gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl với các nồng độ virus pha loãng
Với những kết quả thu đƣợc ban đầu, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm để xác định đƣợc nồng độ virus tối thiểu để sự ngƣng kết có thể xảy ra. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các dịch nghiền virus đã đƣợc pha loãng theo các tỷ lệ 1:4, 1:16 và 1:64 và xác định số bản copies của WSSV.
3.4.3.1. Phản ứng ngưng kết giữa bào tử-strep gắn kháng thể đa dòng kháng VP28- biotinyl với các nồng độ virus pha loãng
Trong thí nghiệm này, 50 µl dịch virus với các nồng độ pha loãng đƣợc ủ với bào tử-strep có gắn kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl nồng độ 50 µg. Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ. Hình 41 là sự hình thành ngƣng kết theo thời gian.
Hình 41: Phản ứng ngƣng kết giữa bào tử-strep-kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl với các nồng độ WSSV pha loãng
GiếngA: Đối chứng (-) Đệm NTE
Giếng B: Dịch nghiền virus nồng độ ban đầu
Giếng C: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:4
Giếng D: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:16
Giếng E: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:64
Giếng F: Đối chứng (-) Dịch nghiền tôm không nhiễm WSSV
Kết quả trên hình 41 cho thấy, sau 3 giờ ủ ở nhiệt độ phòng, sự ngƣng kết đã bắt đầu xuất hiện ở giếng phản ứng số 2 (chứa dung dịch WSSV nồng độ gốc). Ngƣợc lại trong các giếng đối chứng âm (giếng số 1 và 6) và các giếng chứa dung dịch virus pha loãng 4 lần, 16 lần và 64 lần thì bào tử-strep bắt đầu tập trung lại ở đáy giếng. Sự khác biệt này đƣợc thể hiện rõ hơn sau 3 giờ ủ, đặc biệt rõ nét là ở giờ thứ 4. Nhƣ vậy, phản ứng ngƣng kết chỉ xuất hiện trong giếng chứa nồng độ virus gốc, trong khi đó với giếng chứa WSSV pha loãng 4, 16 và 64 lần thì ngƣng kết không xuất hiện. Hiện tƣợng này có thể đƣợc giải thích bởi do nồng độ virus
quá thấp, không đủ để hình thành mạng lƣới liên kết chéo giữa kháng nguyên với kháng thể. Do vậy, ngƣng kết không đƣợc tạo thành. Để đảm bảo độ tin cậy của thí nghiệm, chúng tôi tiến hành lặp lại thí nghiệm nhiều lần và đƣờng kính ngƣng kết đƣợc đo lại để thuận lợi cho việc xác định chính xác kết quả của những mẫu kiểm tra sau này. Kết quả thu đƣợc trong bảng dƣới đây.
Bảng 4: Kết quả phản ứng ngƣng kết Mẫu Số lƣợng Đƣờng kính trung bình (mm) Đƣờng kính ≥ 4,5 mm Đƣờng kính 3,9-4,5 mm Đƣờng kính ≤ 3,9 mm Dịch nghiền chứa WSSV ≥ 3,8x104 copies/ 50 µl 11 0 0 Dịch nghiền chứa WSSV ≤ 4,3x103 copies/ 50 µl 0 0 18 Âm tính (dịch nghiền tôm không nhiễm WSSV và mẫu chứa đệm NTE)
0 2 8
Từ bảng kết quả trên, chúng tôi có thể bƣớc đầu kết luận, những mẫu cho đƣờng kính đƣờng kính ngƣng kết ≥ 4,5 mmsẽ là những mẫu dƣơng tính với số bản copies ≥ 104/ 50µl dịch nghiền. Ngƣợc lại, những mẫu cho đƣờng kính ≤ 3,9 mm là những mẫu âm tính hoặc là mẫu chứa số bản copies WSSV ≤ 103/ 50µl dịch nghiền. Ngoài ra, trong quá trình thí nghiệm, một số trƣờng hợp dƣơng tính giả xuất hiện đối với mẫu tôm không nhiễm WSSV, đƣờng kính ngƣng kết nằm trong khoảng 3,9-4,5 mm. Kết quả dƣơng tính giả này có thể đƣợc giải thích bởi tƣơng tác không đặc hiệu giữa bào tử-strep gắn kháng thể với những tạp chất có trong dịch nghiền tôm. Bên cạnh đó, kết quả cũng cho thấy phản ứng ngƣng kết cho phép phát hiện sự có mặt của WSSV nồng độ tối thiểu là 3,8x104 bản copies, thấp hơn khoảng 10 lần so với sử dụng kỹ thuật PCR (nồng độ thấp nhất là 4,3x103).
