32
Để đánh giá độ nhạy của PCR đa mồi theo công thức tính (Se) chúng tôi tiến hành trên các mẫu ADN được tách chiết từ các loài vi khuẩn chứng dương thuộc họ
Enterobacteriaceae như E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, Salmonella sp,..Mặt
khác, trong nội dung đánh giá độ nhạy kỹ thuật thì việc thực hành trên lâm sàng cần xác định độ nhạy kỹ thuật ở nồng độ vi khuẩn tối thiểu trong mẫu bệnh phẩm. Do vậy, chúng tôi tiến hành pha loãng nồng độ của các chủng vi sinh theo tỷ lệ giảm dần từ 104 CFU/ml đến 100 CFU/ml vào trong máu người khỏe mạnh rồi tiến hành tách chiết ADN vi sinh vật và tiến hành PCR.
b. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi.
Một trong những yêu cầu quan trọng khác của chẩn đoán vi khuẩn từ máu ngoại vi là phải kiểm soát được hiện tượng bắt cặp của mồi với ADN gen người. Mặc dù kết quả phân tích trên các thuật toán do chúng tôi sử dụng trong thiết kế mồi đều loại bỏ khả primer-dimer và hiện tượng bắt chéo của mồi vào gen người nhưng để khẳng định tính đúng đắn trong thực hành chẩn đoán chúng tôi tiến hành đánh giá độ đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi trên các mẫu ADN chứng âm[31].Tương tự như việc đánh giá độ nhạy phương pháp, đối với việc tính độ đặc hiệu chúng tôi tiến hành như sau: Đánh giá độ đặc hiệu theo công thức (Sp) bằng cách PCR đa mồi trên các mẫu ADN vi khuẩn chứng dương, ADN từ các loài vi
khuẩn khác không thuộc họ này (Staphylococcus aureus; Streptococcus pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Acinetobacter baumanii…), ADN người,
ADN virut, ADN nấm. Công thức tính độ nhạy và độ đặc hiệu của cấy khuẩn và PCR đa mồi được tính theo công thức sau:
Bảng 5. Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp
PCR (+) PCR (-) Tổng
Nuôi cấy (+) a b a + b
Nuôi cấy (-) c d c + d
33
Se = (a/a+c) x 100 (%) Sp = (d/b+d) x 100 (%) 2.4.10. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê
Sử dụng phần mềm tin sinh học Vector NTI-advance 11.5 (Invitrogene USA), www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, Microsoft Excel trong xử lý số liệu. Đây là phần mềm chuyên dụng đã được lập trình trong đó các hàm sử dụng được thiết lập dựa trên những công thức cơ bản của toán thống kê. Các công thức tính sau:
- Giá trị trung bình (X): X = n xi - Độ lệch chuẩn SD: SD = 1 ) ( 2 n X xi
34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN HIỆN VI KHUẨN
3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh
ADN sau tách chiết được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Kết quả được thể hiện trong Bảng 6.
Bảng 6. Kết quả đo OD các mẫu ADN sử dụng trong nghiên cứu
Tên tác nhân số mẫu Nồng độ ADN (ng/µl) (X± SD) Độ sạch ADN (260/280) (X± SD) Tổng số 74 89,18 ± 30,05 1,82 ± 0,093
Qua kết quả đo OD ta thấy, 100% mẫu ADN đạt tiêu chuẩn về độ sạch và nồng độ ADN. Trong đó nồng độ ADN thấp nhất là 59,13, cao nhất là 119,22; độ tinh sạch giao động từ 1,73 đến 1,92. Kết quả tách chiết ADN đảm bảo về độ sạch và đủ tiêu chuẩn cho thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Thông tin về các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu (Phụ lục 1 kèm theo), (kết quả tách chiết ADN cụ thể ở Phụ lục 3).
3.1.2. Kết quả PCR đơn mồi từ các mầm bệnh đơn lẻ
PCR đơn mồi từ ADN tách chiết từ các vi khuẩn chuẩn dương: Để khuếch đại gen đích của các loài vi khuẩn, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR.Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng được sử dụng trong điều kiện PCR với nồng độ dNTP 200 mM, Mg2+ 3 mM. Dựa vào nhiệt độ gắn mồi của từng cặp ta tìm được một nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất chung cho các bộ mồi như đã đề cập đến ở phần phương pháp. Kết quả như sau:
35
Hình.6.Kết quả PCR các mồi đơn trên ADN mẫu được tách chiết từ mẫu chuẩn dương trong điều kiện PCR chuẩn
M50: ladder 50 bp 1- Chứng âm 2- NTS/Salmonella sp 254 bp 3- Kp-Ald/K.pneumoniae 332 bp 4- ureR-PM/Proteus mirabilis 406 bp 5- S-uidA/E.coli 773 bp
Qua thử nghiệm cho thấy: các băng điện di cho hình ảnh rõ nét, đặc hiệu và đúng kích thước theo lý thuyết mà chúng tôi đã thiết kế. Như vậy, nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất mà chúng tôi lựa chọn là 56 0C, nồng độ Mg2+ là 3mM. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.3.Kết quả giải trình tự gen các mầm bệnh
Để khẳng định kết quả chẩn đoán PCR là tin cậy chúng tôi tiến hành giải trình tự các đoạn ADN đặc hiệu từ các mẫu chứng dương bằng các mồi đơn tương ứng. Kết quả giải trình tự được đối chiếu trên ngân hàng gen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast cho kết quả như sau (Hình 7, 8, 9, 10, 11):
36
3.1.3.1. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae
Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ Enterobacteriaceae
được đối chiếu trên ngân hàng gen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast cho kết quả như sau:
AGCTAGGGCGCAAGCAATGACTGCAGCCATGCACGCGATGTATGAAGA AGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAG TTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAAC TCCGTGCCAGCAGCCGCAGTATACA
Hình.7. Hình ảnh phổ sắc ký đọc theo trình tự đoạn gen đặc trưng cho họ
37
Nhận xét: Kết quả xác định trình tự ADN khẳng định đoạn ADN mà chúng
tôi nhận được là đoạn gen 16S ribosomal RNA. Sử dụng công cụ BLAST tại địa chỉ
truy cập http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ thấy độ tương đồng với các trình tự gen 16S ribosomal RNA đã công bố trên ngân hàng gen thế giới đạt 96% (Hình 7).
3.1.3.2. Kết quả xác định trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn Salmonella Kết quả giải trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn Salmonella được đối Kết quả giải trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn Salmonella được đối
chiếu trên ngân hàng gen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast cho kết quả như sau: AAAATTGCACATAGCGTAGTAGCTGACAGAGGCCATGNGACATGCAGC CTATGCACTGCGTTGATACTGAAGAAGGCTCATTCGAGGTTGTAAAGTA CTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACG TTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCAGTAA TACACGCGGCTG
38
Nhận xét: Kết quả xác định trình tự ADN khẳng định đoạn ADN mà chúng
tôi nhận được là đoạn gen flagellin. Sử dụng công cụ BLAST tại địa chỉ truy cập
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ thấy độ tương đồng với các trình tự gen flagellin đã
công bố trên ngân hàng gen thế giới đạt 94 % (Hình 8).
3.1.3.3. Kết quả xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K. pneumoniae pneumoniae
Kết quả giải trình tự đoạn gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K.
pneumoniae được đối chiếu trên ngân hàng gen
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast cho kết quả như sau:
GGTGACCACCGGGATCCTGCCGTGGAACTTCCCGTTCTTTCTTATCGCCC GCAAGCTGGCGCCGGCTCTGATCACTGGAAATACCATTGTCATTAAGCC CAGCGAATTTACGCCCAATAATGCCATCGCCTTTGCCGAGATTGTCCATC AGGTTGGGTTGCCGAAAGGGGTCTTTAACCTTGTGCTTGGCCGCGGAGA AACCGTTGGCCAGGAGCTGGCCGGCAATCCGAAGGTGGCGATGGTCAG CATGACCGGCAGCGTGGCGGCGGGAGAAAAAATTATGGCCCGCTGCGG CGA
39
Nhận xét: Kết quả xác định trình tự ADN khẳng định đoạn ADN mà chúng
tôi nhận được là đoạn gen aldehyde dehydrogenase. Khi so sánh với các trình tự gen aldehyde dehydrogenase đã công bố trên ngân hàng gen cho thấy độ tương đồng
đạt 99 %.
