Để có được kết quả PCR như mong muốn đảm bảo về độ nhạy và độ chính xác của kỹ thuật bắt buộc ta phải có các phương pháp tối ưu hoá phản ứng PCR và PCR đa mồi. Do vậy, trong nghiên cứu này để tìm được một quy trình chuẩn và nồng độ tối ưu nhất cho phản ứng PCR và PCR đa mồi chúng tôi lần lượt thử các thành phần phản ứng với các nồng độ khác nhau dựa trên quy trình PCR chuẩn.
- Tối ưu dung dịch đệm, nồng độ MgCl2 (Mg2+ được thử ở những nồng độ khác nhau từ 1,5 đến 4 mM, nồng độ mồi, nồng độ enzyme ADN Polymerase và
29
nồng độ ADN khuôn. Sau mỗi lần thực hiện phản ứng với mỗi nồng độ thành phần tham gia phản ứng, kết quả sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose. Băng sản phẩm PCR được lựa chọn là những băng đậm nét nhất, đặc hiệu đúng kích thước cần nghiên cứu và không có sản phẩm phụ. Các thông số về nồng độ của các thành phần tham gia phản ứng sẽ được lựa chọn cho các lần tiến hành phản ứng tiếp theo tương ứng với băng sản phẩm PCR rõ nét và đặc hiệu. Đối với chu trình nhiệt cũng lần lượt thử với các nhiệt độ biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi khác nhau dựa trên đặc điểm, thành phần mồi, kích thước đoạn gen đích cần khuếch đại và dựa vào chu trình chuẩn của phản ứng PCR [15], [36], [37].
- Dựa vào nhiệt độ gắn mồi của từng cặp ta tìm được một nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất cho từng bộ mồi đơn, nhằm mục đích ở nhiệt độ đó hiệu quả gắn mồi khuếch đại đoạn gen quan tâm tốt nhất. Do vậy, khi thiết kế mồi nhằm đạt hiệu quả phản ứng PCR đa mồi cao nhất chúng tôi đã thiết kế các mồi có nhiệt độ gắn mồi gần giống nhau. Theo các tài liệu nghiên cứu và thực tế chúng tôi tiến hành khảo sát các nhiệt độ gắn mồi biến thiên trong khoảng ± 50C so với nhiệt độ gắn mồi lý thuyết đó là nhiệt độ nóng chảy của mồi và nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR. Nhiệt độ nóng chảy của mồi được tính bằng công thức Tm = 2 x (A+T) + 4 x (G+C). Tuy nhiên nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi từ 3 đến 50C [15], [36], [37]
2.4.7. Phương pháp điện di
Điện di ADN là một phương pháp đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử vì đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sát được các phân tử ADN bằng mắt thường. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel Agarose. Sản phẩm ADN được điện di trên gel Agarose sẽ tạo thành các giải băng khác nhau. ADN mang điện tích âm di chuyển từ cực âm sang cực dương, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử, dạng cấu trúc ADN, nồng độ Agarose, điện thế, nhiệt độ và thành phần chất điện di. Dựa vào kích thước từng đoạn gel được nghiên cứu và khả năng phân tách của gel Agarose, chúng tôi sử
30
dụng kỹ thuật điện di trên gel Agarose 2% nhằm mục đích xác định khoảng kích thước các băng khi được điện di cùng thang ADN chuẩn.
- Chuẩn bị gel Agarose 2 %:
- Quá trình diện di và kiểm tra sản phẩn PCR:
+ Điện di thực hiện theo phương nằm ngang với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100 V, dòng 60 - 80 mA, trong thời gian khoảng 40 phút.
+ Sau khi nhuộm gel được quan sát và chụp ảnh bằng máy soi gel Dolphin- DOC[38].