VP28-biotinyl
Để có thể đánh giá đƣợc ái lực giữa bào tử-strep với kháng thể đƣợc biotinyl hóa, chúng tôi tiến hành xác định hằng số phân ly của phức hệ này. Nồng độ của kháng thể kháng VP28-biotinyl gắn lên bào tử-strep đƣợc tính toán bằng phần mềm Scion image dựa trên độ sáng của các băng protein khi so sánh với băng 1µg kháng thể kháng VP28-biotinyl chuẩn. Kết quả tính toán thu đƣợc trong bảng dƣới đây.
Bảng 2: Nồng độ kháng thể gắn với bào tử-strep
Kháng thể cho vào ban đầu Kháng thể gắn lên bào tử-strep Lƣợng kháng thể (µg) Nồng độ kháng thể (nM) Lƣợng kháng thể (µg) Nồng độ kháng thể (nM) 10 208 0,05 5 50 1040 0,15 12.5 100 2080 0,35 25
Dựa trên mối tƣơng quan giữa nồng độ kháng thể phản ứng ban đầu và nồng độ kháng thể gắn lên bào tử-strep, chúng tôi có thể tính toán đƣợc lƣợng kháng thể hấp phụ đƣợc trên mỗi bào tử và hằng số tƣơng tác của kháng thể kháng VP28- biotinyl với streptavidin, gọi là Kb, dựa trên phƣơng trình phản ứng giữa bào tử- strep với kháng thể-biotinyl nhƣ sau:
S + A ↔ S*A
Tại thời điểm cân bằng, hằng số tƣơng tác đƣợc tính theo công thức:
KbSA= A S SA ] ].[ [ ] [ (1) Trong đó :
[SA] là nồng độ kháng thể hấp phụ lên bề mặt bào tử-strep [S] là nồng độ bào tử-strep không gắn với kháng thể [A] là nồng độ kháng thể còn thừa
Đặt y = [SA]
Với Rs là số vị trí gắn của kháng thể kháng VP28-biotinyl trên 1 bào tử Và C là nồng độ bào tử quy đổi tử 109
Đặt m2 = RS x C thì [S]= m2 - y
Và mo là nồng độ kháng thể cho vào ban đầu thì [A] = mo-y Thay vào công thức (1):
KbSA= ] ].[ 2 [m y mo y y = Kd 1
với Kd là hằng số phân ly của phức hệ Đặt Kd = m1. Phƣơng trình thu đƣợc sẽ là:
[m2 –y]. [mo – y] = y.m1
<=> y2 – (mo + m1 + m2 ).y + m2mo = 0
Giải hệ phƣơng trình bậc hai này, giá trị y thu đƣợc nhƣ sau:
y = 2 2 4 2 1 2 1 m mo m m 2 m mo m mo
Kết hợp với số liệu tính toán bằng phần mềm Scion Image thu đƣợc ở trên, chúng tôi sử dụng phần mềm Kaleida Graph để dựng đƣờng chuẩn dựa trên phƣơng trình tính toán trên phù hợp với số liệu thực nghiệm, thu đƣợc kết quả nhƣ trên hình 35.
Hình 35 : Biểu đồ thể hiện lƣợng kháng thể kháng VP28-biotinyl hấp phụ trên bào tử-strep ở các nồng độ kháng thể khác nhau.
1 10 100
100 1000 104
Initial anti-VP28 IgG concentration (nM)
y = 0.5*((m0+3500+64)-((m0+3... Error Value NA 7.8923 Chisq NA 0.98048 R KbSA = 1/m1 = 1/3500 = 0.00028 = 2,8 x 105/M RsC = m2 = 64(nM) C=1.6 x 10-3nM; R=4 x 104/spore Y=0.5*((m0+m1+m2)-((m0+m1+m2)^2-4*m2*m0)^0.5)
Từ đƣờng chuẩn này (với độ tin cậy R= 0,98), chúng tôi tính đƣợc giá trị
Kb(C-S) và lƣợng kháng thể kháng VP28-biotinyl hấp phụ trên mỗi bào tử, cụ thể là: KbSA =1/m1 = 1/3500 = 0.0028 (nM) = 2,8x105/M
RSxC = m2 = 64 (nM)
Với nồng độ của 109 bào tử/100 µl là C = 16x10-4 (nM) thì số lƣợng phân tử streptavidin biểu hiện trên bào tử có khả năng tƣơng tác với kháng thể-biotinyl là
RS = 4x104 phân tử/bào tử.
Trên lý thuyết, hằng số liên kết của streptavidin dạng tetramer với biotin đạt tới 1015/M, trong khi kết quả của chúng tôi tính toán đƣợc dựa trên thực nghiệm chỉ ra hằng số liên kết của streptavidin dạng monomer đƣợc biểu hiện dƣới dạng dung hợp với cotB trên bề mặt bào tử với kháng thể kháng VP28-biotinyl hóa chỉ là 2,8x105/M, tức là giảm đi 3x109 lần so với dạng tetramer. Mặc dù yếu hơn tƣơng tác giữa kháng nguyên-kháng thể với hằng số phân ly thƣờng nằm trong khoảng 107- 109/M thì hằng số giữa bào tử-strep và kháng thể-biotinyl mà chúng tôi thu đƣợc vẫn đủ để chỉ ra liên kết streptavidin-biotin trên bề mặt bào tử là khá đặc hiệu và bền vững so với liên kết khác nhƣ liên kết kị nƣớc...
Kết quả chúng tôi thu đƣợc ở trên là cơ sở để ứng dụng bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl trong phản ứng ngƣng kết phát hiện sự có mặt của virus gây bệnh đốm trắng.