Sự ngƣng kết đƣợc hình thành do kháng nguyên hữu hình ( kháng nguyên có kích thƣớc lớn nhƣ hồng cầu và tế bào sinh vật) có các epitop bề mặt có thể liên kết chéo với các kháng thể tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy bằng mắt thƣờng. Phản ứng ngƣng kết nhạy hơn so với kết tủa, nghĩa là có thể phát hiện một số lƣợng rất nhỏ kháng thể [2,3].
Hình 17 : Phản ứng ngƣng kết hồng cầu[ 23]
(a) Phản ứng ngƣng kết xảy ra giữa dãy các giếng chứa các nồng độ huyết thanh đƣợc pha loãng dần với cùng một nồng độ hồng cầu.
(b) Phản ứng ngƣng kết dƣơng tính, các phân tử kháng thể có mặt trong huyết thanh liên kết với các kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu, tạo thành một mạng lƣới kháng nguyên-kháng thể ở đáy giếng
(c) Phản ứng ngƣng kết âm tính, do kháng thể có mặt không đủ để tạo thành liên kết với kháng nguyên, các phân tử kháng nguyên rơi xuống đáy giếng, tạo thành tủa.
Trong phản ứng ngƣng kết, ngƣời ta phân biệt ngƣng kết chủ động hay ngƣng kết trực tiếp và ngƣng kết thụ động hay là ngƣng kết gián tiếp. Ngƣng kết chủ động mà trong đó các phân tử tạo hình là giá thể mang các quyết định kháng nguyên đặc hiệu (nhƣ hồng cầu, bạch cầu...). Ngƣợc lại ngƣng kết thụ động cho phép có thể hây ngƣng kết các kháng nguyên hoà tan nhƣng trƣớc đó đã gắn nó lên bề mặt các chất trơ hữu hình làm giá đỡ nhƣ hồng cầu, hạt nhựa polystyren hay các vi tinh thể cholesteron [2,3]. Việc sử dụng các hạt tổng hợp mang lại nhiều lợi ích nhƣ ổn định, đồng nhất và bền. Hơn nữa các phản ứng ngƣng kết thực hiện trên các hạt tổng hợp có thể đƣợc đọc nhanh hơn, thƣờng trong 3 đến 5 phút của hỗn hợp các hạt với mẫu thử. Do vậy các hạt tổng hợp này đƣợc ứng dụng rất nhiều cho các phản ứng ngƣng kết thụ động để phát hiện sự có mặt của nhiều loài virus nhƣ virus H5N1[11] hay virus hây bệnh dại [16] hay một số vi khuẩn gây bệnh khác.
Trên thế giới, Takekazu Okumura và cộng sự đã tiến hành một số nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp ngƣng kết thụ động ngƣợc (RPLA- Reverse Pasive Latex Agglutination) để phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm WSSV. Trong thí nghiệm của nhóm tác giả, hạt nhựa polystyren kích thƣớc đồng nhất đƣợc dùng để làm giá thể, đƣợc gắn với kháng thể kháng virus gây bệnh đốm trắng. Hạt nhựa sau khi đƣợc gắn với kháng thể sẽ đƣợc sử dụng để phát hiện sự có mặt của WSSV dựa vào sự xuất hiện của ngƣng kết. Tuy nhiên, ứng dụng của nghiên cứu bị hạn chế bởi sự xuất hiện của phản ứng ngƣng kết không đặc hiệu [18,19].
Áp dụng nguyên lý của phƣơng pháp ngƣng kết thụ động ngƣợc (RPLA) nhƣ trên, chúng tôi tiến hành gắn bào tử-strep với kháng thể kháng VP28-biotinyl và sử dụng phức hệ này nhƣ là một giá thể để phát hiện sự có mặt của virus gây bệnh đốm trắng WSSV các mẫu tôm bệnh. Phƣơng pháp này sẽ hứa hẹn đem lại nhiều ƣu thế bởi nó không đòi hỏi thiết bị đắt tiền và có thể dễ dàng thao tác ở ngay trên đồng ruộng. Ngoài ra, việc sản xuất nguyên liệu ban đầu cho phƣơng pháp ngƣng kết là bào tử-strep có thể dễ dàng thực hiện trong phòng thí nghiệm với một số lƣợng lớn, ổn định sẽ giúp làm giảm giá thành của bộ kit phát hiện WSSV sau này.
