451,56 ug/ml Tuy nhiên tăng lƣợng cao nấm men không làm tăng sinh EPS So sánh với nghiên cứu quốc tế cho thấy sinh vật cho chiều thành phần Ni tơ mơi trƣờng có vai trị định lớn phát triển vi khuẩn Lb Fermentum BR11 sinh tổng hợp EPS (Magdalena cs, 2020) Mặc dù suất sinh tổng hợp nhóm thấp nhƣng nhóm quốc tế nhƣng rõ ảnh hƣởng cao nấm men sinh tổng hợp EPS 3.2 Khảo sát điều kiện thu nhận EPS từ dịch lên men 3.2.1 Ảnh hƣởng nồng độ acid trichloroacetic (TCA) tới khả loại bỏ protein Để thực khảo sát ảnh hƣởng nồng độ TCA lên khả loại bỏ protein có dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Lb Fermentum BR11, tiến hành bổ sung TCA vào môi trƣờng lên men nồng độ khác (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40%) Thực khuấy 30 – 40 phút sau thu mẫu tiến hành xác định hàm lƣợng protein lại theo phƣơng pháp Bradford hàm lƣợng EPS dịch đƣợc xác định theo phƣơng pháp phenol – sulfuric Kết khảo sát thể Bảng 33 Kết cho thấy, nồng độ TCA bổ sung vào tăng lên, lƣợng protein cịn lại dịch ni cấy có xu hƣớng giảm dần Từ kết cho thấy lƣợng protein lại dịch lên men thấp lƣợng EPS thu đƣợc đạt cực đại trình tủa TCA đƣợc thực 30 với nồng độ bổ sung 35% Ở điều kiện này, lƣợng EPS đạt đƣợc khoảng 432 µg/ml lƣợng protein cịn lại 288 µg/ml Ở nồng độ TCA bổ sung vào dịch nuôi cấy 10, 15, 20, 25, 30; 35 40%, lƣợng EPS thu đƣợc thấp lƣợng protein cịn lại có giảm theo chiều tăng nồng độ TCA Tuy nhiên, kết xử lý thống kê cho thấy lƣợng protein cịn lại dịch khơng có sai khác đáng kể (p>0,05) trƣờng hợp nồng độ TCA bổ sung khác Nhƣ vậy, việc tăng nồng độ TCA không giúp cải thiện hiệu loại bỏ protein Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả loại bỏ protein hàm lƣợng EPS thu đƣợc Nồng độ Thí nghiệm TCA Hàm lƣợng EPS trung bình Hàm lƣợng protein (%) OD595nm (µg/ml) OD 490nm (µg/ml) 10 0,214 296,780 2,868 359,874 15 0,212 293,940 2,983 374,305 20 0,209 289,680 3,071 385,280 25 0,210 289,917 3,198 401,215 30 0,209 289,207 3,251 427,760 35 0,208 287,550 3,445 452,110 40 0,206 284,950 3,346 449,630 Điều đƣợc lý giải bên cạnh việc tách bỏ protein tốt nồng độ TCA bổ sung vào cao acid gây nên phân hủy EPS có mơi trƣờng Chính vậy, từ mục đích thu nhận EPS có hiệu quả, tiến hành chọn nồng độ TCA bổ sung vào nhằm tách chiết EPS đạt đƣợc tốt 35% Nồng độ đƣợc sử dụng để tiếp tục hồn thiện 31 quy trình tách chiết EPS tổng hợp từ chủng Lb Fermentum BR11 hiệu 3.2.2 Ảnh hƣởng thời gian tủa ethanol đến khả tách EPS Ảnh hƣởng thời gian tủa lên khả tách EPS từ dịch đƣợc thực khoảng thời gian khác 12, 24, 36 48 Quá trình kết tủa đƣợc thực điều kiện lạnh (4oC) Hàm lƣợng EPS (μg/mL) 600.000 500.000 448,271 453,156 485,644 400.000 300.000 211,365 200.000 100.000 0.000 12 24 36 Thời gian tủa ethanol (giờ) 48 Hình 3.2: Ảnh hƣởng thời gian thuỷ phân lên khả thu nhận EPS Kết từ Hình 3.2 cho thấy, chênh lệch lƣợng EPS tủa chủng Lb Fermentum BR11 khoảng thời gian thuỷ phân khác từ 24 đến 48 hầu nhƣ thấp khơng có sai khác xử lý thống kê (p>0,05) Với trƣờng hợp thuỷ phân 12 giờ, lƣợng EPS thu đƣợc xấp xỉ 50% so với