CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ
3.2 Khảo sát điều kiện thu nhận EPS từ dịch lên men
3.2.1 Ảnh hƣởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) tới khả năng loại bỏ protein
Để thực hiện khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ TCA lên khả năng loại bỏ protein có trong dịch ni cấy của các chủng vi khuẩn Lb. Fermentum BR11, chúng tôi đã tiến hành bổ sung TCA vào các môi trƣờng lên men ở các nồng độ khác nhau (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40%). Thực hiện khuấy trong 30 – 40 phút sau đó thu mẫu và tiến hành xác định hàm lƣợng protein còn lại theo phƣơng pháp Bradford và hàm lƣợng EPS trong dịch nổi đƣợc xác định theo phƣơng pháp phenol – sulfuric.
Kết quả khảo sát thể hiện Bảng 33. Kết quả cho thấy, khi nồng độ TCA bổ sung vào tăng lên, lƣợng protein còn lại trong dịch nuôi cấy đều có xu hƣớng giảm dần.
Từ kết quả trên cho thấy lƣợng protein còn lại trong dịch lên men thấp và lƣợng EPS thu đƣợc đạt cực đại khi quá trình tủa bằng TCA đƣợc thực
hiện với nồng độ bổ sung là 35%. Ở điều kiện này, lƣợng EPS đạt đƣợc khoảng 432 µg/ml và lƣợng protein cịn lại là 288 µg/ml. Ở các nồng độ TCA bổ sung vào dịch nuôi cấy là 10, 15, 20, 25, 30; 35 và 40%, lƣợng EPS thu đƣợc thấp và lƣợng protein cịn lại có giảm theo chiều tăng của nồng độ TCA. Tuy nhiên, kết quả xử lý thống kê cho thấy lƣợng protein còn lại trong dịch nổi khơng có sự sai khác đáng kể (p>0,05) trong các trƣờng hợp nồng độ TCA bổ sung khác nhau. Nhƣ vậy, việc tăng nồng độ TCA hơn nữa không giúp cải thiện hiệu quả loại bỏ protein.
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả năng loại bỏ protein và hàm lƣợng EPS thu đƣợc
Thí nghiệm Nồng độ TCA (%) Hàm lƣợng protein Hàm lƣợng EPS trung bình OD595nm (µg/ml) OD 490nm (µg/ml) 1 10 0,214 296,780 2,868 359,874 2 15 0,212 293,940 2,983 374,305 3 20 0,209 289,680 3,071 385,280 4 25 0,210 289,917 3,198 401,215 5 30 0,209 289,207 3,251 427,760 6 35 0,208 287,550 3,445 452,110 7 40 0,206 284,950 3,346 449,630
Điều này có thể đƣợc lý giải là do bên cạnh việc tách bỏ protein tốt hơn ở nồng độ TCA bổ sung vào cao thì acid này có thể gây nên sự phân hủy EPS có trong mơi trƣờng. Chính vì vậy, từ mục đích là thu nhận EPS có hiệu quả, chúng tôi tiến hành chọn các nồng độ TCA bổ sung vào nhằm tách chiết EPS đạt đƣợc tốt nhất là 35%. Nồng độ này sẽ đƣợc sử dụng để tiếp tục hồn thiện
quy trình tách chiết EPS tổng hợp từ chủng Lb. Fermentum BR11 hiệu quả
hơn.
3.2.2 Ảnh hƣởng của thời gian tủa bằng ethanol đến khả năng tách EPS
Ảnh hƣởng của thời gian tủa lên khả năng tách EPS từ dịch nổi đƣợc thực hiện trong các khoảng thời gian khác nhau 12, 24, 36 và 48 giờ. Quá trình kết tủa đƣợc thực hiện trong điều kiện lạnh (4oC).
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của thời gian thuỷ phân lên khả năng thu nhận EPS EPS
Kết quả từ Hình 3.2 cho thấy, sự chênh lệch về lƣợng EPS tủa của chủng Lb. Fermentum BR11 trong các khoảng thời gian thuỷ phân khác nhau
từ 24 giờ đến 48 giờ hầu nhƣ rất thấp và khơng có sự sai khác khi xử lý thống kê (p>0,05). Với trƣờng hợp thuỷ phân trong 12 giờ, lƣợng EPS thu đƣợc chỉ xấp xỉ 50% so với khi thực hiện thuỷ phân trong 24-48 giờ. Nhƣ vậy, việc kéo dài thời gian thuỷ phân quá 24 giờ hầu nhƣ không tác động nhiều đến lƣợng EPS tách ra. Với kết quả này, thời gian áp dụng khả thi để thu EPS tủa trong quá trình tách chiết EPS từ dịch nổi là 24 giờ. Đây cũng là thời gian mà một số nhóm tác giả trên thế giới (Seeyuriyachan và cộng sự, 2011, Patel và cộng
211,365 448,271 453,156 485,644 0.000 100.000 200.000 300.000 400.000 500.000 600.000 12 24 36 48 H àm l ƣ ợ ng E P S ( μ g/ m L )
sự, 2013) cũng nhƣ nhóm tác giả tại Việt Nam (Trần Thị Ái Luyến, 2017, Đỗ Thị Bích Thuỷ và Nguyễn Thị Diễm Hƣơng, 2018) đã sử dụng trong quá trình nghiên cứu thu nhận EPS từ một số chủng LAB.
