Bảng 7. Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu bộ mồi Ent/beta và EPKS thiết kế trên
các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriacae và ADN khác (Phụ lục 1 kèm
theo)
STT Loài vi khuẩn hoặc nhóm Số mẫu Kết quả PCR Độ đặc hiệu PCR (%) PCR (+) Ent/beta PCR(+) EPKS 1 Escherichia coli 34 34 34 2 Klebsiella pneumoniae 20 20 20 3 Salmonella sp 2 2 2 4 Proteus sp 1 1 1 5 Enterobacteriaceae sp 3 3 0 100 6 Staphylococcus aureus 1 0 0 100 7 Streptococcus pneumoniae 1 0 0 100 8 Pseudomonas aeruginosa 1 0 0 100 9 Acinetobacter baumanii 1 0 0 100 10 Candida albicans 1 0 0 100 11 Aspergillus sp 1 0 0 100 12 Fusarium sp 1 0 0 100
13 Virut viêm gan B (HBV) 2 0 0 100
14 Virut Epstain – Barr 2 0 0 100
15 Virut Herpes simplex 2 0 0 100
16 ADN người 1 0 0 100
45
Áp dụng công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu như đã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu, ta có:
Với bộ mồi Ent/beta: Se = (a/a+c) x 100 (%) =(60/60)x100=100% Sp = (d/b+d) x 100 (%)=(14/14)x100=100% Với bộ mồi EPKS: Se=(57/57)x100=100%
Sp=(17/17)x100 =100% Đánh giá độ đặc hiệu của PCR đa mồi
Thí nghiệm sử dụng các mẫu ADN được tách chiết từ các loài vi khuẩn gây
bệnh khác như: Staphylococcus aureus; Streptococcus pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Acinetobacter baumanii, ADN người, ADN nấm, ADN virut khác. Kết quả thể hiện qua bảng và hình ảnh điện di sau (Phụ lục 1 kèm theo):
Hình 14. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi trên ADN tác nhân gây bệnh khác
Ghi chú: M50 - maker 50 bp;
1- Chứng âm; 2- Pseudomonas aeruginosa; 3- Staphylococcus aureus; 4- Streptococcus pneumoniae; 5- Acinetobacter baumanii; 6- Nấm Cadida albicans; 7- Nấm Aspergillus sp; 8- Nấm Fusarium sp; 9-10: ADN virut viêm gan B; 11-12: ADN virut Epstain – Barr; 14-15: ADN virut Herpes simplex; 16: ADN máu người khỏe mạnh; 17: Chuẩn dương
Qua hình ảnh điện di cho thấy không có kết quả dương tính giả nào được ghi nhận trên các bệnh phẩm thử nghiệm. Kết quả cho thấy các bộ mồi chúng tôi thiết
46
kế có độ đặc hiệu cao, không nhầm lẫn với các mầm bệnh khác cũng như ADN của bộ gen người. Thực tế sau khi tiến hành đánh giá ngưỡng phát hiện và tính đặc hiệu của phương pháp chúng tôi lấy ngưỡng phát hiện là 10 CFU/ml. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự như nghiên cứu khác với độ nhạy kỹ thuật dao động trong khoảng 10-50 CFU/ml, nghiên cứu của Hossein Fazzeli và cs cũng có kết quả tương tự khi thấy PCR có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 100%, với ngưỡng phát hiện là10 copies/1 phản ứng [20].
3.1.6.2. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện vi khuẩn của phương pháp trên thực hành
Để xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp chúng tôi tiến hành pha các mầm bệnh thành các dải nồng độ khác nhau từ 104 CFU/ml đến 100 CFU/ml. Sau đó chúng tôi tiến hành tách chiết ADN tổng số của các vi khuẩn và chạy PCR đa mồi trên các ADN chuẩn dương đơn. Kết quả như sau:
Hình 15. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của PCR đa mồi trên các mẫu chuẩn dương
47
Nhận xét: qua hình ảnh điện di ở trên cho thấy: ngưỡng phát hiện là 1-10 CFU/ml, tuy nhiên để giảm thiểu yếu tố ngoại nhiễm chúng tôi lấy ngưỡng phát hiện cao hơn là 10 CFU/ml.
Như vậy, qua khảo sát bước đầu cho thấy kỹ thuật PCR đa mồi mà chúng tôi thiết kế có thể phát hiện nồng độ vi khuẩn 10 CFU/ml mẫu. Tuy nhiên, đây cũng mới chỉ là kết quả bước đầu thử nghiệm nên kết quả chỉ có giá trị tham khảo. Để xác định được giá trị ngưỡng phát hiện cần phải có nhiều lần thử nghiệm và đánh giá mức độ phân tán và những sai số gặp phải.