Tất cả mầm bệnh sau khi được xác định bằng PCR đơn mồi đều được tiến hành khẳng định bằng phân tích giải trình tự gen (Sequencing). Xét nghiệm này được tiến hành trên hệ thống Seq 8800 (Beckman Coulter, Mỹ) tại Khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện TƯQĐ 108. Quy trình kỹ thuật được tiến hành như sau:
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự:
a. Chuẩn bị ống 0.5ml (đã khử trùng, số lượng ống tương đương với số lượng mẫu cần tinh sạch).
b. Thêm vào mỗi ống 0.5ml hỗn hợp dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) với các thành phần và thể tích như sau:
3M Natri Acetate pH 5.2 2 µl
100mM Na2EDTA pH 8.0 2 µl
20mg/ml Glycogen (Cung cấp kèm theo DTCS Quick Start kít)
0.3µl
c. Chuyển toàn bộ dung dịch phản ứng PCR giải trình tự vào ống 0.5ml đã có hỗn hợp Stop Solution và vortex trong vài giây.
31
d. Thêm vào mỗi ống 60 µl Ethanol lạnh 95% (được bảo quản trong tủ lạnh – 200C), vortex và ly tâm trong 15 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi ở phía trên (giữ lại ADN tủa ở đáy ống).
e. Rửa ADN tủa bằng cách thêm 200 µl Ethanol lạnh 70% (bảo quản trong tủ lạnh -200C, không dùng cồn để quá lâu) và ly tâm với tốc độ 14000 vòng/ phút trong 2 phút ở 40C. Cẩn thận hút bỏ dung dịch.
f. Quay khô chân không trong vòng 10 phút hoặc cho đến khô.
g. Hoà tan ADN tủa vào trong 40ul SLS (cung cấp kèm theo DTCS Quick Start kít)
Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0.2ml hoặc đĩa 96 với các thành phần như bảng sau: Thành phần phản ứng PCR cho phản ứng giải trình tự:
Thành phần phản ứng Thể tích phản ứng (µL) DTCS (Dye Terminator Cycle
Sequencing) 6
Mồi - F 0.5
Khuôn ADN 1.5
H2O 7
Tổng thể tích phản ứng 15
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sequencing: 960C ---20 giây
550C --- 20 giây 30 chu kỳ 600C --- 4 phút
40C ---
2.4.9. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi a. Đánh giá độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi.