KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT
Sau khi đã xây dựng thành công quy trình tách ADN, PCR đa mồi trên các mẫu chuẩn dương, liệu rằng với quy trình mà chúng tôi đã thiết lập có phát hiện được tác nhân gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm thực tế hay không và kết quả có sự khác biệt không giữa những bệnh phẩm giả định với mẫu bệnh phẩm thực tế? Để trả lời cho câu hỏi này chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên một nhóm mẫu máu nhỏ từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết. Kết quả bước đầu đạt được như sau (Phụ lục 2 kèm theo)
53
Bảng 10. So sánh kết quả nuôi cấy và PCR đa mồi trên mẫu nhiễm khuẩn huyết
Tên mầm bệnh Cấy máu PCR đa mồi
(n=19) (n=19) E.coli (n,%) 5 (26,3) 6 (31,6) K. pneumoniae (n,%) 1 (5,26) 3(15,78) P. mirabilis(n,%) 0 0 Salmollela sp(n,%) 0 0 Enterobacteriaceae khác(n,%) 1(5,26) 10(52,63) S. aureus(n,%) 6(31,6) KXN Stenotrophomonas maltophilia(n,%) 1 (5,26) KXN Alcaligenes faecalis(n,%) 1(5,26) KXN L.monocytogenes(n,%) 1 (5,26) KXN P. fluorescens(n,%) 3 (15,78) KXN Tổng số 19 (100) 19 (100)
54
Hình. 19. Sơ đồ so sánh kết quả PCR đa mồi và cấy máu
Qua kết quả trên cho thấy: tỷ lệ dương tính với PCR đa mồi sử dụng bộ mồi
Enterobacteriaceae là 19/56 (33,92%). Tỷ lệ nuôi cấy dương tính là 19/56
(33,92%). Tuy nhiên có tới 12/19 ca (chiếm 63,15%) có kết quả nuôi cấy dương
tính là các tác nhân vi khuẩn khác không thuộc họ này như S. aureus, Pseudomonas alcaligenes, Alcaligenes faecalis, Listeria monocytogeneS. .. Như vậy, tỷ lệ dương
tính chung của hai phương pháp là như nhau (33,92%), nhưng tỷ lệ dương tính với các tác nhân vi sinh lại khác nhau, cụ thể như sau:
- Tỷ lệ dương tính với họ Enterobacteriaceae: PCR 19/56 (33,92%) cao hơn so
với nuôi cấy 7/56 ca (12,5%);
- Tỷ lệ dương tính với từng loài vi khuẩn: PCR E. coli 6/19 (31,57%); K. pneumoniae 3/19 (15,78%) so với nuôi cấy 5/7(71,42%); K. pneumoniae 1/7
55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Trong khuôn khổ một luận văn thạc sỹ, với kết quả đã đạt được tôi cùng nhóm nghiên cứu Khoa Sinh học phân tử Bệnh viện TƯQĐ 108 đưa ra kết luận sau:
1- Xây dựng thành công quy trình phát PCR đa mồi hiện: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella.sp, Proteus mirabilis, Enterobacteriace sp. Quy
trình này sẽ có hiệu quả hơn nếu được kết hợp với loại bỏ ADN người ’’làm giàu” ADN vi khuẩn.
2 - Bước đầu ứng dụng quy trình này trên quy mô mẫu nhỏ: đã phát hiện được các
tác nhân vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae quan tâm trong mẫu máu.
Kết quả bước đầu cho thấy tỷ lệ dương tính với họ Enterobacteriaceae: PCR 19/56 (33,92%) cao hơn so với nuôi cấy 7/56 ca (12,5%); trong đó tỷ lệ dương tính với từng loài vi khuẩn: PCR E. coli 6/19 (31,57%); K. pneumoniae 3/19 (15,78%) so với nuôi cấy 5/7(71,42%); K. pneumoniae 1/7 (14,28%). Tuy nhiên, trong thực hành không sử dụng
phương pháp này để thay thế phương pháp kia mà việc kết hợp cả hai phương pháp nuôi
cấy và PCR đa mồi sẽ tăng tỷ lệ dương tính, nâng cao chất lượng chẩn đoán.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục triển khai thử nghiệm bộ sinh phẩm PCR đa mồi và xử lý ADN SHPT108@dehumanDNA trên cỡ mẫu bệnh phẩm lớn và tiến tới xây dựng thành bộ Kít thương mại có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phục vụ trong lâm sàng.
56
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Thị Ngọc Anh (2008), "Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thường gặp tại Bệnh viện Nhi Đồng 2 năm 2007", Tạp chí Y học Thành Phố Hồ Chí Minh, 12(2).
2. Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tuấn ( 2002), Bệnh học truyền nhiễm. Nhà xuất bản y học Hà Nội, p. 11- 31.