3.2.3 Ảnh hƣởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS
Dịch nổi chứa EPS của các chủng vi khuẩn đƣợc bổ sung ethanol ở các tỉ lệ khác nhau (lần lƣợt là 1:0,5; 1:1,0; 1:1,5; 1:2,0; 1:2,5; 1:3,0) nhằm thu EPS dƣới dạng tủa. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thể tích ethanol so với dịch nổi chứa EPS đến khả năng tách chiết EPS sau 24 giờ thể hiện ở Hình 3.3 và các số liệu cụ thể đƣợc trình bày ở Hình 3.3.
Hình 3.3: Ảnh hƣởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS tách EPS
Lƣợng EPS thu đƣợc từ các dịch nổi chứa EPS sinh ra bởi chủng Lb.
Fermentum BR11 đạt tốt nhất khi tỉ lệ dịch nổi và ethanol là 1:1. Lƣợng EPS
thu đƣợc ở tỉ lệ này tƣơng ứng với hàm lƣợng EPS là 450,24 µg/ml. Ở tỉ lệ ethanol:dịch nổi là 0,5:1, lƣợng EPS tủa thu đƣợc thấp hơn rất nhiều (50%).
Khi thể tích ethanol tăng lên (1,5; 2; 2,5; 3,0), lƣợng EPS tách ra không tăng nữa và có chiều hƣớng giảm nhẹ. Do đó, khi tăng thể tích ethanol lên thì khả năng tách thêm EPS là không hiệu quả.
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của thể tích ethanol so với dịch ni cấy đến khả năng tách chiết EPS
Thí nghiệm Tỉ lệ dịch nổi:ethanol (v/v) OD 490nm Hàm lƣợng EPS trung bình (µg/ml) 1 1.0:0.5 1,009 127,598 2 1.0:1.0 3,591 450,240 3 1.0:1.5 3,443 431,785 4 1.0:2.0 3,258 408,614 5 1.0:2.5 3,176 398,370 6 1.0:3.0 3,173 398,004
Tỉ lệ thể tích ethanol so với dịch nuôi cấy là 1:1 cũng đã đƣợc chọn trong một số nghiên cứu tách chiết EPS từ chủng Lb.fermentum BR11 bởi các tác giả Welman và cộng sự (2003), Vivek và cộng sự (2016). Các nghiên cứu nhận định do lƣợng EPS trong dịch nổi đã đƣợc kết tủa hết ở thời điểm thể tích ethanol bổ sung vào dịch nổi đạt tỉ lệ 1:1 nên việc tiếp tục thêm ethanol vào khơng có tác dụng thúc đẩy khả năng tách EPS (Hình 3.3).
Hình 3.4. Hình ảnh EPS sau khi tinh sạch và thu nhận
Quá trình khảo sát các điều kiện tách cho thấy, việc thay đổi nồng độ TCA có ảnh hƣởng đến khả năng loại bỏ protein. Hàm lƣợng protein đã đƣợc loại bỏ dần khỏi dịch lên men nhiều hơn khi nồng độ TCA tăng lên. Trong khi đó, với tỉ lệ ethanol và thời gian thực hiện tủa bằng ethanol, nhận thấy rằng việc tăng tỉ lệ ethanol so với dịch nổi cũng nhƣ việc kéo dài thời gian tủa bằng ethanol hầu nhƣ không ảnh hƣởng lớn đến quá trình tách chiết EPS. Do đó, khi theo dõi lƣợng EPS trong dịch nuôi cấy của chủng Lb. Fermentum BR11 và dự đốn hiệu quả thu nhận EPS, chúng tơi đã chọn đƣợc các điều kiện tách EPS đƣợc tóm tắt ở Bảng 3.4. Nồng độ TCA bổ sung vào dịch lên men của chủng Lb. Fermentum BR11 phù hợp nhất nhằm loại bỏ protein và thu EPS là 35%, nhiệt độ nuôi cấy ban đầu tối ƣu là 35oC. Quá trình tách EPS đạt hiệu quả tốt khi thời gian tủa bằng ethanol đƣợc thực hiện trong 24 giờ với tỉ lệ dịch nổi và ethanol là 1:1.