Thµnh phÇn ThÓ tÝch (μl) H2O cÊt khö trïng, khö ion
§Öm Taq ADN polymerase 10X
Taq ADN polymerase 5 u/μl dNTP 2 mM
Måi xu«i 10 pmol Måi ng-îc 10 pmol ADN khu«n (50-100 ng) 16,5 2,5 0,5 2,5 1,0 1,0 1,0 Tæng thÓ tÝch 25
Hỗn hợp PCR đƣợc trộn đều và đặt vào máy PCR. Chu trình nhiệt đƣợc điều chỉnh cẩn thận về nhiệt độ, thời gian ủ và thời gian kéo dài sao cho phù hợp.
2.2.5. Nhân dòng các đoạn gen đích vào vector pDG364
Sản phẩm PCR đặc hiệu các đoạn đƣợc nhân dòng vào vector pDG364 Thành phần của 1 phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pDG364gồm:
- Sản phẩm PCR : 1l
- Đệm : 1 l
- Vector pDG364 : 1l
- H2O cất khử trùng, khử ion : 3 l
Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc ủ ở nhiệt độ 160C qua đêm, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5.
2.2.6. Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5 DH5
Trên cơ sở màng tế bào vi khuẩn dƣới tác động của hoá chất hoặc điện trƣờng sẽ bị thay đổi, trở nên xốp, tạo các lỗ khiến cho các phân tử ADN có thể chui vào. Sau đó, các tế bào đƣợc phục hồi lại trong môi trƣờng nuôi cấy. Thể biến nạp sẽ đƣợc phát hiện trong môi trƣờng chọn lọc.
Tế bào khả biến E. coli chủng DH5 (bảo quản trong tủ lạnh sâu -800C) đƣợc lấy ra để trên đá 10-20 phút cho tan dần. Hỗn hợp phản ứng gắn ở trên đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào, trộn nhẹ và để trên đá 10-15 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó đƣợc chuyển ngay sang bể ổn nhiệt ở 420
đƣợc chuyển lại ủ trên đá 2 phút (bƣớc sốc nhiệt). 300 l môi trƣờng LB (Luria Bertani) lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp, sau đó nuôi lắc ở tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 370C trong 1 giờ. Dung dịch biến nạp đƣợc cấy trải tế bào trên đĩa thạch petri chứa môi trƣờng LB đặc có bổ sung 50 g/ml ampicillin, nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm. Các khuẩn lạc thu đƣợc đƣợc kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn bằng phản ứng PCR. Một khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính đƣợc chọn nuôi để tách plasmid bằng kit tách plasmid của hãng Bioneer.
2.2.7. Xử lý plasmid bằng các cặp enzyme giới hạn
Vector và các đoạn gen đích sau khi đƣợc xử lý bằng các cặp enzyme giới hạn tƣơng ứng, sẽ thu đƣợc những đoạn ADN mang các vị trí nhận biết enzyme giới hạn ở hai đầu, là nguyên liệu cho phản ứng gắn nối sau này.
Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn gồm: Plasmid đã đƣợc tinh sạch : 20 μl
Đệm II : 10 μl
Enzyme (20 u/μl) : 1 μl/mỗi loại H20 khử trùng vừa đủ 100μl.
(Thể tích từng thành phần phản ứng có thể thay đổi tuỳ theo hàm lƣợng ADN có trong mẫu ).
2.2.8. Phản ứng gắn đoạn gen đích (insert) vào vector bằng T4 ADN ligase
Các sản phẩm gồm đoạn gen mã hoá cho gen đích vector đã qua xử lý enzyme và đƣợc tinh sạch sẽ đƣợc tiếp tục dùng cho phản ứng gắn. Phản ứng này đƣợc tiến hành ở 40 C trong 14 giờ. Thành phần phản ứng bao gồm: Vector : 1 μl Gen đích : 6 μl Đệm T4 ADN ligase 10X : 1 μl T4 ADN ligase (30u/ μl) : 0,3μl H20 vừa đủ 10 μl
Sản phẩm gắn sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và nuôi trên môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh ampicillin. Các khuẩn lạc thu đƣợc tiếp tục đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR.
2.2.9. Dung hợp đoạn gen đích vào ADN hệ gen của Bacillus subtilis chủng PY79
Phương pháp được tiến hành như sau:
Tế bào khả biến B. subtilis PY79 (bảo quản trong tủ lạnh sâu -800C) đƣợc lấy ra, giữ ở nhiệt độ phòng cho đến khi tan hoàn toàn. Ngay sau khi tế bào tan hết, bổ sung 2-4 μl ADN vào ống, nuôi lắc ở 370C trong 30-45 phút. Một đối chứng âm đƣợc tiến hành song song cùng với mẫu trong đó ADN đƣợc thay thế bằng nƣớc đã khử trùng.
Bƣớc tiếp theo, tế bào biến nạp đƣợc cấy trải lên đĩa chứa môi trƣờng thạch DSM (Difco Sporulation Medium) có chọn lọc bằng chloramphenicol nồng độ 5 μg/ml, ủ ở 370C qua đêm.
2.2.10. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích trong ADN hệ gen của B. subtilis
Sau quá trình biến nạp, các khuẩn lạc thu đƣợc sẽ đƣợc cấy chuyển sang đĩa môi trƣờng LB có bổ sung 1% tinh bột và nuôi ở 370
C qua đêm.
Về mặt lý thuyết, đoạn đích gắn đƣợc vào ADN hệ gen của B. subtilis nhờ quá trình trao đổi chéo giữa các đoạn tƣơng đồng (hình 19).
Hình 19: Phƣơng thức chèn của gen dung hợp vào ADN hệ gen B. subtilis [13]
Các đoạn tƣơng đồng ở đây là đoạn amyE front và amyE back trên vector với trình tự amyE có trên ADN hệ gen của B. subtilis. Vì đoạn gen dung hợp nằm kẹp giữa 2 trình tự amyE front và amyE back của vector, nên đoạn gen dung hợp này sẽ chèn vào chính vị trí amyE của B. subtilis. Do vậy, B. subtilis mang đoạn gen dung hợp cotB streptavidin sẽ không còn khả năng sinh amylase nữa. Đây cũng chính là cơ chế để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen dung hợp trong genome của B. subtilis. Các khuẩn lạc sẽ đƣợc chọn ngẫu nhiên và nuôi trên môi trƣờng LB có bổ sung 1% tinh bột.Kết quả là, khi kiểm tra bằng phƣơng pháp nhuộm màu iot (I2/KI) đĩa nuôi cấy, khuẩn lạc nào tạo vòng phân giải tinh bột do amylase vẫn đƣợc sinh ra sẽ không mang đoạn gen đích,
khuẩn lạc nào không có vòng sáng có nghĩa là đoạn gen dung hợp đã chèn vào ADN hệ gen thành công. Các khuẩn lạc không còn hoạt tính amylase này đƣợc chọn nuôi, chuẩn bị cho bƣớc kiểm tra biểu hiện tiếp theo.
2.2.11. Nuôi cấy tạo bào tử
Các khuẩn lạc tế bào B. subtilis đƣợc lựa chọn nuôi trong 5 ml môi trƣờng LB ở 37oC trong 5-6 giờ. Sau đó, 3 ml môi trƣờng nuôi cấy đƣợc pha loãng trong 50 ml môi trƣờng LB mới. Tiếp theo, 2 ml dịch pha loãng đƣợc cấy trải lên đĩa thạch DSM (Difco Sporulation medium) và ủ ở 37o
C trong 60 giờ để tạo bào tử theo phƣơng pháp của Nicholson và Setlow [26]. Sau khoảng thời gian này, vi khuẩn bị kích thích và hình thành trạng thái nghỉ của nó là bào tử. Một cách khác để tạo bào tử với số lƣợng lớn là 5ml dịch nuôi cấy đƣợc bổ sung vào 1,2 lit dung dịch môi trƣờng DSM và lắc liên tục trong 48 giờ trong nồi lên men. Sau đó, bào tử đƣợc thu lại, xử lí bằng lysozyme để loại bỏ lớp nhày bao ngoài bào tử rồi rửa sạch bằng KCl 1M và NaCl 1M. Phần trăm bào tử tạo thành sẽ đƣợc đánh giá bằng cách soi dƣới kính hiển vi điện tử. Sau đó, các mẫu bào tử đƣợc chia nhỏ vào ống eppendorf sạch chuẩn bị cho bƣớc thí nghiệm sau.
Thu dịch chiết protein áo bào tử
Với mỗi ống bào tử thu đƣợc, 40 μl dung dịch tách chiết (extraction buffer) đƣợc bổ sung vào. Thành phần dung dịch tách chiết nhƣ sau:
- Tris-HCl 0,5M pH 6,8 : 1 ml
- SDS 10% : 1 ml
- DTT (β-mercaptoethanol) 1M : 0,5 ml - H2O khử trùng vừa đủ 10 ml.
Sau khi bổ sung dung dịch tách chiết, các ống đƣợc trộn đều và ủ ở 95oC trong 15 phút (sau 5 phút mỗi ống đƣợc lấy ra và lắc mạnh). Cuối cùng, các ống đƣợc ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu lại dịch nổi để kiểm tra sự có mặt của protein dung hợp bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting).