3.1.3.4. Kết quả xác định trình tự gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilis Kết quả giải trình tự đoạn gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilis được đối Kết quả giải trình tự đoạn gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilis được đối
chiếu trên ngân hàng gen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast cho kết quả như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CGGGCACAAGCCNTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTA GGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGATAAGGTTAATACCC TTGATCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCC AGCAGCCGCGGTA
Hình 10. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn Proteus mirabilis
40
Nhận xét: Kết quả xác định trình tự ADN khẳng định đoạn ADN mà chúng
tôi nhận được là đoạn gen UreR. Sử dụng công cụ BLAST tại địa chỉ truy cập
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ thấy độ tương đồng với các trình tự gen UreR đã công
bố trên ngân hàng gen thế giới đạt 98 % (Hình 10).
3.1.3.5. Kết quả xác định trình tự gen S-uidA của vi khuẩn E. coli
Kết quả giải trình tự đoạn gen S-uidA của vi khuẩn E. coli được đối chiếu trên
ngân hàng gen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast cho kết quả như sau:
CCGCAATATGCCTGGCGAGGTCGCAAAATCGGCGAAATTCCATACCTGT TCACCGACGACGGCGCTGACGCGATCAAAGACGCGGTGATACATATCCA GCCATGCACACTGATACTCTTCACTCCACATGTCGGTGTACATTGAGTGC AGCCCGGCTAACGTATCCACGCCGTATTCGGTGATGATAATCGGCTGAT GCAGTTTCTCCTGCCAGGCCAGAAGTTCTTTTTCCAGTACCTTCTCTGCC GTTTCCAAATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTAATAACGGTTCAGGC ACAGCACATCAAAGAGATCGCTGATGGTATCGGTGTGAGCGTCGCAGA ACATTACATTGACGCAGGTGATCGGACGCGTCGGGTCGAGTTTACGCGT TGCTTCCGCCAGTGGCGCGAAATATTCCCGTGCACCTTGCGGACGGGTA TCCGGTTCGTTGGCAATACTCCACATCACCACGCTTGGGTGGTTTTTGTC ACGCGCTATCAGCTCTTTAATCGCCTGTAAGTGCGCTTGCTGAGTTCCCC CGTTGACTGCCTCTTCGCTGTACAGTTCTTTCGGCTTGTTGCCCGCTTCG AACCAAATGCCTAAAGAGAGGTTAAAGCCGACAGCAGCAGGTTTCATC CATTCACCCACGATGCCCATGTTTCCATTCTTGCCCCCAGGTCGGGAAGC AATCCTCCCTTTCAAGGCCGTTTAAAGGGGGGTTAATATTGCCCGAAGG GGGTACCCGGGGTAAGGGAAGTTTGGGGCCCCCCCAATCCCCAGTTCCA TGNATANAGAAAA
41
Hình 11. Kết quả giải trình tự đoạn gen S-uidA đặc trưng cho vi khuẩn E. coli
Nhận xét: Kết quả xác định trình tự ADN khẳng định đoạn ADN mà chúng
tôi nhận được là đoạn gen S-uidA. Sử dụng công cụ BLAST tại địa chỉ truy cập
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ thấy độ tương đồng với các trình tự gen S-uidA đã
công bố trên ngân hàng gen thế giới đạt 97 % (Hình 11).
Như vậy, kết quả giải trình tự gen của các mầm bệnh vi sinh sau khi so sánh với trình tự gen trên ngân hàng genbank cho thấy: Kết quả xác định trình tự ADN
đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ Enterobacteriaceae, độ tương đồng 96%; giải trình tự đoạn gen S-uidA của E.coli, độ tương đồng đạt 97%; giải trình tự đoạn gen UreR của Proteus mirabilis có độ tương đồng đạt 98%; đoạn gen flagellin của Salmonella sp độ tương đồng đạt 94 %. Trình tự gen aldehyde dehydrogenase của K. pneumoniae độ tương đồng đạt 99 %. Qua kết quả giải trình tự gen, chúng tôi
khẳng định với các bộ mồi đã thiết kế có thể xác định chính xác các tác nhân vi khuẩn đã đề cập đến ở trên. Như vậy, phản ứng PCR đơn mồi đã thiết lập thành
42
công. Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tôi tiếp tục tối ưu hóa quy trình PCRđa mồi. Các kết quả đạt được trình bày ở phần dưới đây:
3.1.4. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae
Căn cứ vào nhiệt độ nóng chảy của mồi trên lý thuyết và khắc phục những khó khăn mà phản ứng PCR đa mồi gặp phải, để có được điều kiện tối ưu nhất cho phản ứng chúng tôi khảo sát nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và các yếu tố khác. Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi đã thiết lập được một phản ứng PCR đa mồi. Kết quả được trình bày ở Hình 10.