3. Phạm Văn Ca (1995) Tìm hiểu căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tại BV Bạch Mai từ 1989- 1993: Luận án tiến sĩ.
4. Nguyễn Thanh Liêm, cs (2005), "Đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng, huyết học, vi trùng học ở trẻ sơ sinh sanh non bị nhiễm trùng huyết tại Bệnh viện Nhi
đồng I từ tháng 1-99 đến 1-04.", Y học TP Hồ Chí Minh,, 9(1).
5. Lê Văn Phùng (2009), Vi khuẩn Y học. NXB Giáo dục Việt Nam, p. 198-247.
6. Bùi Thanh Thuyết, Nguyễn Thị Kim Phương, Phan Quốc Hoàn (2014), "Nghiên cứu các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết tại Bệnh viện Trung
ương Quân đội 108 (2010-2013)", Tạp chí Y dược lâm sàng 108, Tập 9(Số
đặc biệt), pp. 190-197.
7. Phạm Hùng Vân, T P Bình, K T L Anh et al. (2008), "Nghiên cứu đa trung tâm khảo sát tình hình đề kháng các kháng sinh của các trực khuẩn gram âm
dễ mọc gây nhiễm khuẩn bệnh viện phân lập từ 1/ 2007 – 5/ 2008", Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh
8. Bekal S., Brousseau R., Masson L. et al. (2003), "Rapid identification of Escherichia coli pathotypes by virulence gene detection with DNA
microarrays", J Clin Microbiol, 41(5), pp. 2113-25.
9. Bloos F., Sachse S., Kortgen A. et al. (2012), "Evaluation of a polymerase chain reaction assay for pathogen detection in septic patients under routine
condition: an observational study", PLoS One, 7(9), pp. e46003.
10. Chamberlain J. S., Gibbs R. A., Ranier J. E. et al. (1988), "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA
amplification", Nucleic Acids Res, 16(23), pp. 11141-56.
11. Chen, J.Zhang, L.Paoli et al. (2010), "A real-time PCR method for the detection of Salmonella enterica from food using a target sequence identified
by comparative genomic analysis", Int J Food Microbiol, 137(2-3), pp. 168-
74.
12. Deen J., von Seidlein L., Andersen F. et al. (2012), "Community-acquired bacterial bloodstream infections in developing countries in south and
southeast Asia: a systematic review", Lancet Infect Dis, 12(6), pp. 480-7.
13. Feng P., Lum R., Chang G. W. (1991), "Identification of uidA gene
sequences in beta-D-glucuronidase-negative Escherichia coli", Appl Environ Microbiol, 57(1), pp. 320-3.
57
14. Gebert S., Siegel D., Wellinghausen N. (2008), "Rapid detection of pathogens in blood culture bottles by real-time PCR in conjunction with the
pre-analytic tool MolYsis", J Infect, 57(4), pp. 307-16.
15. Gosiewski T1, Jurkiewicz-Badacz D, Sroka A et al. (2014 ), "A novel, nested, multiplex, real-time PCR for detection of bacteria and fungi in
blood", BMC Microbiol., 14(1), pp. 144. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
16. Hansen W. L., Bruggeman C. A., Wolffs P. F. (2009), "Evaluation of new preanalysis sample treatment tools and DNA isolation protocols to improve
bacterial pathogen detection in whole blood", J Clin Microbiol, 47(8), pp.
2629-31.
17. Hartman L. J., Selby E. B., Whitehouse C. A. et al. (2009), "Rapid real-time PCR assays for detection of Klebsiella pneumoniae with the rmpA or magA genes associated with the hypermucoviscosity phenotype: screening of
nonhuman primates", J Mol Diagn, 11(5), pp. 464-71.
18. Heimer S. R., and H. L. T. Mobley., (2001), "Interaction of Proteus mirabilis urease apoenzyme and accessory proteins identified with yeast two-hybrid
technology.", J. Bacteriol, 183, pp. 1423–1433.
19. Hein I., Flekna G., Krassnig M. et al. (2006), "Real-time PCR for the detection of Salmonella spp. in food: An alternative approach to a
conventional PCR system suggested by the FOOD-PCR project", J Microbiol Methods, 66(3), pp. 538-47.
20. Hossein Fazzeli, Mohammad Reza Arabestani, Bahram Nasr Esfahani F. K. et al. (2012), "Development of PCR-based method for detection of
Enterobacteriaceae in septicemia", J Res Med Sci, 17(7), pp. 671-675.
21. Houck P. M., Bratzler D. W., Nsa W. et al. (2004), "Timing of antibiotic administration and outcomes for Medicare patients hospitalized with
community-acquired pneumonia", Arch Intern Med, 164(6), pp. 637-44.