thực thuỷ phân 24-48 Nhƣ vậy, việc kéo dài thời gian thuỷ phân 24 hầu nhƣ không tác động nhiều đến lƣợng EPS tách Với kết này, thời gian áp dụng khả thi để thu EPS tủa trình tách chiết EPS từ dịch 24 Đây thời gian mà số nhóm tác giả giới (Seeyuriyachan cộng sự, 2011, Patel cộng 32 sự, 2013) nhƣ nhóm tác giả Việt Nam (Trần Thị Ái Luyến, 2017, Đỗ Thị Bích Thuỷ Nguyễn Thị Diễm Hƣơng, 2018) sử dụng trình nghiên cứu thu nhận EPS từ số chủng LAB 3.2.3 Ảnh hƣởng thể tích ethanol so với dịch đến khả tách EPS Dịch chứa EPS chủng vi khuẩn đƣợc bổ sung ethanol tỉ lệ khác (lần lƣợt 1:0,5; 1:1,0; 1:1,5; 1:2,0; 1:2,5; 1:3,0) nhằm thu EPS dƣới dạng tủa Kết khảo sát ảnh hƣởng thể tích ethanol so với dịch chứa EPS đến khả tách chiết EPS sau 24 thể Hình 3.3 số liệu cụ thể đƣợc trình bày Hình 3.3 Hình 3.3: Ảnh hƣởng thể tích ethanol so với dịch đến khả tách EPS Lƣợng EPS thu đƣợc từ dịch chứa EPS sinh chủng Lb Fermentum BR11 đạt tốt tỉ lệ dịch ethanol 1:1 Lƣợng EPS thu đƣợc tỉ lệ tƣơng ứng với hàm lƣợng EPS 450,24 µg/ml Ở tỉ lệ ethanol:dịch 0,5:1, lƣợng EPS tủa thu đƣợc thấp nhiều (50%) 33 Khi thể tích ethanol tăng lên (1,5; 2; 2,5; 3,0), lƣợng EPS tách khơng tăng có chiều hƣớng giảm nhẹ Do đó, tăng thể tích ethanol lên khả tách thêm EPS khơng hiệu Bảng 3.4: Ảnh hƣởng thể tích ethanol so với dịch nuôi cấy đến khả tách chiết EPS Thí nghiệm Tỉ lệ dịch nổi:ethanol (v/v) OD 490nm Hàm lƣợng EPS trung bình (µg/ml) 1.0:0.5 1,009 127,598 1.0:1.0 3,591 450,240 1.0:1.5 3,443 431,785 1.0:2.0 3,258 408,614 1.0:2.5 3,176 398,370 1.0:3.0 3,173 398,004 Tỉ lệ thể tích ethanol so với dịch ni cấy 1:1 đƣợc chọn số nghiên cứu tách chiết EPS từ chủng Lb.fermentum BR11 tác giả Welman cộng (2003), Vivek cộng (2016) Các nghiên cứu nhận định lƣợng EPS dịch đƣợc kết tủa hết thời điểm thể tích ethanol bổ sung vào dịch đạt tỉ lệ 1:1 nên việc tiếp tục thêm ethanol vào tác dụng thúc đẩy khả tách EPS (Hình 3.3) 34 Hình 3.4 Hình ảnh EPS sau tinh thu nhận Quá trình khảo sát điều kiện tách cho thấy, việc thay đổi nồng độ TCA có ảnh hƣởng đến khả loại bỏ protein Hàm lƣợng protein đƣợc loại bỏ dần khỏi dịch lên men nhiều nồng độ TCA tăng lên Trong đó, với tỉ lệ ethanol thời gian thực tủa ethanol, nhận thấy việc tăng tỉ lệ ethanol so với dịch nhƣ việc kéo dài thời gian tủa ethanol hầu nhƣ không ảnh hƣởng lớn đến q trình tách chiết EPS Do đó, theo dõi lƣợng EPS dịch nuôi cấy chủng Lb Fermentum BR11 dự đoán hiệu thu nhận EPS, chọn đƣợc điều kiện tách EPS đƣợc tóm tắt Bảng 3.4 Nồng độ TCA bổ sung vào dịch lên men chủng Lb Fermentum BR11 phù hợp nhằm loại bỏ protein thu EPS 35%, nhiệt độ nuôi cấy ban đầu tối ƣu 35oC Quá trình tách EPS đạt hiệu tốt thời gian tủa ethanol đƣợc thực 24 với tỉ lệ dịch ethanol 1:1 3.3 Xây dựng quy trình tách thu nhận EPS Từ kết nghiên cứu trình bày mục 3.1, ta có sơ đồ tổng thể quy trình cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ chủng Lb.fermentum nhƣ sau: 35 Phƣơng pháp Bradford Hình 3.5: Sơ đồ qui trình cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ chủng Lb.fermentum Theo đó, ta thấy hiệu suất thu