- Thời gian nghiên cứu: Tháng 01/2014 – 12/2014
- Địa điểm nghiên cứu: Khoa Sinh học phân tử – Khoa Vi sinh – Bệnh viện TƯQĐ
21 2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.3.1. Các hoá chất, sinh phẩm
Các hoá chất, sinh phẩm, trang thiết bị được sử dụng tại Khoa Sinh học phân tử và Khoa xét nghiệm Vi sinh vật, Bệnh viện TƯQĐ 108.
Bảng 2. Danh mục các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hoá chất Hãng cung cấp
Molysis kit VH Bio
Tris-Base A Applied BioSciences (Mỹ)
Protease K Sigma (Mỹ)
Agarose Fermentas
Thang chuẩn DNA ladder Fermentas
EDTA Applied BioSciences
Agarose Merck (Đức)
NaCl Sigma (Đức)
NH4Cl BioBasis
Sodium Dichloroisocyanurate Sigma (Mỹ)
NaOH Merck (Đức)
Tris-HCl Merck (Đức)
SDS BioBasic
Triton X-100 Sigma (Mỹ)
Sodium carbonate Merck (Đức)
Hotstart DNA polymerase Themo (Mỹ0
2.3.2. Các máy và thiết bị chính
Bảng 3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Máy sequencing CEQ 8800 Beckman
Máy đo pH model 530 Corning
Cân điện tử Sartovius
Máy soi gel & chụp ảnh Gel-Doc Dolphin
22 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Máy PCR 9700 Applied BioSystems
Máy realtime-PCR Applied BioSystems
Máy đo quang phổ DU 730 Beckman
Máy ly tâm lạnh Eppendorf
Máy block nhiệt Eppendorf
Bộ pipets Eppendorf
Máy khuấy từ gia nhiệt model RCT IKA 2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.Sơ đồ nghiên cứu
23
Hình 3. Mô hình nghiên cứu thiết lập phương pháp loại bỏ ADN người
2.4.2. Thiết kế các cặp mồi sử dụng trong PCR và PCR đa mồi Nguyên tắc thiết kế mồi Nguyên tắc thiết kế mồi
`- Các cặp mồi đơn được thiết kế bắt cặp đặc hiệu vào các khu vực ít thay đổi nhất cho mỗi loài như các gen mã hóa cho protein độc tố đặc trưng của loài.
- Các cặp mồi không bắt cặp chéo với nhau (khi thực hiện phản ứng đa mồi) và không bắt cặp với genome ADN người.
- Ngoài các bộ mồi đơn đặc hiệu cho mỗi loài, chúng tôi còn thiết kế một cặp
mồi bắt vào khu vực ít thay đổi nhất phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae .
- Sự khác biệt về kích thước giữa các đoạn sản phẩm tạo ra nằm trong khoảng 80 đến 100 bp, nó đảm bảo cho việc các đoạn sản phẩm có thể dễ dàng được phân biệt khi điện di trên gel agarose 1,5-2,5%.
24
Các cặp mồi đặc hiệu cho phát hiện các vi khuẩn trong đề tài được sử dụng cho phản ứng PCR nhân các đoạn gen đích có trình tự tương ứng:
(A)
(B)
Hình.4. Hình ảnh mô phỏng cho quá trình thiết kế mồi phát hiện vi khuẩn gây bệnh
(A) Hình ảnh blast trình tự mồi với các trình tự gen của vi khuẩn E. coli đã công bố trên ngân hàng gen
(B) - Sơ đồ thiết kế mồi K. pneumoniae sử dụng phần mềm Vector NTI 11.0
Các cặp mồi đặc hiệu cho phát hiện các vi khuẩn trong đề tài được sử dụng cho phản ứng PCR nhân các đoạn gen đích có trình tự tương ứng (Bảng 4):
25
Bảng.4. Trình tự mồi trong phản ứng PCR đa mồi phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh
Tên tác nhân Tên mồi Trình tự gen đích
Kích thước (bp) E.coli S-uidA-F 5’GTCGCGAGTGAAGAT CCCTTTC-3’ S-uidA 773 S-uidA-R 5’GCATTAATGGACTGG ATTGGGGC-3’ Proteus mirabilis ureR- PM-F 5’TCACAGTCACCACTA ATCTCACGTTGA-3’ UreR 406 ureR- PM-R 5’AGATGAGTGATCGCC TGATTTTTTGGC-3’ K. pneumoniae Kp Ald-F 5’CCGGGGGAGAATATC CTTGTCTT-3’ aldehyde dehydrogenase 324 Kp Ald- R 5’CGCCGCAGCGGCCAT AATTTTT-3’ Salmonella sp NTS-F 5’AGCCTGTCGCTGTTG ACCCAGAAT-3’ flagellin gene 254 NTS-R 5’CGCACACGCTGCAGG TTGTTGTT-3’ Enterobacteriac eae sp Ent-F 5’GTTGTAAAG(C/T)ACT TTCAG(T/C)GG(T/G)GA GGAA-3’ 16S ribosomal RNA gene 424 Ent-R 5’GCCTCAAGGGCACAA CCTCCAA-3’ Gen nội chuẩn β globin