3.4.3.2. Phản ứng ngưng kết giữa bào tử-strep gắn kháng thể đơn dòng kháng VP28-biotinyl với các nồng độ virus pha loãng
Dựa trên những kết quả thu đƣợc khi sử dụng kháng thể đa dòng kháng VP28, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm tƣơng tự đối với kháng thể đơn dòng kháng VP28. Trong thí nghiệm đối với kháng thể đơn dòng, lƣợng kháng thể đƣợc
dùng để gắn với bào tử-strep là 50µg. Hình 42 là kết quả của phản ứng sau 4 tiếng ủ giữa bào tử-strep – kháng thể đơn dòng kháng VP28-biotinyl với dải nồng độ virus giảm dần.
Hình 42: Thử phản ứng ngƣng kết giữa bào tử-strep-kháng thể đơn dòng kháng VP28- biotinyl với các nồng độ virus pha loãng
GiếngA: Đối chứng (-) đệm NTE
GiếngB: Dịch nghiền virus nồng độ ban đầu
GiếngC: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:4
GiếngD. Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:16
GiếngE: Dịch nghiền virus đƣợc pha loãng 1:64
GiếngF: Đối chứng (-) dịch nghiền tôm không nhiễm WSSV
Kết quả trên hình 42 cho thấy sự ngƣng kết đƣợc hình thành rõ nét trong giếng phản ứng chứa virus nồng độ gốc (giếng 2). Trong khi đó, với 2 mẫu đối chứng âm (giếng A và F) và 3 mẫu virus pha loãng (giếng C, D, E), chúng tôi không quan sát thấy sự xuất hiện của ngƣng kết. Nhƣ vậy, với những kết quả thu đƣợc cho phép chúng tôi khẳng định bào tử-strep gắn kháng thể đơn dòng kháng VP28- biotinyl hoàn toàn có thể sử dụng đƣợc làm giá thể cho phản ứng ngƣng kết thụ động ngƣợc để phát hiện sự có mặt của WSSV.
KẾT LUẬN
Với những kết quả thu đƣợc trong quá trình nghiên cứu nhƣ trên, chúng tôi xin đƣa ra một số kết luận sau:
1. Nhân dòng thành công gen streptavidin vào vector pDG364 cotB và dung hợp thành công đoạn gen cotB-streptavidin vào ADN hệ gen Bacillus subtilis.
2. Biểu hiện thành công protein dung hợp cotB-streptavidin trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis.
3. Bào tử-strep đã gắn kết đặc hiệu và bền vững với kháng thể đơn dòng và đa dòng kháng VP28 đƣợc biotinyl hóa.
4. Bƣớc đầu ứng dụng đƣợc bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28- biotinyl để phát hiện sự có mặt của virus gây bệnh đốm trắng nhờ phản ứng ngƣng kết. Phƣơng pháp cho phép phát hiện sự có mặt của virus gây bệnh đốm trắng với nồng độ tối thiểu là 3,8x104 bản copies, thấp hơn khoảng 10 lần so với phƣơng pháp PCR.
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
Tiếp tục nghiên cứu để tối ƣu hóa điều kiện phản ứng ngƣng kết nhƣ giảm thời gian của phản ứng ngƣng kết xuống ít hơn 4 giờ, tăng độ nhạy của phản ứng và hạn chế sự xuất hiện của kết quả dƣơng tính giả.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TRONG NƢỚC
1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Giáo trình Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
2. Đỗ Ngọc Liên (2008), Miễn dịch học cơ sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 3. Phạm Văn Ty (2001), Miễn dich học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
II. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI
4. Argarana, C., Kuntz, I.D., Birken, S., Axel, R., Cantor, C.R. (1986), “Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene”, Oxf. J., 14, pp. 1871-1882.
5. Chaiet, L., Wolf, F.J. (1964) “The Properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomycetes”, Arch. Biochem. Biophys., 106, pp. 1-5.
6. Chen, J., Jin, M., Yu, Z., Dan, H., Zhang, A., Song, Y., Chen H. (2007), “Latex agglutination test for the rapid detection of avian influenza virus subtype H5N1 and its clinical application” , J. Vet. Diagn. Invest., 19, pp. 155–160.