nhận EPS từ chủng Lb Fermentum BR11 sau cải thiện điều kiện trình lên men so với mơi trƣờng ban đầu (MRS) lƣợng EPS thu đƣợc môi trƣờng lên men với điều kiện thích hợp thành phần mơi trƣờng, điều kiện lên men, so với lƣợng EPS thu đƣợc điều kiện lên men môi trƣờng MRS: 36 3.4 Phân tích EPS thu đƣợc sắc ký lớp mỏng: Hình 3.6: Kết chạy TLC Trong đó: 1-Mẫu EPS; 2-Chất chuẩn Glucose; 3-Chất chuẩn Mantose; 4-Chất chuẩn Galactose Kết chạy phân tích TLC sản phẩm sau tinh Tƣơng ứng với Hình 3.6 ta có hệ số Rf mẫu nhƣ sau: Bảng 3.5: Kết phân tích thành phần EPS TLC Mẫu EPS Chất chuẩn Chất chuẩn Chất chuẩn Glucose Mantose galactose a (cm) 3,3 3,8 3,8 3,2 3,3 b (cm) 5 5 Hệ số Rf 0,66 0,76 0,76 0,64 0,66 37 Từ kết chạy TLC mẫu EPS cho 02 vết chạy sắc ký ứng với hệ số Rf lần lƣợt 0,66 0,76 Kết tƣơng ứng với hệ số Rf chất chuẩn Glucose Galactose Nhƣ vậy, xác định đƣợc mẫu EPS có chứa thành phần đƣờng Glucose đƣờng Galactose 38 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu đƣợc, có kết luận nhƣ sau: - Q trình lên men thu nhận EPS đƣợc nghiên cứu để thu đƣợc EPS hiệu suất cao là: Thời gian lên men 72 với nhiệt độ lên men 37 độ C, với lƣợng glucose thích hợp 22 g/lít, lƣợng Nito phù hợp gam/lít - Hiệu suất sinh tổng hợp EPS từ chủng 451,56 ug/ml - Các điêu kiện thích hợp để tách tinh EPS đạt hiệu cao với nồng độ TCA bổ sung vào dịch thu nhận 35%, Thời gian thực kết tủa EPS 24 giờ, với tỷ lệ ethanol: dịch sau thu từ lên men 1:1 4.2 Kiến nghị Do thời gian tiến hành đề tài có hạn số khó khăn thiết bị, chúng tơi chƣa thể tiến hành thí nghiệm sâu Để kết đƣợc ứng dụng tốt thực tiễn, xin phép kiến nghị tiếp tục: Nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng khác lên đặc điểm cấu trúc EPS sinh tổng hợp đƣợc từ số chủng Lb fermentum khác Tiến hành nghiên cứu ứng dụng EPS thu đƣợc lên số sản phẩm lên men cụ thể việc cải thiện tính chất lƣu biến sản phẩm, nhƣ khả giữ nƣớc, khả tạo gel, khả làm đặc, v.v Tiến hành nghiên cứu số tính chất sinh lý tác động đến sức khỏe ngƣời EPS nhƣ: khả kháng khuẩn, tác động làm giảm cholesterol, hoạt tính ngăn ngừa khối u, v.v 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Anh 10 11 12 13 Badel S., Bernardib T., Michaud P (2011), New perspectives for Lactobacilli exopolysaccharides, Biotechnology Advances 29, 54–66 Cerning J (1995), Production of exopolysaccharides by lactic acid bacteria and dairy propionibacteria, Lait 75, 463-472 Cross M.L., Stevenson L.M., Gill H.S (2001), Anti-allergy properties of fermented foods: an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria, International Immunopharmacology 1(5), 891-901 De Vuyst L., De Vin F (2007), Exopolysaccharides from lactic acid bacteria, FEMS Microbiology Reviews 23(2), 478-519 De Vuyst L., Degeest B (1999), Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria, FEMS Microbiology Reviews 23(1), 153-177 Degeest B., De Vuyst L., (1999), Indication that the Nitrogen Source Influences Both Amount and Size of Exopolysaccharides Produced by Streptococcus thermophilus LY03 and Modelling of the Bacterial