GIÀU’’ ADN VI KHUẨN
Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh vẫn luôn được quan tâm. Vì ưu điểm của phương pháp này là nhanh, độ nhạy cao. Tuy nhiên, việc tiến hành trên mẫu bệnh phẩm lại gặp những khó khăn bởi tính chất phức tạp của các loại bệnh phẩm, đặc biệt đối với bệnh phẩm máu với các chất ức chế vốn có trong máu ngoại vi (hemoglobin), nồng độ ADN vi khuẩn trong máu không đáng kể so với ADN người. Đối với phản ứng PCR đa mồi nếu có quá nhiều mồi chúng sẽ triệt tiêu lẫn nhau làm giảm độ nhạy kỹ thuật của phản ứng. Do tính chất bảo tồn tiến hoá giữa các loài, một tỷ lệ nhất định các vật chất di truyền của vi khuẩn sẽ được bảo tồn và có trình tự gần giống một phần bộ gen của sinh vật bậc cao (trong đó có con người) vì thế nếu đoạn mồi được thiết kề hướng vào các khu vực bảo tồn này, hiện tượng bắt chéo của mồi vào ADN gen người sẽ diễn ra gây nên dương tính giả. Để giảm thiểu các nguy cơ nói trên, việc tách và loại bỏ ADN người trước khi thực hiện phản ứng PCR là cần thiết, vì thế đề tài đặt ra nội dung quan trọng là thiết lập quy trình loại ADN người và làm giàu ADN vi khuẩn. Chúng tôi đã đạt được một số kết quả sau:
3.2.1. So sánh hiệu suất tách và chất lượng ADN cũng như khả năng loại bỏ ADN người bằng các dung môi khác nhau
Để thiết lập được phương pháp loại bỏ ADN người, chúng tôi tiến hành pha
48
bệnh phẩm giả định (1ml máu ngoại vi người khoẻ mạnh có chứa 10e7CFU E. coli).
Kết quả đánh giá hiệu quả loại bỏ ADN người của các công thức dung môi được thể hiện qua các thông số về nồng độ ADN thu nhận được và độ sạch của ADN. Cụ thể qua bảng sau:
Bảng8: Hàm lượng và chất lượng ADN thu nhận từ 1ml máu ngoại vi chứa vi
khuẩn E.coli
Công thức dung môi Na2CO3 Triton-X
100 (%) NaCl NH4Cl NaHCO3 EDTA SDS NP40 pH
Nồng độ DNA ug/ul A260/A280 MCLB1 1000mM 1 0mM 0 0 5mM 0 0 9.8 5 1.3 MCLB2 1000mM 1 0mM 0 0 5mM 0 0 9.5 5.9 2.7 MCLB3 1000mM 1 10mM 0 0 5mM 0 0 8.5 420 1.9 MCLB4 1000mM 1 10mM 0 0 0 0 0 8 435 1.9 MCLB5 1000mM 2 10mM 0 0 0 0 0 7.5 425 1.8
Nhận xét: thành phần dung môi ảnh hưởng rất đáng kể tới hàm lượng ADN thu nhận từ máu ngoại vi, nó còn ảnh hưởng cả tới độ tinh khiết của các mẫu ADN có nồng độ thấp (dưới 5ug/l) và không ảnh hưởng quá nhiều tới các mẫu ADN có nồng độ lớn hơn. Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm và lựa chọn dung môi tối ưu nhất là MCLB1 dùng trong thực hành. Chúng tôi đặt tên sinh phẩm MCLB1 này là SHPT108@dehumanDNA.