22. Island M. D., Mobley H. L. (1995), "Proteus mirabilis urease: operon fusion and linker insertion analysis of ure gene organization, regulation, and
function", J Bacteriol, 177(19), pp. 5653-60.
23. J. Vandepitte and J. Verhaegen, K. Engbaek, P. Rohner et al. (2003), Basis laboratory proceduce in clinical bacteriology 2nd edition edn.: World Health
Organization.
24. Jonathan D. Dattelbaum C. V. L., 2 David E. Johnson,2,3, Mobley1* a. H. L. T. ( 2003), "UreR, the Transcriptional Activator of the Proteus mirabilis Urease Gene Cluster, Is Required for Urease Activity and Virulence in
Experimental Urinary Tract Infections", Infection and immunity, 71( 2), pp.
1026–1030.
25. Jordan J. A., Durso M. B., Butchko A. R. et al. (2006), "Evaluating the near- term infant for early onset sepsis: progress and challenges to consider with
16S rDNA polymerase chain reaction testing", J Mol Diagn, 8(3), pp. 357-
58
26. Kaper J. B., Nataro J. P., Mobley H. L. (2004), "Pathogenic Escherichia
coli", Nat Rev Microbiol, 2(2), pp. 123-40.
27. Liu P., Li P., Jiang X. et al. (2012), "Complete genome sequence of Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286, a multidrug-resistant
strain isolated from human sputum", J Bacteriol, 194(7), pp. 1841-2.
28. Maheux A. F., Picard F. J., Boissinot M. et al. (2009), "Analytical comparison of nine PCR primer sets designed to detect the presence of
Escherichia coli/Shigella in water samples", Water Res, 43(12), pp. 3019-28.
29. MariaC.Rivera. J. L. (2014), "The ring of life provides evidence for a (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
genome fusion origin of eukaryotes", Clin Microbiol, 52(4), pp. 1168-76.
30. Martin GS M. D., Eaton S, Moss M, (2003), "The epidemiology of sepsis in
the United States from 1979 through 2000", N Engl J Med, 348, pp. 1546–
1554.
31. McCann C. D., Jordan J. A. (2014), "Evaluation of MolYsis Complete5 DNA extraction method for detecting Staphylococcus aureus DNA from
whole blood in a sepsis model using PCR/pyrosequencing", J Microbiol Methods, 99, pp. 1-7.
32. Park D. W., Chun B. C., Kim J. M. et al. (2012), "Epidemiological and clinical characteristics of community-acquired severe sepsis and septic shock: a prospective observational study in 12 university hospitals in Korea",
J Korean Med Sci, 27(11), pp. 1308-14.
33. Pletz M. W., N. Wellinghausen, et al. (2011), "Will polymerase chain reaction (PCR)-based diagnostics improve outcome in septic patients? A
clinical view", Intensive Care Med 37(7), pp. 1069-76.
34. Poore C. A., Coker C., Dattelbaum J. D. et al. (2001), "Identification of the domains of UreR, an AraC-like transcriptional regulator of the urease gene
cluster in Proteus mirabilis", J Bacteriol, 183(15), pp. 4526-35.
35. Poore C. A., Mobley H. L. (2003), "Differential regulation of the Proteus
mirabilis urease gene cluster by UreR and H-NS", Microbiology, 149(Pt 12),
pp. 3383-94.
36. Sambrook J. F. E. F., Maniatis T., (1989), Molecular cloning I-III. A Laboratory Mannual London, UK: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
37. Samuel Baron ( 1996), Medical Microbiology. 4th edition edn. University of
Texas Medical Branch at Galveston.
38. Simonson A. B., Servin J. A., Skophammer R. G. et al. (2005), "Decoding
the genomic tree of life", Proc Natl Acad Sci U S A, 102 Suppl 1, pp. 6608-
13.
39. T. salik, E. L.Jones, D.Nicholson B. W., L.Liesenfeld, O.Park, L. P.Glickman, S. W.Caram, L. B.Langley, R. J.van Velkinburgh, J. C.Cairns, C. B.Rivers, E. P.Otero, R. M.Kingsmore, S. F.Lalani, T.Fowler, V. G.Woods, (2010), "Multiplex PCR to diagnose bloodstream infections in
patients admitted from the emergency department with sepsis", J Clin Microbiol, 48(1), pp. 26-33.
59
40. T.S. Jacoby a, R.S. Kuchenbecker b, R.P. dos Santos b, L. Magedanz c, P. Guzatto c, L.B. Moreira, (2010), "Impact of hospital-wide infection rate, invasive procedures use and antimicrobial consumption on bacterial
resistance inside an intensive care unit", Journal of Hospital Infection, 75(1),
pp. 23 – 37.
41. Waters D., Jawad I., Ahmad A. et al. (2011), "Aetiology of community-
acquired neonatal sepsis in low and middle income countries", J Glob Health, 1(2), pp. 154-70.
