thấp dưới ngưỡng phát hiện, khi đó phương pháp này sẽ không thể phát hiện được, gây nên hiện tượng âm tính giả. Ở một khía cạnh khác, các giả thuyết gần đây cho rằng sự tiến hoá hình thành tế bào nhân chuẩn (bao gồm cả tế bào người) là kết quả
của sự lai ghép giữa nhóm archaeal với proteobacterial hoặc cyanobacterial prokaryote, điều này có nghĩa sẽ tồn tại các trình tự tương đồng có tính bảo tồn cao
giữa các nhóm tế bào vi khuẩn, nấm men và tế bào động vật có vú bao gồm cả tế bào người [16], [29], [33], [38]. Vì thế nếu phản ứng PCR sử dụng các chuỗi mồi có trình tự bắt cặp và khuếch đại các khu vực bảo tồn cao (thuật ngữ tiếng Anh là highly conserved motif), hiện tượng dương tính giả sẽ xuất hiện. Để hạn chế các hiện tượng âm tính giả do độ nhạy kỹ thuật thấp và dương tính giả do bắt cặp của mồi vào khu vực bảo tồn giữa các loài, người ta có thể sử dụng các Kit loại bỏ ADN người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn sau đó mới thực hiện các phản ứng PCR đặc hiệu [16].
Thông thường một Kit loại bỏ ADN người thường bao gồm các thành phần i) giúp phá vỡ tế bào máu tổng số đồng thời gây đứt gãy ADN người, thông thường các hoá chất này sẽ không làm tổn thương tế bào vi khuẩn ii) thu nhận và tách đặc hiệu ADN vi khuẩn. Hiện nay Kít làm giàu ADN vi khuẩn do hãng MolYsis, có thể cho hiệu quả làm giàu 40000 lần nhưng giá thành rất cao (khoảng £10/lần tách) [31] vì thế rất khó được chấp nhận ở những nước thu nhập thấp trong đó có Việt Nam. Để khắc phục những khó khăn trên, chúng tôi thiết lập phương pháp loại bỏ ADN người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn: Ý tưởng kỹ thuật này là một điểm mới chưa từng được triển khai tại bất cứ phòng thí nghiệm hay trung tâm chẩn đoán nào ở nước ta. Các bệnh phẩm máu ngoại vi hoặc các dịch cơ thể có nghi ngờ mang vi khuẩn được rửa bằng dịch phá bạch cầu Mammalian cellular lysis (MCLB1) [14], [31], nhờ đó loại bỏ các thành phần ức chế phản ứng PCR như heparin, huyết sắc tố.
1.3.3.2. Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN người ”làm giàu” ADN vi khuẩn khuẩn
Mục đích: tạo ra một loại dung môi có khả năng phá bỏ tế bào người nhưng bảo tồn được tế bào vi khuẩn trong một thời gian nhất định.
19
Cơ sở lý thuyết: Màng tế bào người và màng tế bào vi khuẩn có sự khác nhau về thành phần cấu tạo: Màng tế bào người yếu ớt, chủ yếu là lipid vì thế dễ bị phá hủy bởi dung môi kỵ nước hoặc dung môi phân cực (SDS, Triton X, NP40 chaps… Mặt khác các sợi nhiễm sắc thể là các đại phân tử dễ bị đứt gãy trong các điều kiện kiềm tính cao, pH cao. Trong khi đó, đối với vi khuẩn, màng tế bào được cấu tạo chủ yếu là peptidoglycan, cũng có lipid nhưng thành phần không chiếm ưu thế, đặc biệt có glycan (gluxit), giúp vi khuẩn chống chịu được các điều kiện hóa chất nghiệt ngã (pH, chất tẩy rửa). Chính vì thế, chúng tôi sử dụng các chất tẩy rửa và các chất phân cực như SDS, Triton X-100, NP4, Chaps…và sử dụng các buffer có bước nhảy pH kiềm tính [14], [31]. Sau khi thử nghiệm thu được dung môi cần tìm, dung môi này sẽ loại bỏ được ADN người trong khoảng thời gian nhất định, chúng tôi sử dụng dung dịch axit yếu để trung hòa, khi đó pH trở về pH trung tính. Ở pH này tế bào vi khuẩn sẽ không bị ảnh hưởng. Quá trình ly tâm tiếp theo sẽ thu được tế bào vi khuẩn lắng cặn ở dưới, phần phía trên là các nhiễm sắc thể của tế bào người bị đứt gãy sẽ được loại bỏ. Quá trình tách chiết ADN vi khuẩn sẽ được tiến hành theo quy trình tách chiết thông thường hoặc sử dụng các kit tách chiết ADN thương mại.