Chƣơng II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α từ hãng Invitrogen.
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PY79, vi khuẩn Streptomyces avidinii chứa đoạn gen mã hóa cho streptavidin là quà tặng của Giáo sƣ Simon Cutting, Đại học Hoàng gia Holloway, London, Anh quốc.
2.1.2. Các bộ kit
Bộ kit tinh sạch plasmid của hãng Bioneer, kit tách ADN hệ gen từ vi khuẩn của Qiagen.
Bộ kit tách ADN từ virus: Virus Magnet Nano của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein và Trung tâm khoa học Vật liệu, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên
2.1.3. Các cặp mồi
Dựa vào trình tự nhận biết của ba enzyme giới hạn liên tiếp là BamHI ,
HindIII và EcoRI trong vùng đa điểm (MSC) của vector pDG364 (hình 18), nên ngay từ bƣớc thiết kế mồi, cặp mồi của đoạn cotB đã đƣợc thiết kế mang vị trí nhận biết của BamHI và HindIII trong khi cặp mồi đặc hiệu của đoạn gen streptavidin
đƣợc thiết kế chứa vị trí nhận biết của HindIII và EcoRI, với mục đích để tạo thuận lợi khi gắn lần lƣợt hai đoạn gen cotB và streptavidin vào vector tái tổ hợp pDG364
Các cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu cho các đoạn gen mã hóa cho
streptavidin, cotB; cặp mồi đặc hiệu cho vị trí amyE front, amyE back của vector pDG 364 và cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen VP28 của virus gây bệnh đốm trắng WSSV (bảng 2). Bảng 2: trình tự các cặp mồi Đoạn gen đích Mồi Trình tự cotB cotB Fw 5'-CGCGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCCT-3' BamHI cotB Rv 5’- CCCAAGCTTGGATGATTGATCATCT -3’ HindIII streptavidin strep Fw 5'-AAAAAGCTTGACCCCTCCAAGGACTCGAAG -3' HindIII strep Rv 5'- AAAAGAATTCCTACTGCTGAACGGCGTCGAG-3' EcoRI VP28 VP28 Fw 5’- CCCAAGCTTGATCTTTCTTTCACTC-3’ VP28 Rv 5’- AAAGAATTCTTACTCGGTCTCAGTG -3’ amyE back/front 364 Fw 5’- GGAAACACACAAATTAAAACTGGTCTGAT-3’ 364 Rv 5’- GGGTGCTTTAGTTGAAGATAAAGACCAC -3’
2.1.4. Mẫu tôm sú nhiễm bệnh đốm trắng
Các mẫu tôm sú đã đƣợc xác định là nhiễm bệnh đốm trắng đƣợc lấy từ chi cục thú y Bình Định và Sóc Trăng.
2.1.5. Các nguyên liệu khác
Các oligonucleotide, SYBR đƣợc mua từ hãng Invitrogen, các dNTP, thang chuẩn ADN, thang chuẩn protein của hãng Fermentas, các enzyme giới hạn của hãng Enzynomics, T4 ADN ligase của hãng Promega
Kháng thể đa dòng từ thỏ kháng streptavidin và kháng thể đa dòng từ thỏ kháng VP28, kháng thể đơn dòng kháng VP28 từ chuột là quà tặng của Giáo sƣ Simon Cutting, Đại học Hoàng gia Holloway London, Anh quốc.