Growth and Exopolysaccharide Production in a Complex Medium, Applied and Environmental Microbiology 65(7), 2863-2870 Garcia-Garibay M., Marshall V.M.E (1991), Polymer production by Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus Journal of Applied Bacteriology, 70, 325-328 Groben G.J., Smith M R., Sikkema J., Bon J.A.M de (1996), Influence of fructose and glucose on the production of exopolysaccharides and the activities of enzymes involved in the sugar metabolism and the synthesis of sugar nucleotides in Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus NCFB 2772, Applied Microbiology and Biotechnology 46(3), 279-284 Harutoshi T (2013), Exopolysaccharides of Lactic Acid Bacteria for Food and Colon Health Applications, Lactic Acid Bacteria – R & D for Food, Health and Livestock Purposes 2, 515538 Kumar A.S., Mody K., Jha B (2007), Review Article: Bacterial exopolysaccharides – a perception, Journal of Basic Microbiology 47, 103-117 Laws A.P., Chadha M.J., Chacon-Romero M., Marshall V.M., Maqsood M (2008), Determination of the structure and molecular weights of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus acidophilus 5e2 when grown on different carbon feeds, Carbohydrate Research 343, 301-307 Mikelsaar M and Zilmer M (2009), Lactobacillus fermentum ME-3: An antimicrobial and antioxidative probiotic, Microbial Ecology in Health and Disease 21(1), 1-27 Nagaoka M., Hashimoto S., Watanabe T., Yokokura T., Mori Y (1994), Anti-ulcer effects of lactic acid bacteria and their cell wall polysaccharides, Biological & Pharmaceutical Bulletin 17(8), 1012-1017 40 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Nuria S., Miguel G., Ana M.H.B, Patricia R.M., Clara G.R.G (2008), Exopolysaccharides produced by intestinal bifidobacterium strains act as fermentable substrates for human intestinal bacteria, Applied and Environmental Microbiology 74(15), 4737-4745 Nwodo U.U., Green E and Okoh A.I (2012), Bacterial exopolysaccharides: functionality and prospects, International Journal of Molecular Sciences 13, 14002-14015 Pan D D., Zeng X Q., and Yan T (2011), Characterization of Lactobacillus fermentum SM-7 isolated from koumiss, a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects, Journal of the Science of Food and Agriculture 91(1), 512-518 Patel A and Prajapati J.B (2013), Food and Health Applications of Exopolysaccharides produced by Lactic acid Bacteria, Advances in Dairy Research 1(2), 1-2 Patel S., Majumder A., Goyal A (2012), Potentials of Exopolysaccharides from Lactic Acid Bacteria, Indian Journal of Microbiology 52(1), 3-12 Rodríguez C., Medici M., Rodríguez A V., Mozzi F., de Valdez F G (2009), Prevention of chronic gastritis by fermented milks made with exopolysaccharideproducing Streptococcus thermophiles strains, Journal of Dairy Science 92, 2423-2434 Schiraldi C., Valli V., Molinaro A., Carteni M., De Rosa M (2006), Exopolysaccharides production in Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus casei exploiting microfiltration, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 