Hiệu quả loại bỏ ADN người sẽ được đánh giá bằng việc định lượng nồng độ gen betaglobin có trong mẫu tách chiết có xử lý và không qua xử lý loại bỏ ADN người và có so sánh giữa dung môi tự chế với kit loại bỏ ADN người Molysis.
20
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các loài vi khuẩn được phân lập và nuôi cấy do Khoa Vi sinh vật tại Bệnh viện TƯQĐ 108 cung cấp.
-Nhóm vi khuẩn chứng dương: nhằm kiểm tra và đánh giá bộ mồi thiết kế, độ nhạy kỹ thuật là ADN được tách chiết từ các loài vi khuẩn thuộc họ
Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp, Proteus mirabilis, Enterobacteriaceae sp) đã biết nồng độ và được pha loãng
nồng độ từ 104 đến 100 CFU/ml).
-Nhóm chứng âm: nhằm kiểm tra độ đặc hiệu của các bộ mồi thiết kế có bắt cặp chéo với các loại ADN người hoặc ADN của các loài vi khuẩn khác gây hiện tượng dương tính giả hay không, bao gồm: ADN được tách chiết từ các
loài vi sinh vật khác không thuộc họ Enterobacteriaceae: Staphylococcus aureus; Streptococcus pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Acinetobacter baumanii…; ADN được tách chiết từ mẫu máu người khỏe mạnh; ADN virut
viêm gan B; HSV, EBV và nấm.
Nhóm mẫu bệnh phẩm máu thử nghiệm: nhằm đánh giá hiệu quả sử dụng bộ sinh phẩm tạo ra là sinh phẩm loại bỏ ADN người làm giàu ADN vi khuẩn và phản ứng PCR đa mồi đã tối ưu trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Kết quả PCR đa mồi được đối chiếu song song với kết quả nuôi cấy vi sinh. Nhóm này là mẫu ADN tách chiết từ bệnh phẩm máu được thu thập từ các bệnh nhân nghi ngờ NKH.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Tháng 01/2014 – 12/2014
- Địa điểm nghiên cứu: Khoa Sinh học phân tử – Khoa Vi sinh – Bệnh viện TƯQĐ
21 2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.3.1. Các hoá chất, sinh phẩm
Các hoá chất, sinh phẩm, trang thiết bị được sử dụng tại Khoa Sinh học phân tử và Khoa xét nghiệm Vi sinh vật, Bệnh viện TƯQĐ 108.
Bảng 2. Danh mục các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hoá chất Hãng cung cấp
Molysis kit VH Bio
Tris-Base A Applied BioSciences (Mỹ)
Protease K Sigma (Mỹ)
Agarose Fermentas (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thang chuẩn DNA ladder Fermentas
EDTA Applied BioSciences
Agarose Merck (Đức)
NaCl Sigma (Đức)
NH4Cl BioBasis
Sodium Dichloroisocyanurate Sigma (Mỹ)
NaOH Merck (Đức)
Tris-HCl Merck (Đức)
SDS BioBasic
Triton X-100 Sigma (Mỹ)
Sodium carbonate Merck (Đức)
Hotstart DNA polymerase Themo (Mỹ0
2.3.2. Các máy và thiết bị chính
Bảng 3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Máy sequencing CEQ 8800 Beckman
Máy đo pH model 530 Corning
Cân điện tử Sartovius
Máy soi gel & chụp ảnh Gel-Doc Dolphin
22
Máy PCR 9700 Applied BioSystems
Máy realtime-PCR Applied BioSystems
Máy đo quang phổ DU 730 Beckman
Máy ly tâm lạnh Eppendorf
Máy block nhiệt Eppendorf
Bộ pipets Eppendorf
Máy khuấy từ gia nhiệt model RCT IKA 2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.Sơ đồ nghiên cứu
23
Hình 3. Mô hình nghiên cứu thiết lập phương pháp loại bỏ ADN người (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.2. Thiết kế các cặp mồi sử dụng trong PCR và PCR đa mồi Nguyên tắc thiết kế mồi Nguyên tắc thiết kế mồi
`- Các cặp mồi đơn được thiết kế bắt cặp đặc hiệu vào các khu vực ít thay đổi nhất cho mỗi loài như các gen mã hóa cho protein độc tố đặc trưng của loài.
- Các cặp mồi không bắt cặp chéo với nhau (khi thực hiện phản ứng đa mồi) và không bắt cặp với genome ADN người.
- Ngoài các bộ mồi đơn đặc hiệu cho mỗi loài, chúng tôi còn thiết kế một cặp
mồi bắt vào khu vực ít thay đổi nhất phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae .
- Sự khác biệt về kích thước giữa các đoạn sản phẩm tạo ra nằm trong khoảng 80 đến 100 bp, nó đảm bảo cho việc các đoạn sản phẩm có thể dễ dàng được phân biệt khi điện di trên gel agarose 1,5-2,5%.