2.2.12 Kiểm tra sự biểu hiện của protein dung hợp bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting) miễn dịch (Western blotting)
2.2.12.1. Điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS - PAGE)
Gel polyacrylamide hai lớp, trong đó gel cô là 4% và gel tách là 12%, với tỉ lệ các thành phần nhƣ sau:
- Dung dịch acrylamide 30% 6,00 ml - 4x Tris HCl/SDS pH 8,8 3,75 ml - H2O cất 5,75 ml - APS 10% 0,05 ml - TEMED 0,01 ml Gel cô (4%) : - Dung dịch acrylamide 30% 0,65 ml - 4x Tris HCl/SDS pH 6,8 1,25 ml - H2O cất 3,05 ml - APS 10% 0,025 ml - TEMED 0,005 ml
Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, hỗn hợp đƣợc trộn đều và đúc vào khuôn kính đã đƣợc gắn sẵn trên giá đỡ. Sau khi phần gel tách đƣợc trùng hợp hoàn toàn, tiếp tục đúc phần gel cô và để gel trùng hợp hoàn toàn sau 30 phút mới sử dụng cho mục đích điện di.
Mẫu protein đƣợc trộn vào đệm mẫu (nồng độ 5X) theo tỉ lệ thể tích 4:1, đun cách thủy trong 5 phút, làm lạnh và dùng để tra điện di.
Đệm chạy điện di là Tris-glycin, pH 8,8 chứa SDS 1%, chạy điện di với điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại.
2.2.12.2. Phương pháp thẩm tách miễn dịch
Nguyên tắc: Phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch dựa trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể tƣơng ứng. Kháng thể (kháng thể sơ cấp) sau khi liên kết với kháng nguyên tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể, tiếp tục đƣợc nhận biết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme horse radish perosxidase, cuối cùng phức hợp kháng nguyên – kháng thể sơ cấp – kháng thể thứ cấp đƣợc phát hiện bằng cách cho ủ trong dung dịch cơ chất. Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất sẽ phát ra các tín hiệu quang hóa. Các tín hiệu này đƣợc thu lại trên tấm hyperfilm ECL. Sau khi xử lý film bằng các dung dịch hiện màu, các băng sẽ đƣợc đọc trên film
Protein sau khi đƣợc phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE, đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose bằng phƣơng pháp điện chuyển trong đệm Tris-glycin có 20% methanol. Trong quá trình điện chuyển, vị trí các băng protein vẫn đƣợc giữ nguyên.
Màng đƣợc cố định bằng dung dịch BSA 1% trong đệm Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, có NaCl 150 mM (TBS) bằng cách lắc nhẹ (30 phút - 1 giờ) ở 37o
C. Màng đƣợc tráng rửa 3 lần bằng đệm TBS để loại bỏ BSA thừa.
Màng tiếp tục đƣợc ủ với kháng thể sơ cấp, lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC. Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa trong đệm TBS. Sau đó màng đƣợc ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn horse raddish peroxidase trƣớc khi đƣợc xử lý bằng dung dịch cơ chất gồm luminol và peroxide pha trong Tris.
Bƣớc cuối cùng, các tín hiệu quang hóa sau khi đƣợc chuyển từ màng nitrocellulose lên tấm hyperfilm ECL sẽ đƣợc phát hiện bằng dung dịch hiện màu.
2.2.13. Biotinyl hóa kháng thể kháng VP28
Nguyên tắc: Phản ứng gắn kết của biotin vào kháng thể có thể diễn ra dễ dàng nhờ sự xúc tác của các nhân tố biotinyl hóa. Hiện nay, sulfosuccinimidyl 6- hexanoate là nhân tố biotinyl hóa đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. Nó gắn kết với các gốc lysine trên chuỗi nhẹ của kháng thể, thế nên biotin succinimidyl có thể gắn dễ dàng vào kháng thể. Hai hoặc ba phân tử biotin có thể gắn kết với 1 kháng thể mà không làm thay đổi hay mất bất kì hoạt tính nào của kháng thể.
Các bước tiến hành: 100 µl kháng thể kháng VP28 hòa tan trong đệm PBS pH 8 đƣợc ủ với 30 µl biotin succinimidyl có nồng độ trong đệm DMSO ở nhiệt độ phòng trong buồng tối. Sau 2 giờ ủ, biotin dƣ thừa và các muối sẽ đƣợc loại bỏ khỏi mẫu bằng phƣơng pháp thẩm tách với đệm PBS pH 7,4 trong 2 ngày ở 4oC; cứ sau 6 giờ thay đệm PBS một lần.
