2.3.4 Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ TCA lên khả năng loại bỏ protein trong dịch lên men
Ảnh hƣởng của nồng độ TCA bổ sung vào dịch lên men thu đƣợc sau q trình ni cấy các chủng Lb. fermentum nhằm loại bỏ protein đã đƣợc
thực hiện với các nồng độ bổ sung khác nhau so với dịch lên men bao gồm: 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%. Các protein kết tủa đƣợc tách khỏi dịch nổi bằng cách ly tâm. Hàm lƣợng protein còn lại trong dịch nổi sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Bradford.
2.3.5 Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của thể tích ethanol và thời gian tủa lên quá trình thu nhận EPS tủa từ dịch nổi
Dịch nổi thu đƣợc sau khi ly tâm tách bỏ protein sẽ tiếp tục đƣợc kết tủa bằng ethanol với thể tích bổ sung vào so với dịch nổi theo tỉ lệ khác nhau (ethanol:dịch nổi lần lƣợt là 1:1; 1,5:1; 2:1; 2,5:1; 3:1). Thời gian tủa bằng ethanol đƣợc khảo sát sau khi xác định đƣợc thể tích ethanol bổ sung vào. Các mức thời gian khảo sát là: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ. Lƣợng EPS kết
Môi trƣờng dinh dƣỡng
Dịch lên men từ chủng Lb. fermentum
Dịch nổi chứa EPS
EPS tủa
Thẩm tích kết tủa ở 4ºC trong 24 – 48 giờ
tủa thu đƣợc sau khi ly tâm tiếp tục đƣợc hòa tan vào nƣớc cất khoảng 50oC và xác định hàm lƣợng bằng phƣơng pháp phenol-sulfuric.
2.3.6 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng EPS bằng phenol-sulfuric
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thuỷ phân polysaccharide thành
monosaccharide, monosaccharide tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng λ = 490 nm. Xây dựng đƣờng chuẩn D- glucose sau đó đo mẫu thực và tính ra lƣợng EPS.
Các bước xây dựng đường chuẩn glucose:
Cân chính xác 0,2500 (g) D-glucose cho vào bình định mức 250 ml rồi định mức bằng nƣớc cất ta đƣợc dung dịch A. Nhƣ vậy, nồng độ dung dịch D-glucose là 1 mg/ml (1000 μg/ml).
Lấy 50 ml dung dịch A pha thành 500 ml thu đƣợc dung dịch D- glucose có nồng độ 100 μg/ml (dung dịch B).
Lần lƣợt lấy 0 ml; 25 ml; 50 ml; 75 ml; 100 ml dung dịch B pha thành 100 ml thu đƣợc dung dịch D-glucose có nồng độ là 0 μg/ml; 25 μg/ml; 50 μg/ml; 75 μg/ml; 100 μg/ml.
Lấy 125 ml dung dịch A pha thành 500 ml thu đƣợc dung dịch D - glucose có nồng độ 250 μg/ml (dung dịch C).
Lần lƣợt lấy 50 ml; 60 ml; 70 ml; 80 ml dung dịch C pha thành 100 ml thu đƣợc dung dịch D-glucose có nồng độ là 125 μg/ml; 150 μg/ml; 175 μg/ml; 200 μg/ml.
Mỗi mẫu lấy 1 ml cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch phenol 5%, 5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
Đặt các ống nghiệm vào cốc nƣớc sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bƣớc sóng 490 nm, thu đƣợc các giá trị độ hấp thụ quang
Bảng 2.2: Nồng độ của các dung dịch dùng trong xây dựng đƣờng chuẩn D-glucose STT Dung dịch phenol 5% (µl) Dung dịch H2SO4 đậm đặc (µl) Dung dịch D-glucose (µl) Nồng độ D-glucose (µl/ml ) OD (490nm) 1 1000 5000 1000 0 0 2 1100 5000 1000 25 0.182 3 1200 5000 1000 50 0.405 4 1300 5000 1000 75 0.579 5 1400 5000 1000 100 0.776 6 1500 5000 1000 125 0.965 7 1600 5000 1000 150 1.193 8 1700 5000 1000 175 1.382 9 1800 5000 1000 200 1.602 Vẽ đồ thị y = ax + b và tính giá trị R2 Trục x là nồng độ D-glucose (mg/ml)
Trục y là OD của dung dịch hỗn hợp trong các ống nghiệm
Nhập số liệu các giá trị x, y vào máy tính, sử dụng phần mềm excel để dựng đƣờng chuẩn D-glucose, đồng thời đƣa ra giá trị R2
của đƣờng chuẩn.