24
Các cặp mồi đặc hiệu cho phát hiện các vi khuẩn trong đề tài được sử dụng cho phản ứng PCR nhân các đoạn gen đích có trình tự tương ứng:
(A)
(B)
Hình.4. Hình ảnh mô phỏng cho quá trình thiết kế mồi phát hiện vi khuẩn gây bệnh
(A) Hình ảnh blast trình tự mồi với các trình tự gen của vi khuẩn E. coli đã công bố trên ngân hàng gen
(B) - Sơ đồ thiết kế mồi K. pneumoniae sử dụng phần mềm Vector NTI 11.0
Các cặp mồi đặc hiệu cho phát hiện các vi khuẩn trong đề tài được sử dụng cho phản ứng PCR nhân các đoạn gen đích có trình tự tương ứng (Bảng 4):
25
Bảng.4. Trình tự mồi trong phản ứng PCR đa mồi phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh
Tên tác nhân Tên mồi Trình tự gen đích
Kích thước (bp) E.coli S-uidA-F 5’GTCGCGAGTGAAGAT CCCTTTC-3’ S-uidA 773 S-uidA-R 5’GCATTAATGGACTGG ATTGGGGC-3’ Proteus mirabilis ureR- PM-F 5’TCACAGTCACCACTA ATCTCACGTTGA-3’ UreR 406 ureR- PM-R 5’AGATGAGTGATCGCC TGATTTTTTGGC-3’ K. pneumoniae Kp Ald-F 5’CCGGGGGAGAATATC CTTGTCTT-3’ aldehyde dehydrogenase 324 Kp Ald- R 5’CGCCGCAGCGGCCAT AATTTTT-3’ Salmonella sp NTS-F 5’AGCCTGTCGCTGTTG ACCCAGAAT-3’ flagellin gene 254 NTS-R 5’CGCACACGCTGCAGG TTGTTGTT-3’ Enterobacteriac eae sp Ent-F 5’GTTGTAAAG(C/T)ACT TTCAG(T/C)GG(T/G)GA GGAA-3’ 16S ribosomal RNA gene 424 Ent-R 5’GCCTCAAGGGCACAA CCTCCAA-3’ Gen nội chuẩn β globin
F 5’AGAAGAGCCAAGGA CAGGTACG-3’ hemoglobin beta globin chain (HBB) gene 180 β globin R 5’TGCTAGTGAACACAG TTGTGTCAGA-3’
26
(a)
(b) Hình 5. Hình ảnh mô phỏng kết quả điện di các sản phẩm PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh
Hình a: là bộ mồi nội chuẩn Ent xác định họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội chuẩn betaglobin;
Hình b là bộ mồi phát hiện một số tác nhân vi khuẩn cụ thể thuộc họ Enterobacteriaceae
2.4.3. Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu
Chúng tôi tham khảo tài liệu của Sambrook J. và cs năm 1989 [36], quy trình tách như sau:
-Chủng vi sinh
-Ly tâm 12000 rpm/5 phút, thu cặn -Thêm 200 µl TE 1X và trộn đều -Ủ 950C trong 10 phút
-Phá siêu âm trong 10 phút -Ly tâm 13200 rpm/5 phút
27 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.4. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm
Với những hiểu biết về nguyên lý và cơ chế loại bỏ ADN người “làm giàu” ADN vi khuẩn chúng tôi đã tiến hành các bước xử lý ADN và tách chiết như sau:
1. 1000 µl máu tổng số + 1200µl dịch phá bạch cầu MCLB1, lắc 1200 vòng/ phút ở nhiệt độ 37oC trong vòng 3 phút
2. Bổ sung 2ml 1M Tris-HCl, pH4 lắc đều 3. Ly tâm 5000 G trong 05 phút
4. Loại bỏ pha trên
5. Bổ sung 900µl nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), vortex đều trong 1 phút 6. Ly tâm 5000 G trong 2 phút
7. Loại bỏ pha trên thu cặn. Đến bước này khối hồng cầu, bạch cầu đã bị vỡ và bị loại bỏ gần như hoàn toàn
8. Thêm 300 µl NaOH 200 mM + SDS 2% 9. Ủ 950 C trong 5 phút
10.Trung hòa bằng 250 µl Tris-HCL 1M pH 4.2-4,6
11.Thêm 400 µl dung dịch phenol, chloroform isoamylalchol 25:24:1 (lắc đều) 12.Ly tâm tốc độ tối đa trong 20 phút
13.Thu dịch nổi
14.Thêm 0.7 V isopropanol
15.Ly tâm tốc độ tối đa trong 30 phút 16.Thu tủa
17.Thêm 700 µl Cồn 75% rửa 2 lần ( ly tâm tốc độ 13,200 rpm/5 phút) 18.Làm khô bằng máy speedvac trong 5 phút
28
20. Đo OD (ng/µl). Thông thường nếu quá trình loại bỏ ADN người thành công, nồng độ ADN bệnh phẩm sẽ rất thấp (dưới 10ng/ml) thậm chí không thể xác định được nồng độ
2.4.5. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ
Đây là phương pháp cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu.