Kết quả PCR đa mồi phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội chuẩn
Chu trình nhiệt cho tối ưu phản ứng PCR: 940C, 2 phút; (940C, 30 giây; 560C, 30 giây; 720C ,40 giây ) x 38 chu kỳ; 720C , 7 phút; 40C,
Hình 12. Kết quả PCR đa mồi phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi
nội chuẩn
Ghi chú:
Bộ mồi Ent-Beta gồm: Bộ mồi nội chuẩn betaglobulin – 180 bp; Bộ mồi chung phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteiace – 424 bp M50: ladder 50 bp 1- Chứng âm 2- Ent-Beta/ADN người 3- Ent-Beta/Salmonella sp 4- Ent-Beta/K.pneumoniae 5- Ent-Beta/Proteus mirabilis 6- Ent-Beta/E.coli (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả hình ảnh điện di cho các băng rõ nét, đặc hiệu trên các mẫu ADN chuẩn dương. Kích thước băng điện di theo đúng lý thuyết. Như vậy, bộ đa mồi này
43
vừa có thể sử dụng trong chẩn đoán tác nhân vi sinh vật gây bệnh thuộc họ
Enterobacteriaceae đồng thời cũng có thể kiểm chứng được quá trình tách chiết
ADN bằng bộ mồi nội chuẩn beta globin. Nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất chúng tôi có được qua các thử nghiệm là 560C, kết quả như hình 10.
3.1.5.Kết quả PCR đa mồi phát hiện đồng thời các tác nhân gây bệnh
Kết quả PCR đa mồi, đảm bảo các băng điện di lên rõ nét, dễ nhận định kết quả và không có các băng phụ. (Hình 11)
Hình 13. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae Ghi chú: 1- EPKS/Chứng âm 2- EPKS/Salmonella sp 254 bp 3- EPKS/K.pneumoniae 324 bp 4- EPKS/Proteus mirabilis 406 bp 5- EPKS/E.coli 773 bp
6- Bộ mồi tổng hợp EPKS trên ADN chuẩn dương mix
(Bộ mồi EPKS gồm các gen đích phát hiện vi khuẩn E.coli, Proteus mirabilis, K.pneumoniae, Salmonella sp)
Nhận xét: Lựa chọn nhiệt độ 56 0C dựa vào tính toán nhiệt độ gắn mồi của các cặp mồi cho kết quả rõ nét nhất. Ở điều kiện nhiệt độ này, bộ mồi chúng tôi thiết kế có thể phát hiện được các tác nhân đơn lẻ hay đồng thời cả 4 loài vi khuẩn trên đều được phát hiện rõ.
Từ những điều kiện phản ứng PCR đã được tối ưu, ở giếng số 6 hình 13, với giả định một bệnh phẩm có cả 4 tác nhân vi khuẩn quan tâm thì phương pháp PCR
44
đa mồi của chúng tôi cũng có thể phát hiện được, kết quả rõ ràng, dễ phân biệt các tác nhân bệnh. Tuy nhiên, đây là tình huống giả định, vì trong thực tế không có khi nào một bệnh nhân có nhiễm đồng thời 4 loài vi khuẩn kể trên. Nhưng như vậy chứng tỏ tính ưu việt của phương pháp phát hiện của chúng tôi.