Biotin succinimidyl của hãng Invitrogen, chất nhuộm màu IC5-PE- Maleimide của hãng Dojindolab, Nhật Bản
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Tách chiết ADN hệ gen từ vi khuẩn Gram dƣơng
Các bước tiến hành tách ADN hệ gen từ vi khuẩn Gram dương bằng kit tách ADN hệ gen của hãng Qiagen được tiến hành như sau:
5 ml dung dịch nuôi đƣợc ly tâm ở 7500 vòng/phút trong 10 phút để thu lấy tủa tế bào. Sau đó, tủa đƣợc bổ sung 180 μl dung dịch lysozyme 20 mg/ml trong đệm Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; EDTA 2 mM; Trixton 1,2%. Hỗn hợp đƣợc ủ 30 phút ở 370C rồi đƣợc thêm tiếp 20 μl proteinase K và 200 μl đệm AL. Hỗn hợp này đƣợc trộn đều và ủ ở 560C trong 30 phút sau đó để ở 950C trong 15 phút. Ở bƣớc tiếp theo, hỗn hợp phản ứng đƣợc bổ sung 200 μl ethanol 100% vào mẫu, trộn đều, sau đó đem ly tâm nhẹ để thu hết dịch bám trên thành và nắp ống. Hỗn hợp sau đó đƣợc chuyển lên cột QIAamp Spin rồi ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút. Sau khi dịch qua cột đƣợc loại bỏ, bổ sung tiếp 500 μl đệm AW1 vào cột. Cột đƣợc ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ dịch qua cột. 500 μl đệm AW2 đƣợc thêm vào và hỗn hợp phản ứng đƣợc đem ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 3 phút. Dịch qua cột tiếp tục đƣợc loại bỏ và ly tâm lại một lần nữa để loại hoàn toàn đệm. Cuối cùng, cột đƣợc chuyển sang một ống 1,5 ml mới. 200 μl đệm AE đƣợc thêm vào và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch qua cột chứa ADN đƣợc thu lấy và bảo quản ở -200C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn
Quy trình tách plasmid bằng kit tinh sạch plasmid của hãng Bioneer được tiến hành gồm các bước sau:
5-10 ml dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C để loại bỏ hoàn toàn dịch nổi và thu lấy tủ a tế bào . Tiếp đó, 250 μl đệm RS đƣợc bổ sung để hòa tủa. Hỗn hợp đƣợc tiếp tục bổ sung 250 μl đệm BL rồi trô ̣n đều bằng cách đảo ống nhẹ nhàng 3-4 lần. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng cho tới khi di ̣ch trở nên trong . Ở bƣớc tiếp theo, 350 μl đệm NE đƣợc thêm vào, ống đƣợc đảo nhẹ nhàng ngay sau đó 3-4 lần. Ống tiếp tục đƣợc ly tâm ở 40
13000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch trong thu đƣợc đƣợc chuyển lên cột gắn ADN và ly tâm trong 1 phút với tốc độ 13000 vòng/phút. Dịch qua cột đƣợc loại bỏ rồi thêm tiếp 500 μl đệm DE vào cột và ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Cột sau đó đƣợc đem ly tâm trong 1 phút ở 13000 vòng/phút để loại bỏ dịch qua cột. Tiếp đó, 700 μl đệm WP đƣợc bổ sung vào cột rồi đem ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút ở 40C trong 1 phút. Dịch qua đƣợc loại bỏ và tiếp tục ly tâm với tốc độ trên trong 1 phút để loại đệm hoàn toàn. Cuối cùng, cột đƣợc chuyển sang một ống 1,5 ml mới và bổ sung 50-100 μl đệm EL vào. Cột đƣợc đem ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu lấy dịch qua cột chứa plasmid. Dịch thu đƣợc đƣợc bảo quản ở -200C.