F 5’AGAAGAGCCAAGGA CAGGTACG-3’ hemoglobin beta globin chain (HBB) gene 180 β globin R 5’TGCTAGTGAACACAG TTGTGTCAGA-3’
26 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(a)
(b) Hình 5. Hình ảnh mô phỏng kết quả điện di các sản phẩm PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh
Hình a: là bộ mồi nội chuẩn Ent xác định họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội chuẩn betaglobin;
Hình b là bộ mồi phát hiện một số tác nhân vi khuẩn cụ thể thuộc họ Enterobacteriaceae
2.4.3. Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu
Chúng tôi tham khảo tài liệu của Sambrook J. và cs năm 1989 [36], quy trình tách như sau:
-Chủng vi sinh
-Ly tâm 12000 rpm/5 phút, thu cặn -Thêm 200 µl TE 1X và trộn đều -Ủ 950C trong 10 phút
-Phá siêu âm trong 10 phút -Ly tâm 13200 rpm/5 phút
27
2.4.4. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm
Với những hiểu biết về nguyên lý và cơ chế loại bỏ ADN người “làm giàu” ADN vi khuẩn chúng tôi đã tiến hành các bước xử lý ADN và tách chiết như sau:
1. 1000 µl máu tổng số + 1200µl dịch phá bạch cầu MCLB1, lắc 1200 vòng/ phút ở nhiệt độ 37oC trong vòng 3 phút
2. Bổ sung 2ml 1M Tris-HCl, pH4 lắc đều 3. Ly tâm 5000 G trong 05 phút
4. Loại bỏ pha trên
5. Bổ sung 900µl nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), vortex đều trong 1 phút 6. Ly tâm 5000 G trong 2 phút
7. Loại bỏ pha trên thu cặn. Đến bước này khối hồng cầu, bạch cầu đã bị vỡ và bị loại bỏ gần như hoàn toàn
8. Thêm 300 µl NaOH 200 mM + SDS 2% 9. Ủ 950 C trong 5 phút
10.Trung hòa bằng 250 µl Tris-HCL 1M pH 4.2-4,6
11.Thêm 400 µl dung dịch phenol, chloroform isoamylalchol 25:24:1 (lắc đều) 12.Ly tâm tốc độ tối đa trong 20 phút
13.Thu dịch nổi
14.Thêm 0.7 V isopropanol
15.Ly tâm tốc độ tối đa trong 30 phút 16.Thu tủa
17.Thêm 700 µl Cồn 75% rửa 2 lần ( ly tâm tốc độ 13,200 rpm/5 phút) 18.Làm khô bằng máy speedvac trong 5 phút
28
20. Đo OD (ng/µl). Thông thường nếu quá trình loại bỏ ADN người thành công, nồng độ ADN bệnh phẩm sẽ rất thấp (dưới 10ng/ml) thậm chí không thể xác định được nồng độ
2.4.5. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ
Đây là phương pháp cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu.
Nguyên tắc dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào mối tương quan: 1 đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ:
+ 50 µg/mL cho một dung dịch ADN sợi đôi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ 40 µg/mL cho một dung dịch ADN hay RNA sợi đơn Hàm lượng ADN được xác định bằng công thức:
[ADN] = OD260 × 50 × X (µg/mL)
Trong đó X là số lần pha loãng từ dung dịch ADN gốc ban đầu.
Ngoài ra phương pháp này còn có thể xác định được độ sạch mẫu phân tích dựa trên tỉ số OD260/OD280. Nếu tỉ số này > 1,8 thì dung dịch ADN đem đo được xem là sạch.
2.4.6. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi
Để có được kết quả PCR như mong muốn đảm bảo về độ nhạy và độ chính xác của kỹ thuật bắt buộc ta phải có các phương pháp tối ưu hoá phản ứng PCR và PCR đa mồi. Do vậy, trong nghiên cứu này để tìm được một quy trình chuẩn và nồng độ tối ưu nhất cho phản ứng PCR và PCR đa mồi chúng tôi lần lượt thử các thành phần phản ứng với các nồng độ khác nhau dựa trên quy trình PCR chuẩn.