Phƣơng trình đƣờng chuẩn D-glucose:
Y = 0.008x – 0.0111 ( R2 = 0.9995 ) Từ các kết quả thu đƣợc, xây dựng đƣờng chuẩn D-glucose
Hình 2.3.6: Phƣơng trình dƣờng chuẩn D-glucose
Áp dụng vào ống nghiệm:
1. Cho 1 ml dung dịch có chứa EPS đƣợc trộn với 1 ml phenol 5% và 5 ml H2SO4 đậm đặc
2. Hỗn hợp đem votex và hấp cách thủy 2 phút. Làm nguội về nhiệt độ phòng trong 30 phút.
3. Sau đó, dung dịch hỗn hợp đƣợc đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 490 nm bằng máy đo quang.
4. Tính kết quả:
Dựa vào đồ thị đƣờng chuẩn D-glucose
Y = 0.008x – 0.0111 (R2 = 0.9995)
Phƣơng trình tính tốn hàm lƣợng protein đƣợc viết nhƣ sau: X (µl/ml) =
Trong đó: X : hàm lƣợng EPS có trong mẫu phản ứng ∆Abs : độ hấp thụ quang của mẫu ở 490 nm y = 0.008x - 0.0111
2.3.7 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford
Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu
cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bƣớc sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dƣơng và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bƣớc sóng 595 nm.
Tiến hành: Chuẩn bị các ống nghiệm sạch, dụng cụ hóa chất
Các bƣớc xây dựng đồ thị đƣờng chuẩn BSA nhƣ sau: 1. Chuẩn bị dung dịch BSA chuẩn (0.25mg/ml);
2. Chuẩn bị các dãy ống nghiệm sạch đánh số thứ tự từ 1 đến 6; 3. Dùng pipet tự động để lấy các dung dịch vào ống nghiệm theo
thành phần nhƣ bảng dƣới:
4. Giữ các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng, cứ 1 phút lắc 1 lần, để trong 5 phút;
5. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch ở bƣớc sóng 595 nm.
Bảng 2.3: Nồng độ của các dung dịch dùng trong xây dựng đường chuẩn BSA
STT BSA (0.25 mg/ml) (µl) H2O (µl) Dung dịch Bradford (µl) Nồng độ BSA (µl /ml) OD (595 nm) 1 0 1000 5000 0 0 2 100 900 5000 25 0,174 3 200 800 5000 50 0,351 4 300 700 5000 75 0,605 5 400 600 5000 100 0,769 6 500 500 5000 125 0,899 6. Vẽ đồ thị y = ax + b và tính giá trị R2: Trục x là nồng độ BSA (mg/ml)
Nhập số liệu các giá trị x, y vào máy tính , sử dụng phần mềm excel để dựng đƣờng chuẩn BSA, đồng thời đƣa ra giá trị R2 của đƣờng chuẩn.
Phƣơng trình đƣờng chuẩn BSA:
Y = 0.0075x – 0.0012 (R2 = 0.9957)
Hình 2.3.7: Đồ thị đƣờng chuẩn BSA
Áp dụng vào ống nghiệm nhƣ sau:
1. Cho 500 µl dung dịch protein pha lỗng vào 500µl nƣớc cất, bổ sung 5ml dung dịch Bradford
2. Hỗn hợp phản ứng giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, cứ 1 phút lắc 1 lần 3. Sau đó dung dịch hỗn hợp đƣợc đo hấp thụ quang phổ ở bƣớc sóng 595
nm bằng máy đo quang 4. Tính kết quả
Dựa vào đồ thị đƣờng chuẩn BSA – Bradford: Y = 0.0072X – 0.0013; R2 = 0.996
Phƣơng trình tính tốn hàm lƣợng protein đƣợc viết nhƣ sau: X (µl/ml) =
x D y = 0.0075x - 0.0012
Trong đó:
X : hàm lƣợng protein có trong mẫu phản ứng ∆Abs : độ hấp thụ quang của mẫu ở 595 nm D : hệ số pha loãng của protein.
2.3.8 Phƣơng pháp phân tích thành phần monosaccharide của EPS bằng sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc: Sắc kí lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật sắc ký đƣợc dùng
để tách các chất trong hỗn hợp. Phƣơng pháp sắc ki lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp thụ, thƣờng là silicagel, aluminium oxid, hoặc xenlulozo đƣợc phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tich đƣợc hòa tan trong một dung mơi thích hợp. Dung mơi di chuyển lên bản sắc kí bởi hiện tƣợng mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thƣờng dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh và độ tan khác nhau trong dung môi. Các hợp chất đƣợc tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có đƣợc chỗ liên kết với pha tĩnh. Kết quả, ta thu đƣợc một sắc kí đồ trên lớp mỏng.