2.2.3. Tách chiết ADN hệ gen của virus từ mẫu tôm nhiễm WSSV
Do trong dung dịch virus thu được từ mẫu nghiền tôm chứa rất nhiều các tạp chất nên nếu sử dụng các bộ kít tách chiết có màng lọc silica, các tạp chất này thường tích tụ lại trên màng lọc, dẫn đến tắc cột và không thể thu được ADN. Do vậy, để giải quyết khó khăn này, bộ kit Virus Magnet Nano sử dụng hạt nano từ bọc silica được chọn để tách chiết ADN từ virus. Quy trình tách ADN hệ gen virus bằng bộ kit Virus Magnet Nano gồm cá c bước sau:
250 µl dịch virus đƣợc bổ sung 25µl proteinase. Tiếp đó, 500 μl đệm ly giải đƣợc bổ sung vào hỗn hợp phản ứng rồi trô ̣n đều 3-4 lần bằng pipet. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 650C trong 15 phút. Ở bƣớc tiếp theo 200 l isopropanol và 150 l hạt Mag – Si nano đƣợc thêm vào, ống đƣợc trộn 3-4 lần bằng pipet và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó ống đƣợc đặt lên nam châm để tập trung hạt từ 2-3 phút hoặc cho tới khi dịch trở nên trong. Dịch trong đƣợc loại bỏ hoàn toàn rồi thêm tiếp 500 l đệm rửa 1. Hỗn hợp đƣợc trộn đều 3-4 lần để hòa tan hoàn toàn hạt Mag – Si nano. Tiếp theo, ống lại tiếp đƣợc đặt lên nam châm để tập trung hạt và loại bỏ dịch trong. Hạt Mag – Si nano thu đƣợc lại tiếp tục đƣợc rửa hai lần bằng đệm rửa 2. Bƣớc tiếp theo, sau khi đệm rửa 2 đã đƣợc loại bỏ hoàn toàn, ống đƣợc đặt ở 650C trong 15 phút để loại bỏ isopropanol. Cuối cùng, 50-100 μl đệm chiết đẩy đƣợc bổ sung vào để hòa tan lại hạt Mag – Si nano. Hỗn hợp đƣợc đặt ở 650C trong 10 phút rồi sau đó dịch trong chứa ADN đƣợc thu lại nhờ nam châm. Dịch thu đƣợc đƣợc bảo quản ở -200
C.
2.2.4. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR
Thµnh phÇn ThÓ tÝch (μl) H2O cÊt khö trïng, khö ion
§Öm Taq ADN polymerase 10X
Taq ADN polymerase 5 u/μl dNTP 2 mM
Måi xu«i 10 pmol Måi ng-îc 10 pmol ADN khu«n (50-100 ng) 16,5 2,5 0,5 2,5 1,0 1,0 1,0 Tæng thÓ tÝch 25
Hỗn hợp PCR đƣợc trộn đều và đặt vào máy PCR. Chu trình nhiệt đƣợc điều chỉnh cẩn thận về nhiệt độ, thời gian ủ và thời gian kéo dài sao cho phù hợp.
2.2.5. Nhân dòng các đoạn gen đích vào vector pDG364
Sản phẩm PCR đặc hiệu các đoạn đƣợc nhân dòng vào vector pDG364 Thành phần của 1 phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pDG364gồm:
- Sản phẩm PCR : 1l
- Đệm : 1 l
- Vector pDG364 : 1l
- H2O cất khử trùng, khử ion : 3 l
Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc ủ ở nhiệt độ 160C qua đêm, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5.
2.2.6. Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5 DH5
Trên cơ sở màng tế bào vi khuẩn dƣới tác động của hoá chất hoặc điện trƣờng sẽ bị thay đổi, trở nên xốp, tạo các lỗ khiến cho các phân tử ADN có thể chui vào. Sau đó, các tế bào đƣợc phục hồi lại trong môi trƣờng nuôi cấy. Thể biến nạp sẽ đƣợc phát hiện trong môi trƣờng chọn lọc.
