Căn cứ vào nhiệt độ nóng chảy của mồi trên lý thuyết và khắc phục những khó khăn mà phản ứng PCR đa mồi gặp phải, để có được điều kiện tối ưu nhất cho phản ứng chúng tôi khảo sát nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và các yếu tố khác. Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi đã thiết lập được một phản ứng PCR đa mồi. Kết quả được trình bày ở Hình 10.
Kết quả PCR đa mồi phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội chuẩn
Chu trình nhiệt cho tối ưu phản ứng PCR: 940C, 2 phút; (940C, 30 giây; 560C, 30 giây; 720C ,40 giây ) x 38 chu kỳ; 720C , 7 phút; 40C,
Hình 12. Kết quả PCR đa mồi phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi
nội chuẩn
Ghi chú:
Bộ mồi Ent-Beta gồm: Bộ mồi nội chuẩn betaglobulin – 180 bp; Bộ mồi chung phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteiace – 424 bp M50: ladder 50 bp 1- Chứng âm 2- Ent-Beta/ADN người 3- Ent-Beta/Salmonella sp 4- Ent-Beta/K.pneumoniae 5- Ent-Beta/Proteus mirabilis 6- Ent-Beta/E.coli
Kết quả hình ảnh điện di cho các băng rõ nét, đặc hiệu trên các mẫu ADN chuẩn dương. Kích thước băng điện di theo đúng lý thuyết. Như vậy, bộ đa mồi này
43
vừa có thể sử dụng trong chẩn đoán tác nhân vi sinh vật gây bệnh thuộc họ
Enterobacteriaceae đồng thời cũng có thể kiểm chứng được quá trình tách chiết
ADN bằng bộ mồi nội chuẩn beta globin. Nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất chúng tôi có được qua các thử nghiệm là 560C, kết quả như hình 10.
3.1.5.Kết quả PCR đa mồi phát hiện đồng thời các tác nhân gây bệnh
Kết quả PCR đa mồi, đảm bảo các băng điện di lên rõ nét, dễ nhận định kết quả và không có các băng phụ. (Hình 11)
Hình 13. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae Ghi chú: 1- EPKS/Chứng âm 2- EPKS/Salmonella sp 254 bp 3- EPKS/K.pneumoniae 324 bp 4- EPKS/Proteus mirabilis 406 bp 5- EPKS/E.coli 773 bp
6- Bộ mồi tổng hợp EPKS trên ADN chuẩn dương mix
(Bộ mồi EPKS gồm các gen đích phát hiện vi khuẩn E.coli, Proteus mirabilis, K.pneumoniae, Salmonella sp)
Nhận xét: Lựa chọn nhiệt độ 56 0C dựa vào tính toán nhiệt độ gắn mồi của các cặp mồi cho kết quả rõ nét nhất. Ở điều kiện nhiệt độ này, bộ mồi chúng tôi thiết kế có thể phát hiện được các tác nhân đơn lẻ hay đồng thời cả 4 loài vi khuẩn trên đều được phát hiện rõ.
Từ những điều kiện phản ứng PCR đã được tối ưu, ở giếng số 6 hình 13, với giả định một bệnh phẩm có cả 4 tác nhân vi khuẩn quan tâm thì phương pháp PCR
44
đa mồi của chúng tôi cũng có thể phát hiện được, kết quả rõ ràng, dễ phân biệt các tác nhân bệnh. Tuy nhiên, đây là tình huống giả định, vì trong thực tế không có khi nào một bệnh nhân có nhiễm đồng thời 4 loài vi khuẩn kể trên. Nhưng như vậy chứng tỏ tính ưu việt của phương pháp phát hiện của chúng tôi.