Đại lƣợng đặc trumg cho mức độ di chuyển của chất khử và khoảng dịch chuyển của dung môi là hệ số lƣu R.
o a: khoảng cách từ diểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm
o b: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đƣờng đi của vết, tính bằng cm
o Rf: chỉ có giá trị từ 0 đến 1: (0 < Rf < 1)
Tiến hành:
Chuẩn bị bình: binh đƣợc rửa sach, sấy khơ. Sau đó rót một lƣợng vừa đủ hỗn hợp dung môi vào binh. Hỗn hợp dung môi đƣợc dùng là n-butanol:
etanol: nƣớc (2: 1: 1, v/v), lắc nhẹ để hỗn hợp đƣợc trộn đều, đậy kín nắp bình tránh để dung môi bay hơi.
Thuỷ phân: EPS tinh khiết (2 mg) đƣợc thủy phân trong 250 μl axit trifluoroacetic 2 M (TFA) ở 100ºC trong 5 giờ. TFA dƣ thừa đƣợc loại bỏ bằng cách làm bay hơi quay, và dịch thủy phân đƣợc rửa kỹ bằng nƣớc, và đông khô. Bột đông khơ này đƣợc hịa tan trong 100μl nƣớc, và một lƣợng 5μl đƣợc sử dụng cho sắc ký lớp mỏng. Quá trình phát triển đƣợc thực hiện hai lần trên tấm TLC silica gel (20 x 20 cm) với dung môi khai triển n- butanol: etanol: nƣớc (2: 1: 1, v/v). Carbohydrate đƣợc làm hiện màu bằng cách làm nóng tấm TLC sau khi phun axit sulfuric 5% (v/v) trong etanol. Glucose, galactose và mannose đƣợc sử dụng làm monosaccharide tiêu chuẩn…
Chấm chất phân tích lên bản mỏng: lƣợng chất đƣợc đƣa lên bản mông ảnh hƣởmg lớn đến vị trí số R. Lƣợng chất quá lớn sẽ lâm cho vết sắc kí lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số R gần nhau sẽ bị chồng lấp. Lƣợng mẫu thông thƣờng cần đƣa lên bản mỏng là 0.1-50 mg ở dạng dung dịch ete, clroform, nƣớc, hay dung mơi thích hợp khác. Thể tích dung dịch từ 0,001-0,005 ml (đƣa mẫu lên bản mỏng dƣới dạng điểm). Có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng 1 vị tri và sấy khô sau mỗi lần chấm. Đƣờng xuất phát phải cách mép dƣới của bản mỏng 1,5-2 cm và cách bề mặt dung mơi từ 0,8-1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đƣờng kinh 2-6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bia phải cách bờ bên của bản mông it nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ.
Các bƣớc thực hiện chấm chất phân tích lên bản mỏng nhƣ sau: Sử dụng micropipette 0,5- 10 µl để chấm mẫu.
Chuẩn bị tấm bản mỏng: tấm bản mỏng thƣơng mại 20x20 cm, dùng kéo cắt bản với kích thƣớc 10x5 cm, tấm bản phải vừa bình giải ly. Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát .
Chuẩn bị dung dịch mẫu: Chấm trực tiếp mẫu lên bản mỏng một cách thận trọng, tránh không cho làm rây bề mặt của lớp mỏng. Mỗi vết chấm trên bản không chứa nhiều hơn 5 µl mẫu. Mỗi bản chấm 1 mẫu dịch EPS, 1 mẫu dịch glucose chuẩn, 1 mẫu dịch mantose, 1 mẫu dịch chuẩn galactose.
Sấy nhẹ để khô các vết, nhúng bản vào dung dịch giải ly dung môi isopropylacohol: ethylacetate: nƣớc (3:1:1).
Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau khi bình cho dung mơi vào bình, ta đặt tấm mỏng vào bình khai triển để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dƣới đáy bình. Cạnh đáy của tấm lớp mỏng ngập trong dung môi giải ly khoảng 1cm. Các vết mẫu không đƣợc ngập trong dung mơi giải ly, vì nhƣ thế dung mơi sẽ khuyếch tán vào trong dung môi.
Hiện hình các vết sau khi giải ly: dùng phƣơng pháp hóa học với thuốc thử hiện hình là N-(1-naphthyl)-ethylen diamine. Hịa 3g N-(1- naphthyl)-ethylen diamine trong 800ml methanol. Bổ sung 50ml H2SO4, bổ sung 150ml methanol để đạt thể tích là 1 lít.
Đánh giá bằng cách quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf.