Tế bào khả biến E. coli chủng DH5 (bảo quản trong tủ lạnh sâu -800C) đƣợc lấy ra để trên đá 10-20 phút cho tan dần. Hỗn hợp phản ứng gắn ở trên đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào, trộn nhẹ và để trên đá 10-15 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó đƣợc chuyển ngay sang bể ổn nhiệt ở 420
đƣợc chuyển lại ủ trên đá 2 phút (bƣớc sốc nhiệt). 300 l môi trƣờng LB (Luria Bertani) lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp, sau đó nuôi lắc ở tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 370C trong 1 giờ. Dung dịch biến nạp đƣợc cấy trải tế bào trên đĩa thạch petri chứa môi trƣờng LB đặc có bổ sung 50 g/ml ampicillin, nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm. Các khuẩn lạc thu đƣợc đƣợc kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn bằng phản ứng PCR. Một khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính đƣợc chọn nuôi để tách plasmid bằng kit tách plasmid của hãng Bioneer.
2.2.7. Xử lý plasmid bằng các cặp enzyme giới hạn
Vector và các đoạn gen đích sau khi đƣợc xử lý bằng các cặp enzyme giới hạn tƣơng ứng, sẽ thu đƣợc những đoạn ADN mang các vị trí nhận biết enzyme giới hạn ở hai đầu, là nguyên liệu cho phản ứng gắn nối sau này.
Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn gồm: Plasmid đã đƣợc tinh sạch : 20 μl
Đệm II : 10 μl
Enzyme (20 u/μl) : 1 μl/mỗi loại H20 khử trùng vừa đủ 100μl. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Thể tích từng thành phần phản ứng có thể thay đổi tuỳ theo hàm lƣợng ADN có trong mẫu ).
2.2.8. Phản ứng gắn đoạn gen đích (insert) vào vector bằng T4 ADN ligase
Các sản phẩm gồm đoạn gen mã hoá cho gen đích vector đã qua xử lý enzyme và đƣợc tinh sạch sẽ đƣợc tiếp tục dùng cho phản ứng gắn. Phản ứng này đƣợc tiến hành ở 40 C trong 14 giờ. Thành phần phản ứng bao gồm: Vector : 1 μl Gen đích : 6 μl Đệm T4 ADN ligase 10X : 1 μl T4 ADN ligase (30u/ μl) : 0,3μl H20 vừa đủ 10 μl
Sản phẩm gắn sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và nuôi trên môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh ampicillin. Các khuẩn lạc thu đƣợc tiếp tục đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR.
2.2.9. Dung hợp đoạn gen đích vào ADN hệ gen của Bacillus subtilis chủng PY79
Phương pháp được tiến hành như sau:
Tế bào khả biến B. subtilis PY79 (bảo quản trong tủ lạnh sâu -800C) đƣợc lấy ra, giữ ở nhiệt độ phòng cho đến khi tan hoàn toàn. Ngay sau khi tế bào tan hết, bổ sung 2-4 μl ADN vào ống, nuôi lắc ở 370C trong 30-45 phút. Một đối chứng âm đƣợc tiến hành song song cùng với mẫu trong đó ADN đƣợc thay thế bằng nƣớc đã khử trùng.
Bƣớc tiếp theo, tế bào biến nạp đƣợc cấy trải lên đĩa chứa môi trƣờng thạch DSM (Difco Sporulation Medium) có chọn lọc bằng chloramphenicol nồng độ 5 μg/ml, ủ ở 370C qua đêm.
2.2.10. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích trong ADN hệ gen của B. subtilis
Sau quá trình biến nạp, các khuẩn lạc thu đƣợc sẽ đƣợc cấy chuyển sang đĩa môi trƣờng LB có bổ sung 1% tinh bột và nuôi ở 370
C qua đêm.
Về mặt lý thuyết, đoạn đích gắn đƣợc vào ADN hệ gen của B. subtilis nhờ quá trình trao đổi chéo giữa các đoạn tƣơng đồng (hình 19).
Hình 19: Phƣơng thức chèn của gen dung hợp vào ADN hệ gen B. subtilis [13]