2.2.14. Gắn kháng thể kháng VP28 đã đƣợc biotinyl hóa lên trên bào tử-strep
Để đảm bảo tính an toàn, trƣớc khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo, bào tử thu đƣợc sẽ đƣợc bất hoạt bằng nhiệt. Sau đó 30x108 bào tử-strep (cho 30 phản ứng) đƣợc rửa 2 lần với đệm GBS (glycine 100mM, NaCl 10mM pH 8.2). Sau hai lần rửa, bào tử đƣợc ủ với kháng thể kháng VP28 đƣợc biotinyl hóa ở các nồng độ 10 µg, 50 µg, 100 µg ở 370C trong 1 giờ. Sau đó BSA 1% đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và ủ tiếp 30 phút ở 370
lần bằng đệm GBS để loại kháng thể thừa trƣớc khi đƣợc hòa tan lại trong đệm GBS có chứa 1% BSA và giữ ở 40C cho các nghiên cứu tiếp theo. Khả năng gắn của bào tử-strep với kháng thể kháng VP28 biotinyl hóa đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch.
2.2.15. Nhuộm màu bào tử-strep đã gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl
Để phản ứng ngƣng kết có thể quan sát dễ dàng, chúng tôi tiến hành nhuộm màu bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl bằng chất nhuộm IC5-PE- Maleimide. Bào tử sau khi đƣợc nhuộm sẽ có màu xanh, tƣơng phản với màu dịch chiết của virus.
2.2.15. Thu dịch nghiền có chứa virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm sú nhiễm bệnh nhiễm bệnh
Phần mô nhiễm bệnh (thƣờng là đầu và phần chân bơi) của tôm nhiễm bệnh đƣợc nghiền đồng nhất trong đệm NTE có chứa Tris–HCl 50mM, NaCl 400mM, EDTA 5mM, PMSF 1mM pH 8,5. Sau đó, dịch nghiền đƣợc ly tâm trong 30 phút ở 10000 vòng/phút, 40C để thu dịch nổi. Phần dịch trong đƣợc giữ lại và bảo quản ở nhiệt độ -200C cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.16. Phản ứng ngƣng kết thụ động ngƣợc (Reverse passive latex agglutination) agglutination)
Trong phương pháp này, bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl được sử dụng để làm giá thể cho phản ứng ngưng kết. Các bước của phương pháp ngưng kết thụ động ngược được tiến hành như sau:
Trên các giếng của đĩa ELISA 96 giếng lần lƣợt bổ sung 10µl có chứa 108
bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl và 50µl dịch chứa WSSV. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn kỹ bằng pippete và đƣợc ủ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau 4 tiếng, đĩa phản ứng đƣợc lấy ra quan sát phản ứng ngƣng kết.
2.2.17. Định lƣợng số bản copies của WSSV bằng kỹ thuật Real-time PCR
Nguyên tắc: giống nhƣ kỹ thuật PCR thông thƣờng, kỹ thuật Real-time PCR cũng dựa trên khả năng nhân bản một trình tự ADN đích khi có mặt cặp mồi đặc hiệu của enzyme ADN polymerase. Tuy nhiên, khác với kỹ thuật PCR thông thƣờng, Realtime PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sự tích lũy các sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra do trong hỗn hợp có bổ sung thêm chất phát tín hiệu. Chất phát tín hiệu này khi liên kết với sản phẩm PCR sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và đƣợc bộ phận phát hiện huỳnh quang của máy PCR thu nhận. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh lƣợng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Chính vì vậy, kỹ thuật Realtime PCR có đọ chính xác và độ nhạy rất cao, tiết kiệm thời gian. Hơn nữa, kỹ thuật này còn giúp giảm nguy cơ ngoại nhiễm và các thao tác sau phản ứng khuếch đại.
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật Real-time PCR đƣợc sử dụng để đánh giá nồng độ virus mà phƣơng pháp ngƣng kết thụ động có thể phát hiện ra đƣợc. Chất phát huỳnh quang đƣợc sử dụng trong phản ứng là SYBR Green I, có khả năng liên kết với ADN mạch đôi và phát tín hiệu huỳnh quang rất mạnh. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm IQ5 Optical System.
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN STREPTAVIDIN, COTB VÀO VECTOR PDG364 VÀ DUNG HỢP VÀO HỆ GEN B. subtilis
Quá trình này có thể đƣợc tóm tắt bằng sơ đồ trên hình 20
Hình 20: Sơ đồ tóm tắt các bƣớc tạo vector tái tổ hợp pDG 364 cotB streptavidin
Theo nhƣ hình 19, chúng tôi sẽ lần lƣợt đƣa đoạn gen cotB vào vector pDG 364 tạo thành vector pDG 364 cotB. Vector tái tổ hợp thu đƣợc tiếp tục đƣợc xử lý để đƣa đoạn streptavidin vào, tạo vector tái tổ hợp pDG 364 cotB streptavidin.
3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa cotB và streptavidin bằng phƣơng pháp PCR
Để thu đƣợc lƣợng lớn đoạn gen mã hóa cho streptavidin từ nguồn ADN hệ