2.2.12 Kiểm tra sự biểu hiện của protein dung hợp bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting) miễn dịch (Western blotting)
2.2.12.1. Điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS - PAGE)
Gel polyacrylamide hai lớp, trong đó gel cô là 4% và gel tách là 12%, với tỉ lệ các thành phần nhƣ sau:
- Dung dịch acrylamide 30% 6,00 ml - 4x Tris HCl/SDS pH 8,8 3,75 ml - H2O cất 5,75 ml - APS 10% 0,05 ml - TEMED 0,01 ml Gel cô (4%) : - Dung dịch acrylamide 30% 0,65 ml - 4x Tris HCl/SDS pH 6,8 1,25 ml - H2O cất 3,05 ml - APS 10% 0,025 ml - TEMED 0,005 ml
Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, hỗn hợp đƣợc trộn đều và đúc vào khuôn kính đã đƣợc gắn sẵn trên giá đỡ. Sau khi phần gel tách đƣợc trùng hợp hoàn toàn, tiếp tục đúc phần gel cô và để gel trùng hợp hoàn toàn sau 30 phút mới sử dụng cho mục đích điện di.
Mẫu protein đƣợc trộn vào đệm mẫu (nồng độ 5X) theo tỉ lệ thể tích 4:1, đun cách thủy trong 5 phút, làm lạnh và dùng để tra điện di.
Đệm chạy điện di là Tris-glycin, pH 8,8 chứa SDS 1%, chạy điện di với điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại.
2.2.12.2. Phương pháp thẩm tách miễn dịch
Nguyên tắc: Phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch dựa trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể tƣơng ứng. Kháng thể (kháng thể sơ cấp) sau khi liên kết với kháng nguyên tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể, tiếp tục đƣợc nhận biết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme horse radish perosxidase, cuối cùng phức hợp kháng nguyên – kháng thể sơ cấp – kháng thể thứ cấp đƣợc phát hiện bằng cách cho ủ trong dung dịch cơ chất. Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất sẽ phát ra các tín hiệu quang hóa. Các tín hiệu này đƣợc thu lại trên tấm hyperfilm ECL. Sau khi xử lý film bằng các dung dịch hiện màu, các băng sẽ đƣợc đọc trên film
Protein sau khi đƣợc phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE, đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose bằng phƣơng pháp điện chuyển trong đệm Tris-glycin có 20% methanol. Trong quá trình điện chuyển, vị trí các băng protein vẫn đƣợc giữ nguyên.
Màng đƣợc cố định bằng dung dịch BSA 1% trong đệm Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, có NaCl 150 mM (TBS) bằng cách lắc nhẹ (30 phút - 1 giờ) ở 37o
C. Màng đƣợc tráng rửa 3 lần bằng đệm TBS để loại bỏ BSA thừa.
Màng tiếp tục đƣợc ủ với kháng thể sơ cấp, lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC. Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa trong đệm TBS. Sau đó màng đƣợc ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn horse raddish peroxidase trƣớc khi đƣợc xử lý bằng dung dịch cơ chất gồm luminol và peroxide pha trong Tris.
Bƣớc cuối cùng, các tín hiệu quang hóa sau khi đƣợc chuyển từ màng nitrocellulose lên tấm hyperfilm ECL sẽ đƣợc phát hiện bằng dung dịch hiện màu.