33(5), 384-390 Seesuriyachan P., Kuntiya A., Techapun C., Chaiyaso T., Hanmuangjai P., Leksawasdi N (2011), Nutritional requirements for methyl orange decolourisation by freely suspended cells and growing cells of Lactobacillus casei TISTR 1500 Chiang Mai University Digital Collections ISBN 19057873 Sutherland I.W (1972), Bacterial exopolysaccharides, Advance in Microbial Physiology 8, 143-213 Tala S (2009), Studies on Exopolysaccharide Produced by Lactobacillus fermentum TDS030603, Master Thesis, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, 142 Vivek K.B., Rajib M., Irfan A R., Kangmin K (2016), Extraction, isolation and purification of exopolysaccharide from lactic acid bacteria using ethanol precipitation method, Bangladesh Journal of Pharmacology 11(3), 573-576 Welman A D., Maddox I S (2003), Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges, Trends in Biotechnology 21, 269-274 Zhengqi L., Zhihong., Liang Q.,† Fen Z., Xiongpeng X., Hua W., Xueying T., (2017) Characterization and bioactivities of the exopolysaccharide from a probiotic strain of Lactobacillus plantarum WLPL04, J Dairy Sci 100, pages 6895–6905 Zhou X., Li Y (2015), Atlas of oral microbiology: From healthy Microflora to Disease , Zhejiang University Press ISBN 978-0-12-802234-4 Tài liệu Tiếng Việt 41 Đỗ Thị Bích Thuỷ, Nguyễn Thị Diễm Hƣơng (2018), Xác định khả chịu mặn số tính chất có tiềm probiotic chủng vi khuẩn lactic thuộc loài lactobaccillus fermentum phân lập từ ruột cá nục Khoa Cơ khí-Cơng nghệ, Đại học Nơng Lâm, Đại học Huế (2016), Ảnh hƣởng nguồn nitơ điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp Exopolysaccharide Lactobacillus fermentum MC3 Tạp chí Khoa học công nghệ nông nghiệp, Trƣờng Đại học Nông Lâm, Đại học Huế, Tập 121, Số 7, Trang 101-120 Trần Thị Ái Luyến (2019), Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc tính chất exopolysaccaride sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum Luận án tiến sỹ Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế Trần Thị Ái Luyến, Trần Bảo Khánh, Đỗ Thị Bích Thuỷ, Trần Thị Văn Thi (2017), Nghiên cứu điều kiện tách chiết đặc điểm cấu trúc exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum MC3 Lactobacillus plantarum W12, Tạp chí Hóa học, Số 55 (4E23), 243-249 Hà Nội, ngày tháng… năm 2022 Xác nhận giáo viên hƣớng dẫn Học viên thực (Ký ghi rõ họ tên) (Ký ghi rõ họ tên) Đỗ Phƣơng Khanh Nguyễn Ngọc Bảo 42 ... hiệu thu nhận EPS từ lên men, đến thu nhận, tách chiết EPS sinh tổng hợp từ chủng LAB chủng Lactobacillus fermentum BR11, thực đề tài ? ?Nghiên cứu tách chiết thu nhận exopolysaccharide sinh tổng hợp. .. dung nghiên cứu:  Nghiên cứu điều kiện thích hợp lên men thu nhận EPS từ chủng Lactobacillus fermentum  Xây dựng quy trình tách thu nhận EPS Thời gian địa điểm nghiên cứu: Thời gian nghiên cứu: ... Bảo Khánh, Đỗ Thị Bích Thu? ??, Trần Thị Văn Thi (2017), Nghiên cứu điều kiện tách chiết đặc điểm cấu trúc exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum MC3 Lactobacillus plantarum