7. Daisuke, I., Ritsuko, K., Hiromu, T., Kazuhito, W. (2011), “Proteins Involved in Formation of the Outermost Layer of Bacillus subtilis Spores”, J. Bacteriol., 193, pp. 4075-4080.
8. Driks, A. (1999), “Bacillus subtilis spore coat”, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63, pp. 1-20.
9. Guohua, Y., Zhimin, W., Yipeng, Q. (2004), “Vp28 of shrimp White Spot Syndrome Virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells”, J. Biochem. Mol. Bio, 37, pp. 726-734.
10. Howarth, M., Chinnapen, D., Gerrow, K., Dorrestin, P., Grandy, M.R., Kelleher, N.L., El-Husseini, A., Ting, A.Y. (2006), “A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site”, Nature methods, 3, pp. 267-273.
11. Isticato, R., Cangiano, G., Tran, H.T., Ciabattini, A., Medaglini, D., Oggioni, M.R., Felice, M.D., Pozzi, G., Ricca, E. (2001), “Surface display of recobinant protein on Bacillus subtilis spore”, J. Bacteriol., 183, pp. 6294-6301.
12. Kasempimolporn, S., Saengseesom, W., Lumlertdacha, B., Sitprija, V. (2000), “Detection of rabies virus antigen in dog saliva using a latex agglutination test”, J.Clin. Microbiol, 38, pp. 3098-3099.
13. Kim, J.H. , Lee, C.S. , Kim, B.G. (2005), “Spore-displayed streptavidin: A live diagnostic tool in biotechnology”, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 331, pp. 210–214.
14. Le, D.H., Huynh, H.A., Fairweather, N., Ricca, E., Cutting, S.M. (2003), “Bacterial spore as vaccine vehicles”, Infect. Immun., 71, pp. 2810-2818.
15. Ning, D., Leng, X., Li, Q. (2011), “Surface-displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome virus in crayfish by oral administration, J. Appl Microbiol, 111, pp. 1364-5072.
16. Ricca, E., Cutting, S.M. (2003), “Emerging applications of bacterial spores in nanobiotechnology”, J. Nanobiotechnol., 1, pp. 6-16.
17. Takekazu, O., Fumiko, N., Shuta, Y., Keisuke, Y., Norihisa, O., Kiyoshi, L., Hiroshi, O., Haruji, S. (2004), “Detection of white spot syndrome virus from stomach tissue homogenate of the kuruma shrimp (Penaeus japonicus) by reverse passive latex agglutination”, J. Virol. Methods, 119, pp. 11–16.
18. Takekazu, O., Fumiko, N., Shuta, Y., Keisuke, Y., Norihisa, O., Kiyoshi, L., Hiroshi, O., Haruji, S. (2005), Detection of white spot syndrome virus (WSSV) from hemolymph of Penaeid shrimps Penaeus japonicus by reverse passive latex agglutination assay using high-density latex particles, J. Virol. Methods, 124, pp. 143–148.
19. Valimaa, L. (2008), Streptavidin- A versatile binding protein for solid-phase immunoassays, University of Turku, Finland.
20. Witteveldt, J., Cifuentes Carolina, C., Vlak Just, M. (2004), “Protection of
Penaeus monodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination ”, J. Virology, pp. 2057-2061.
21. Wu, S., Wong, S. (2005), “Engineering soluble monomeric streptavidin with reversible biotin binding capability”, J. Biol. Chem., 280, pp. 23225-23231.
22. http://www.astrobio.net/exclusive/3184/wanted-easy-going-martian- roommates 23.http://classes.midlandstech.com/carterp/courses/bio225/chap10/lecture3.htm 24. http://en.wikipedia.org/wiki/Biotin 25. http://extramarks.com/ask-exploreanswer/question/45525/science/what-is- endospore-formation-expain-it/8/?pn=&prevsh=
26. http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/hydro.htm 27. http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/loops.html 28. http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/trypto.html 29. http://research.ncku.edu.tw/re/articles/e/20110916/3.html 30. http://sciencefilm.de/detail.php?id=215017&rubrik=Bio&lang=en&q=&qrub rik= 31. http://sonongnghiephatinh.gov.vn/vn/Recommendd.aspx?tabid=58 32. http://www.tansaoa.comdoc_viewer.aspxfileNameuploadfiledomtrang.pdf