subtilis
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng pDG364 làm vector chuyển gen để đƣa đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin vào hệ gen B. subtilis. Vector này đƣợc thiết kế sẵn chứa hai trình tự amyE front và amyE back tƣơng đồng hoàn toàn với trình tự gen amyE mã hóa enzyme amylase trên hệ gen B. subtilis (vắng mặt enzyme này tế bào vẫn có khả năng sinh trƣởng bình thƣờng). Nằm xen giữa hai
trình tự này là gen cat quy định khả năng kháng chloramphenicol. Theo nhƣ tính toán, đoạn gen cotB-streptavidin đã đƣợc chèn giữa hai trình tự amyE front và amyE back trên vector tái tổ hợp; do đó khi đƣợc biến nạp vào tế bào B. subtlis khả biến sẽ xảy ra trao đổi chéo kép dẫn tới kết quả là đoạn gen cotB-streptavidin đƣợc thay vào vị trí của gen amyE trên hệ gen của B. subtilis (hình 28). Các tế bào B. subtilis mang đoạn gen cotB-streptavidin sẽ không tổng hợp đƣợc amylase dẫn tới mất khả năng phân giải tinh bột. Đây chính là cơ sở để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen cotB-streptavidin trong hệ gen B. subtilis.
Để dung hợp đoạn gen cotB-streptavidin vào hệ gen của B. subtilis dựa trên cơ chế trao đổi chéo kép, chúng tôi đã sử dụng enzyme PstI để mở vòng vector này. Sản phẩm sau khi cắt enzyme giới hạn đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Hình 28: Xƣ̉ lý enzyme giới ha ̣n cho pDG364-cotB-streptavidin
Đường chạy 1: Plasmid ban đầu
Đường chạy 2: Plasmid đã đƣợc xử lý bằng enzyme giới hạn PstI
Kết quả thu đƣợc (hình 28) cho thấy trên đƣờng chạy số 2 là sản phẩm plasmid đã đƣợc cắt enzyme giới hạn PstI với một băng duy nhất, chứng tỏ vector tái tổ hợp đã đƣợc duỗi thẳng hoàn toàn, sẵn sàng cho bƣớc dung hợp vào hệ gen B. subtilis.
Kết quả biến nạp vào tế bào B. subtilis cho thấy chúng tôi thu đƣợc một số khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy. Các khuẩn lạc thu đƣợc sẽ đƣợc đĩa LB đặc có bổ sung 1% tinh bột chứa chloramphenicol 5µg/ml và nuôi ở 420C qua đêm. Khi nhuộm màu iot đĩa nuôi cấy, các khuẩn lạc B. subtilis PY79 ban đầu vì tổng hợp đƣợc amylase nên xuất hiện vòng phân giải tinh bột. Ngƣợc lại, các khuẩn lạc B. subtilis
mang đoạn gen dung hợp thành công sẽ không xuất hiện vòng phân giải tinh bột nào là hệ quả của việc mất khả năng tổng hợp amylase (hình 29).
Kết quả thu đƣợc ở hình 29 cho thấy tại vi ̣ trí các khuẩn la ̣c chƣ́a đoa ̣n gen dung hơ ̣p (các khuẩn lạc 1-28 ) không xuất hiê ̣n vòng phân gi ải tinh bột, trong khi đó đối chƣ́ng âm là da ̣ng B. subtilis PY79 ban đầu có vòng phân gi ải tinh bột rất rõ ràng. Nhƣ vậy các khuẩn lạc đƣợc kiểm tra đều không còn khả năng t ổng hợp amylase phân hủy tinh bô ̣t , đoạn gen cotB-streptavidin đã đƣợc dung hợp vào hệ gen B. subtilis. Một số khuẩn lạc sẽ đƣợc chọn nuôi, tạo bào tử để kiểm tra sự biểu hiện của streptavidin.
Hình 29: Kiểm tra sự có mặt của gen dung hợp trong ADN hệ gen Bacillus subtilis
A) Đĩa thạch LB mang các khuẩn lạc đƣợc nhuộm màu Iot
B) Đĩa (A ) sau khi đã ga ̣t bỏ các khuẩn la ̣c để kiểm tra vòng phân giải tinh bô ̣t 1-28: các khuẩn lạc kiểm tra 1-28
ĐC(-): B. subtilis PY 79dạng ban đầu không chứa đoạn gen dung hợp