- Tối ưu dung dịch đệm, nồng độ MgCl2 (Mg2+ được thử ở những nồng độ khác nhau từ 1,5 đến 4 mM, nồng độ mồi, nồng độ enzyme ADN Polymerase và
29
nồng độ ADN khuôn. Sau mỗi lần thực hiện phản ứng với mỗi nồng độ thành phần tham gia phản ứng, kết quả sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose. Băng sản phẩm PCR được lựa chọn là những băng đậm nét nhất, đặc hiệu đúng kích thước cần nghiên cứu và không có sản phẩm phụ. Các thông số về nồng độ của các thành phần tham gia phản ứng sẽ được lựa chọn cho các lần tiến hành phản ứng tiếp theo tương ứng với băng sản phẩm PCR rõ nét và đặc hiệu. Đối với chu trình nhiệt cũng lần lượt thử với các nhiệt độ biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi khác nhau dựa trên đặc điểm, thành phần mồi, kích thước đoạn gen đích cần khuếch đại và dựa vào chu trình chuẩn của phản ứng PCR [15], [36], [37].
- Dựa vào nhiệt độ gắn mồi của từng cặp ta tìm được một nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất cho từng bộ mồi đơn, nhằm mục đích ở nhiệt độ đó hiệu quả gắn mồi khuếch đại đoạn gen quan tâm tốt nhất. Do vậy, khi thiết kế mồi nhằm đạt hiệu quả phản ứng PCR đa mồi cao nhất chúng tôi đã thiết kế các mồi có nhiệt độ gắn mồi gần giống nhau. Theo các tài liệu nghiên cứu và thực tế chúng tôi tiến hành khảo sát các nhiệt độ gắn mồi biến thiên trong khoảng ± 50C so với nhiệt độ gắn mồi lý thuyết đó là nhiệt độ nóng chảy của mồi và nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR. Nhiệt độ nóng chảy của mồi được tính bằng công thức Tm = 2 x (A+T) + 4 x (G+C). Tuy nhiên nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi từ 3 đến 50C [15], [36], [37]
2.4.7. Phương pháp điện di
Điện di ADN là một phương pháp đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử vì đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sát được các phân tử ADN bằng mắt thường. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel Agarose. Sản phẩm ADN được điện di trên gel Agarose sẽ tạo thành các giải băng khác nhau. ADN mang điện tích âm di chuyển từ cực âm sang cực dương, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử, dạng cấu trúc ADN, nồng độ Agarose, điện thế, nhiệt độ và thành phần chất điện di. Dựa vào kích thước từng đoạn gel được nghiên cứu và khả năng phân tách của gel Agarose, chúng tôi sử
30
dụng kỹ thuật điện di trên gel Agarose 2% nhằm mục đích xác định khoảng kích thước các băng khi được điện di cùng thang ADN chuẩn.
- Chuẩn bị gel Agarose 2 %:
- Quá trình diện di và kiểm tra sản phẩn PCR:
+ Điện di thực hiện theo phương nằm ngang với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100 V, dòng 60 - 80 mA, trong thời gian khoảng 40 phút.
+ Sau khi nhuộm gel được quan sát và chụp ảnh bằng máy soi gel Dolphin- DOC[38].
2.4.8. Giải trình tự gen
Tất cả mầm bệnh sau khi được xác định bằng PCR đơn mồi đều được tiến hành khẳng định bằng phân tích giải trình tự gen (Sequencing). Xét nghiệm này được tiến hành trên hệ thống Seq 8800 (Beckman Coulter, Mỹ) tại Khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện TƯQĐ 108. Quy trình kỹ thuật được tiến hành như sau:
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự:
a. Chuẩn bị ống 0.5ml (đã khử trùng, số lượng ống tương đương với số lượng mẫu cần tinh sạch).
b. Thêm vào mỗi ống 0.5ml hỗn hợp dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) với các thành phần và thể tích như sau:
3M Natri Acetate pH 5.2 2 µl
100mM Na2EDTA pH 8.0 2 µl
20mg/ml Glycogen (Cung cấp kèm theo DTCS Quick Start kít)
0.3µl
c. Chuyển toàn bộ dung dịch phản ứng PCR giải trình tự vào ống 0.5ml đã có hỗn hợp Stop Solution và vortex trong vài giây.