3.1.6. Đánh giá hiệu quả và tính ứng dụng của phương pháp trên panel chuẩn dương dương
3.1.6.1. Độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu chứng âm và chuẩn dương
Bảng 7. Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu bộ mồi Ent/beta và EPKS thiết kế trên
các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriacae và ADN khác (Phụ lục 1 kèm
theo)
STT Loài vi khuẩn hoặc nhóm Số mẫu Kết quả PCR Độ đặc hiệu PCR (%) PCR (+) Ent/beta PCR(+) EPKS 1 Escherichia coli 34 34 34 2 Klebsiella pneumoniae 20 20 20 3 Salmonella sp 2 2 2 4 Proteus sp 1 1 1 5 Enterobacteriaceae sp 3 3 0 100 6 Staphylococcus aureus 1 0 0 100 7 Streptococcus pneumoniae 1 0 0 100 8 Pseudomonas aeruginosa 1 0 0 100 9 Acinetobacter baumanii 1 0 0 100 10 Candida albicans 1 0 0 100 11 Aspergillus sp 1 0 0 100 12 Fusarium sp 1 0 0 100
13 Virut viêm gan B (HBV) 2 0 0 100
14 Virut Epstain – Barr 2 0 0 100
15 Virut Herpes simplex 2 0 0 100
16 ADN người 1 0 0 100
45
Áp dụng công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu như đã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu, ta có:
Với bộ mồi Ent/beta: Se = (a/a+c) x 100 (%) =(60/60)x100=100% Sp = (d/b+d) x 100 (%)=(14/14)x100=100% Với bộ mồi EPKS: Se=(57/57)x100=100%
Sp=(17/17)x100 =100% Đánh giá độ đặc hiệu của PCR đa mồi
Thí nghiệm sử dụng các mẫu ADN được tách chiết từ các loài vi khuẩn gây
bệnh khác như: Staphylococcus aureus; Streptococcus pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Acinetobacter baumanii, ADN người, ADN nấm, ADN virut khác. Kết quả thể hiện qua bảng và hình ảnh điện di sau (Phụ lục 1 kèm theo): (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 14. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi trên ADN tác nhân gây bệnh khác
Ghi chú: M50 - maker 50 bp;
1- Chứng âm; 2- Pseudomonas aeruginosa; 3- Staphylococcus aureus; 4- Streptococcus pneumoniae; 5- Acinetobacter baumanii; 6- Nấm Cadida albicans; 7- Nấm Aspergillus sp; 8- Nấm Fusarium sp; 9-10: ADN virut viêm gan B; 11-12: ADN virut Epstain – Barr; 14-15: ADN virut Herpes simplex; 16: ADN máu người khỏe mạnh; 17: Chuẩn dương
Qua hình ảnh điện di cho thấy không có kết quả dương tính giả nào được ghi nhận trên các bệnh phẩm thử nghiệm. Kết quả cho thấy các bộ mồi chúng tôi thiết
46
kế có độ đặc hiệu cao, không nhầm lẫn với các mầm bệnh khác cũng như ADN của bộ gen người. Thực tế sau khi tiến hành đánh giá ngưỡng phát hiện và tính đặc hiệu của phương pháp chúng tôi lấy ngưỡng phát hiện là 10 CFU/ml. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự như nghiên cứu khác với độ nhạy kỹ thuật dao động trong khoảng 10-50 CFU/ml, nghiên cứu của Hossein Fazzeli và cs cũng có kết quả tương tự khi thấy PCR có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 100%, với ngưỡng phát hiện là10 copies/1 phản ứng [20].
3.1.6.2. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện vi khuẩn của phương pháp trên thực hành
Để xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp chúng tôi tiến hành pha các mầm bệnh thành các dải nồng độ khác nhau từ 104 CFU/ml đến 100 CFU/ml. Sau đó chúng tôi tiến hành tách chiết ADN tổng số của các vi khuẩn và chạy PCR đa mồi trên các ADN chuẩn dương đơn. Kết quả như sau:
Hình 15. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của PCR đa mồi trên các mẫu chuẩn dương
47
Nhận xét: qua hình ảnh điện di ở trên cho thấy: ngưỡng phát hiện là 1-10 CFU/ml, tuy nhiên để giảm thiểu yếu tố ngoại nhiễm chúng tôi lấy ngưỡng phát hiện cao hơn là 10 CFU/ml.
Như vậy, qua khảo sát bước đầu cho thấy kỹ thuật PCR đa mồi mà chúng tôi