Nguyên tắc dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào mối tương quan: 1 đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ:
+ 50 µg/mL cho một dung dịch ADN sợi đôi
+ 40 µg/mL cho một dung dịch ADN hay RNA sợi đơn Hàm lượng ADN được xác định bằng công thức:
[ADN] = OD260 × 50 × X (µg/mL)
Trong đó X là số lần pha loãng từ dung dịch ADN gốc ban đầu.
Ngoài ra phương pháp này còn có thể xác định được độ sạch mẫu phân tích dựa trên tỉ số OD260/OD280. Nếu tỉ số này > 1,8 thì dung dịch ADN đem đo được xem là sạch.
2.4.6. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi
Để có được kết quả PCR như mong muốn đảm bảo về độ nhạy và độ chính xác của kỹ thuật bắt buộc ta phải có các phương pháp tối ưu hoá phản ứng PCR và PCR đa mồi. Do vậy, trong nghiên cứu này để tìm được một quy trình chuẩn và nồng độ tối ưu nhất cho phản ứng PCR và PCR đa mồi chúng tôi lần lượt thử các thành phần phản ứng với các nồng độ khác nhau dựa trên quy trình PCR chuẩn.
- Tối ưu dung dịch đệm, nồng độ MgCl2 (Mg2+ được thử ở những nồng độ khác nhau từ 1,5 đến 4 mM, nồng độ mồi, nồng độ enzyme ADN Polymerase và
29
nồng độ ADN khuôn. Sau mỗi lần thực hiện phản ứng với mỗi nồng độ thành phần tham gia phản ứng, kết quả sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose. Băng sản phẩm PCR được lựa chọn là những băng đậm nét nhất, đặc hiệu đúng kích thước cần nghiên cứu và không có sản phẩm phụ. Các thông số về nồng độ của các thành phần tham gia phản ứng sẽ được lựa chọn cho các lần tiến hành phản ứng tiếp theo tương ứng với băng sản phẩm PCR rõ nét và đặc hiệu. Đối với chu trình nhiệt cũng lần lượt thử với các nhiệt độ biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi khác nhau dựa trên đặc điểm, thành phần mồi, kích thước đoạn gen đích cần khuếch đại và dựa vào chu trình chuẩn của phản ứng PCR [15], [36], [37].
- Dựa vào nhiệt độ gắn mồi của từng cặp ta tìm được một nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất cho từng bộ mồi đơn, nhằm mục đích ở nhiệt độ đó hiệu quả gắn mồi khuếch đại đoạn gen quan tâm tốt nhất. Do vậy, khi thiết kế mồi nhằm đạt hiệu quả phản ứng PCR đa mồi cao nhất chúng tôi đã thiết kế các mồi có nhiệt độ gắn mồi gần giống nhau. Theo các tài liệu nghiên cứu và thực tế chúng tôi tiến hành khảo sát các nhiệt độ gắn mồi biến thiên trong khoảng ± 50C so với nhiệt độ gắn mồi lý thuyết đó là nhiệt độ nóng chảy của mồi và nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR. Nhiệt độ nóng chảy của mồi được tính bằng công thức Tm = 2 x (A+T) + 4 x (G+C). Tuy nhiên nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi từ 3 đến 50C [15], [36], [37] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.7. Phương pháp điện di
Điện di ADN là một phương pháp đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử vì đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sát được các phân tử ADN bằng mắt thường. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel Agarose. Sản phẩm ADN được điện di trên gel Agarose sẽ tạo thành các giải băng khác nhau. ADN mang điện tích âm di chuyển từ cực âm sang cực dương, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử, dạng cấu trúc ADN, nồng độ Agarose, điện thế, nhiệt độ và thành phần chất điện di. Dựa vào kích thước từng đoạn gel được nghiên cứu và khả năng phân tách của gel Agarose, chúng tôi sử
30
dụng kỹ thuật điện di trên gel Agarose 2% nhằm mục đích xác định khoảng kích thước các băng khi được điện di cùng thang ADN chuẩn.
- Chuẩn bị gel Agarose 2 %:
- Quá trình diện di và kiểm tra sản phẩn PCR:
+ Điện di thực hiện theo phương nằm ngang với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100 V, dòng 60 - 80 mA, trong thời gian khoảng 40 phút.
+ Sau khi nhuộm gel được quan sát và chụp ảnh bằng máy soi gel Dolphin-