2.3.9 Phƣơng pháp xử lý thống kê
Số liệu thí nghiệm đƣợc xử lý bằng phần mềm SPSS 26. Sử dụng phân tích phƣơng sai một yếu tố ANOVA để chỉ ra có hay khơng sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình với mức ý nghĩa (p<0,05). Dựa vào giá trị Sig trong bảng ANOVA để biết có hay khơng sự khác biệt giữa các giá trị trung bình:
+ Sig ≤ α (0,05): có sự khác biệt giữa các giá trị trung bình. + Sig > α: khơng có sự khác biệt giữa các giá trị trung bình.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ
3.1 Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng thu nhận EPS 3.1.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp EPS
Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy ban đầu lên khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. Fermentum BR11 đã đƣợc khảo sát ở các mức nhiệt độ lần lƣợt là 20, 24, 28, 32, 36, 40 và 44oC trong 48 giờ.
Hình 3.1: Ảnh hƣởng của nhiệt độ ni cấy lên q trình sinh tổng hợp EPS
Kết quả từ Hình 3.1 cho thấy, khả năng sinh trƣởng và tổng hợp EPS của chủng Lb.fermentum BR11 đạt tích cực trong khoảng nhiệt độ 35–40oC. Hàm lƣợng EPS đạt giá trị cao nhất là 441,204 µg/ml ở 36o
C. Ở nhiệt độ 40oC, lƣợng EPS tạo thành đã giảm nhiều so với mức nhiệt cực đại (36oC), sau đó tiếp tục giảm khi tăng nhiệt độ lên 48o
C. Sự sai khác về lƣợng EPS thu đƣợc đã không xảy ra ở hai mức nhiệt 30o
C và 44oC khi phân tích phƣơng sai (p >0,05). Ở các mức nhiệt độ thấp (30oC) và nhiệt độ cao 44oC, khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng Lb.fermentum BR11 đều ở mức thấp. Điều đó
205,215 242,357 337,250 422,321 441,204 432,875 302,876 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000 20 24 28 32 36 40 44 H à m l ư ợ n g EP S (u g/m l)
cho thấy rằng, chủng vi khuẩn này ƣa ấm. Khoảng nhiệt độ trung bình sẽ kích thích cho q trình tổng hợp EPS tốt hơn.
Quá trình sinh tổng hợp HoPS và HePS có liên quan đến các enzyme đặc hiệu ở bên trong hoặc bên ngoài tế bào vi khuẩn. Lƣợng sản phẩm EPS tạo thành có lẽ liên quan đến tác động của nhiệt độ tới các phản ứng do enzyme xúc tác. Khả năng tạo thành EPS bị hạn chế ở mức nhiệt thấp dƣới 36oC có thể đƣợc lý giải rằng ở mức nhiệt này, khả năng chuyển hóa các chất dinh dƣỡng trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn diễn ra chậm chạp, gây nên sự ức chế hoạt động của các hệ enzyme.
3.1.2 Ảnh hƣởng của thời gian đến sinh tổng hợp EPS
Để khảo sát quá trình thu nhận EPS hiệu quả từ chủng Lb. Fermentum
BR11, thực hiện lấy mẫu tại các thời điểm 0, 12, 24, 36, 48, 60 và 78 giờ để
xác định thời điểm kết thúc quá trình lên men nhằm tận thu lƣợng sản phẩm cao nhấttrong môi trƣờng.
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến sinh trƣởng và tổng hợp EPS Thời gian lên men (h) Sinh trƣởng (OD. 600nn) Hàm lƣợng EPS (ug/ml) 12 1,12 0,00 18 1,22 22,12 24 1,35 188,35 30 1,57 225,78 36 1,99 277,90 42 2,29 298,32 48 2,60 341,78 54 3,15 370,45 60 3,52 405,65 66 3,90 448,35 72 3,95 445,42 78 3,81 452,32
Kết quả trên Bảng 3.1 cho thấy sau 48 giờ lên men, quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. fermentum BR11 đạt đƣợc là cao nhất với hàm lƣợng
EPS 445,42 µg/ml. Từ 12 đến 36 giờ lên men, lƣợng EPS tạo ra có tăng
nhƣng chậm. Sau khi đạt cực đại tại 48 giờ, lƣợng EPS đo đƣợc giảm mạnh sau 72 giờ lên men. Kết quả phân tích thống kê cho thấy sự sai khác lớn không xảy ra với lƣợng EPS tạo thành bởi chủng Lb.fermentum BR11 giữa
các thời điểm 66 đến 72 giờ. Nguyên nhân của sự tăng giảm trong quá trình lên men chủng có lẽ liên quan đến các giai đoạn trong quy luật phát triển của