31
d. Thêm vào mỗi ống 60 µl Ethanol lạnh 95% (được bảo quản trong tủ lạnh – 200C), vortex và ly tâm trong 15 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi ở phía trên (giữ lại ADN tủa ở đáy ống). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
e. Rửa ADN tủa bằng cách thêm 200 µl Ethanol lạnh 70% (bảo quản trong tủ lạnh -200C, không dùng cồn để quá lâu) và ly tâm với tốc độ 14000 vòng/ phút trong 2 phút ở 40C. Cẩn thận hút bỏ dung dịch.
f. Quay khô chân không trong vòng 10 phút hoặc cho đến khô.
g. Hoà tan ADN tủa vào trong 40ul SLS (cung cấp kèm theo DTCS Quick Start kít)
Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0.2ml hoặc đĩa 96 với các thành phần như bảng sau: Thành phần phản ứng PCR cho phản ứng giải trình tự:
Thành phần phản ứng Thể tích phản ứng (µL) DTCS (Dye Terminator Cycle
Sequencing) 6
Mồi - F 0.5
Khuôn ADN 1.5
H2O 7
Tổng thể tích phản ứng 15
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sequencing: 960C ---20 giây
550C --- 20 giây 30 chu kỳ 600C --- 4 phút
40C ---
2.4.9. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi a. Đánh giá độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi. a. Đánh giá độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi.
32
Để đánh giá độ nhạy của PCR đa mồi theo công thức tính (Se) chúng tôi tiến hành trên các mẫu ADN được tách chiết từ các loài vi khuẩn chứng dương thuộc họ
Enterobacteriaceae như E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, Salmonella sp,..Mặt
khác, trong nội dung đánh giá độ nhạy kỹ thuật thì việc thực hành trên lâm sàng cần xác định độ nhạy kỹ thuật ở nồng độ vi khuẩn tối thiểu trong mẫu bệnh phẩm. Do vậy, chúng tôi tiến hành pha loãng nồng độ của các chủng vi sinh theo tỷ lệ giảm dần từ 104 CFU/ml đến 100 CFU/ml vào trong máu người khỏe mạnh rồi tiến hành tách chiết ADN vi sinh vật và tiến hành PCR.
b. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi.
Một trong những yêu cầu quan trọng khác của chẩn đoán vi khuẩn từ máu ngoại vi là phải kiểm soát được hiện tượng bắt cặp của mồi với ADN gen người. Mặc dù kết quả phân tích trên các thuật toán do chúng tôi sử dụng trong thiết kế mồi đều loại bỏ khả primer-dimer và hiện tượng bắt chéo của mồi vào gen người nhưng để khẳng định tính đúng đắn trong thực hành chẩn đoán chúng tôi tiến hành đánh giá độ đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi trên các mẫu ADN chứng âm[31].Tương tự như việc đánh giá độ nhạy phương pháp, đối với việc tính độ đặc hiệu chúng tôi tiến hành như sau: Đánh giá độ đặc hiệu theo công thức (Sp) bằng cách PCR đa mồi trên các mẫu ADN vi khuẩn chứng dương, ADN từ các loài vi
khuẩn khác không thuộc họ này (Staphylococcus aureus; Streptococcus pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Acinetobacter baumanii…), ADN người,
ADN virut, ADN nấm. Công thức tính độ nhạy và độ đặc hiệu của cấy khuẩn và PCR đa mồi được tính theo công thức sau:
Bảng 5. Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp
PCR (+) PCR (-) Tổng
Nuôi cấy (+) a b a + b
Nuôi cấy (-) c d c + d
33
Se = (a/a+c) x 100 (%) Sp = (d/b+d) x 100 (%) 2.4.10. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê
Sử dụng phần mềm tin sinh học Vector NTI-advance 11.5 (Invitrogene USA), www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, Microsoft Excel trong xử lý số liệu. Đây là phần mềm chuyên dụng đã được lập trình trong đó các hàm sử dụng được thiết lập dựa trên những công thức cơ bản của toán thống kê. Các công thức tính sau:
- Giá trị trung bình (X): X = n xi - Độ lệch chuẩn SD: SD = 1 ) ( 2 n X xi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN HIỆN VI KHUẨN
3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh
ADN sau tách chiết được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Kết quả được thể hiện trong Bảng 6.
Bảng 6. Kết quả đo OD các mẫu ADN sử dụng trong nghiên cứu
Tên tác nhân số mẫu Nồng độ ADN (ng/µl) (X± SD) Độ sạch ADN (260/280) (X± SD) Tổng số 74 89,18 ± 30,05 1,82 ± 0,093
Qua kết quả đo OD ta thấy, 100% mẫu ADN đạt tiêu chuẩn về độ sạch và nồng độ ADN. Trong đó nồng độ ADN thấp nhất là 59,13, cao nhất là 119,22; độ tinh sạch giao động từ 1,73 đến 1,92. Kết quả tách chiết ADN đảm bảo về độ sạch