Sau khi thu đƣợc kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gen mã hóa
cotB trên gel agarose 1%, chúng tôi tiến hành nhân dòng đoạn gen này vào vector pDG364.
Để nhân dòng đoạn gen cotB vào vector pDG364 tại vị trí đa điểm, chúng tôi xử lý đồng thời đoạn gen cotB và vector pDG364 bằng cặp enzyme cắt giới hạn là
BamHI và HindIII để tạo đầu so le tƣơng ứng. Kết quả điện di sản phẩm ADN sau khi đƣợc phân cắt bằng cặp enzyme BamHI và HindIII và tinh sạch bằng kit tinh sạch gel của hãng Promega (hình 22) cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc một băng ADN duy nhất có kích thƣớc khoảng 6,2 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pDG364 dạng mạch thẳng và một băng ADN duy nhất có kích thƣớc khoảng 1,1 kb tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn cotB. Vector pDG364và đoạn cotB lúc này đồng thời chứa trình tự nhận biết enzyme giới hạn của BamHI và HindIII, sẵn sàng cho phản ứng gắn bằng T4 ADN ligase.
Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn của vector pDG364
Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1 kb
Đường chạy 2: Vector pGD364 thu đƣợc sau khi đƣợc xử lý enzyme giới hạn và tinh sạch
Đường chạy 3: Đoạn gen cotB thu đƣợc sau khi đƣợc xử lý enzyme giới hạn và tinh sạch
Do cả vector pDG364 và đoạn gen cotB đều chứa hai đầu dính của BamHI và
HindIII nên gen cotB dễ dàng ghép cặp dựa trên trình tự bổ sung với trình tự hai đầu của vector và đƣợc nối lại bằng enzyme T4 ADN ligase. T4 ADN ligase có vai trò xúc tác cho quá trình hình thành liên kết phosphodiester giữa 3’OH của nucleotide này với 5’phosphate của nucleotide khác. Lƣợng vector và đoạn gen cần cho vào hỗn hợp phản ứng đƣợc xác định dựa trên kết quả định lƣợng ADN sao cho tỉ lệ
[đoạn gen : vector] là [3:1]. Sản phẩm sau phản ứng gắn đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp đƣợc nhân lên với số lƣợng lớn. Plasmid pDG364 có chứa gen kháng kháng sinh chloramphenicol, nhờ đó mà các tế bào mang vector có thể sinh trƣởng bình thƣờng ở môi trƣờng có chứa chloramphenicol ở nồng độ ức chế tối thiểu.
Sau khi biến nạp sản phẩm gắn vào E. coli và nuôi cấy trên đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh chloramphenicol, chúng tôi đã nhận đƣợc một số khuẩn lạc. Tuy nhiên, chúng tôi chƣa thể khẳng định các khuẩn lạc này chứa vector tái tổ hợp pDG364 cotB hay không. Để xác định khuẩn lạc nào thực sự chứa vector pDG364
cotB, chúng tôi tiến hành PCR trực tiếp các khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi của vector pDG364 gồm 364Fw/Rv. Trên lý thuyết, nếu nhƣ đoạn cotB đƣợc gắn vào vector pDG364 thì sản phẩm PCR thu đƣợc khi chạy bằng cặp mồi của vector là 364 Fw và 364 Rv sẽ có kích thƣớc băng ADN khoảng 1,6 kb, bằng tổng kích thƣớc của đoạn cotB (1,1 kb) và khoảng cách giữa hai vị trí gắn mồi (0,5 kb).
Chế độ nhiệt của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 364Fw/Rv nhƣ sau: 940C : 30 giây
560C : 45 giây 30 chu kỳ 720C : 1 phút 40 giây
Sau khi tiến hành phản ứng PCR 4 khuẩn lạc đƣợc chọn ngẫu nhiên, sử dụng cặp mồi 364 Fw/Rv, kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc thể hiện ở hình 23.
Hình 23: Kết quả điện di sản phẩm PCR các khuẩn lạc bằng cặp mồi 364 Fw/Rv
Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1 kb
Trong số 4 khuẩn lạc đƣợc kiểm tra bằng cặp mồi của vector pDG364, có 2 khuẩn lạc (các khuẩn lạc 3,4) cho kết quả dƣơng tính với kích thƣớc băng ADN xuất hiện trên bản gel điện di agarose là khoảng 1,6 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết của chúng tôi. Từ kết quả này, chúng tôi có thể kết luận rằng đoạn gen cotB
đã gắn thành công vào vector pDG364, tạo vector tái tổ hợp pDG364 cotB. Với kết quả thu đƣợc, chúng tôi lựa chọn khuẩn lạc số 3 để tách plasmid, chuẩn bị cho các bƣớc nhân dòng tiếp theo.