Phụ lục 1. DANH SÁCH CHỦNG VI SINH VÀ KẾT QUẢ PCR ĐA MỒI (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT
MÃ
MÃ BP
THÔNG TIN BỆNH NHÂN BỆNH PHẨM KẾT QUẢ
NUÔI CẤY KẾT QUẢ PCR
CHỦNG HỌ VÀ TÊN TUỔI GIỚI KHOA LOẠI BP
NGÀY THU THẬP
n MỒI
Enterobacteriaceae n MỒI EPKS n
1 105 28 NGÔ VĂN T 1929 NAM A1 BM 19/07/1014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1
2 110 96 NGUYỄN VĂN C 1957 NAM B3 BM 30/07/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 3 111 97 NGUYỄN VĂN C 1957 NAM A12 BM 30/07/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 4 118 11 NGUYỄN THỊ H NỮ A2A BM 14/08/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 5 120 25 PHẠM THỊ T 1967 NỮ A3 BM 18/08/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1
6 126 16 NGUYỄN SỸ N 1942 NAM B3 BM 31/08/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 7 127 18 NGUYỄN VĂN V 1943 NAM A4B BM 01/09/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 8 120 73 NGUYỄN THỊ T 1935 NỮ BM 09/09/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 9 136 16 LÊ HỒNG S 1964 NAM A6 BM 14/09/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 10 137 33 LƯƠNG THỊ T 1973 NỮ A4B BM 18/09/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 11 138 43 TẠ THỊ H 1950 NỮ A4B BM 18/09/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 12 139 53 TẠ THỊ H 1950 NỮ A4B BM 19/09/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1
13 147 17 TRẦN THỊ D 1968 NỮ B2 BM 29/09/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1
14 148 25 NGUỄN THỊ T NỮ A4B BM 30/09/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 15 156 49 LÊ HỒNG S 1964 NAM B3 BM 02/10/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 16 162 95 HOÀNG VĂN K NAM A3 BM 14/10/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 17 163 56 TRẦN THỊ B 1956 NỮ B1D BM 21/10/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 18 164 61 TRẦN H 1939 NAM B1D BM 21/10/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 19 165 64 TRẦN H 1939 NAM B1D BM 21/10/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1
21 167 69 NGUYỄN THANH M 1967 NAM A4B BM 23/10/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 22 171 8 NGUYỄN THANH M 1967 NỮ B3 BM 27/10/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 23 172 28 LÊ ĐÌNH C 1951 NAM A21 BM 28/10/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1
24 178 77 PHÓ HẬU T 1933 NAM A3 BM 04/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 25 179 84 PHÓ HẬU T 1933 NAM A3 BM 04/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 26 180 85 PHÓ HẬU T 1933 NAM A3 BM 04/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 27 188 33 LƯƠNG HỒNG T 1962 NAM A4A BM 10/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1
28 189 35 LÊ TRẦN NG 1934 NAM A4B BM 12/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 29 193 9 TRỊNH VĂN C 1933 NAM B3 BM 19/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 30 194 16 TRỊNH VĂN C 1933 NAM A12 BM 19/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1
31 200 58 NGUYỄN TIẾN B 1955 NAM A4B BM 26/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1
32 209 17 ÔNG VĂN L 1945 NAM A3 BM 28/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 33 210 31 LÊ HỒNG NH 1960 NỮ A6 BM 29/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 34 211 18 ÔNG VĂN L 1945 NAM A3 BM 28/11/2014 E. coli 1 Dương tính 1 E. coli 1 35 122 81 LÊ VĂN NH 1957 NAM A21 BM 25/08/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
36 130 84 TRẦN HUY L 1979 NAM A5 BM 11/09/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
37 132 93 ĐỖ THỊ N 1955 NỮ A4B BM 12/09/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
38 133 94 ĐỖ THỊ N 1955 NỮ A4B BM 12/09/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
39 149 29 PHẠM HỮU L 1983 NAM A12 BM 02/10/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
40 153 40 PHẠM HỮU L 1983 NAM A12 BM 02/10/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
41 161 80 NGUYỄN THẾ L 1959 NAM A5 BM 10/10/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
42 170 14 NGUYỄN TIẾN T 1956 NAM A12 BM 28/10/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
43 173 29 NGUYỄN HUY Đ 1948 NAM A5 BM 28/10/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
44 175 56 ĐẬU THỊ L 1963 NỮ B3 BM 01/11/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
45 185 17 ĐINH VĂN Đ 1948 NAM A4B BM 08/11/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1
46 186 20 ĐINH VĂN Đ 1948 NAM A4B BM 08/11/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
47 197 17 KiỀU THỊ TH 1950 NỮ A7 BM 22/11/2014 K.pneumoniae 1 Dương tính 1 K.pneumoniae 1