agglutination)
Trong phương pháp này, bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl được sử dụng để làm giá thể cho phản ứng ngưng kết. Các bước của phương pháp ngưng kết thụ động ngược được tiến hành như sau:
Trên các giếng của đĩa ELISA 96 giếng lần lƣợt bổ sung 10µl có chứa 108
bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl và 50µl dịch chứa WSSV. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn kỹ bằng pippete và đƣợc ủ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau 4 tiếng, đĩa phản ứng đƣợc lấy ra quan sát phản ứng ngƣng kết.
2.2.17. Định lƣợng số bản copies của WSSV bằng kỹ thuật Real-time PCR
Nguyên tắc: giống nhƣ kỹ thuật PCR thông thƣờng, kỹ thuật Real-time PCR cũng dựa trên khả năng nhân bản một trình tự ADN đích khi có mặt cặp mồi đặc hiệu của enzyme ADN polymerase. Tuy nhiên, khác với kỹ thuật PCR thông thƣờng, Realtime PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sự tích lũy các sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra do trong hỗn hợp có bổ sung thêm chất phát tín hiệu. Chất phát tín hiệu này khi liên kết với sản phẩm PCR sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và đƣợc bộ phận phát hiện huỳnh quang của máy PCR thu nhận. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh lƣợng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Chính vì vậy, kỹ thuật Realtime PCR có đọ chính xác và độ nhạy rất cao, tiết kiệm thời gian. Hơn nữa, kỹ thuật này còn giúp giảm nguy cơ ngoại nhiễm và các thao tác sau phản ứng khuếch đại.
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật Real-time PCR đƣợc sử dụng để đánh giá nồng độ virus mà phƣơng pháp ngƣng kết thụ động có thể phát hiện ra đƣợc. Chất phát huỳnh quang đƣợc sử dụng trong phản ứng là SYBR Green I, có khả năng liên kết với ADN mạch đôi và phát tín hiệu huỳnh quang rất mạnh. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm IQ5 Optical System.
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN STREPTAVIDIN, COTB VÀO VECTOR PDG364 VÀ DUNG HỢP VÀO HỆ GEN B. subtilis
Quá trình này có thể đƣợc tóm tắt bằng sơ đồ trên hình 20
Hình 20: Sơ đồ tóm tắt các bƣớc tạo vector tái tổ hợp pDG 364 cotB streptavidin
Theo nhƣ hình 19, chúng tôi sẽ lần lƣợt đƣa đoạn gen cotB vào vector pDG 364 tạo thành vector pDG 364 cotB. Vector tái tổ hợp thu đƣợc tiếp tục đƣợc xử lý để đƣa đoạn streptavidin vào, tạo vector tái tổ hợp pDG 364 cotB streptavidin.
3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa cotB và streptavidin bằng phƣơng pháp PCR
Để thu đƣợc lƣợng lớn đoạn gen mã hóa cho streptavidin từ nguồn ADN hệ gen của Streptomyces avidinii và cotB từ ADN hệ gen của B. subtilis chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với chu trình nhiệt cho từng đoạn gen nhƣ sau:
pDG 364 cotB streptavidin HindIII BamHI HindIII cotB T4 ligase pDG 364 cotB-GST EcoRI T4 ligase pDG 364 cotB streptavidin
Đối với đoạn gen cotB: 940C : 30 giây
650C : 45 giây x 30 chu kỳ 720C : 1 phút
Đối với đoạn gen streptavidin
940C : 30 giây
650C : 45 giây x 30 chu kỳ 720C : 30 giây
Trong thí nghiệm này, ADN hệ gen của vi khuẩn Streptomyces avidinii và ADN hệ gen của B. subtilis tinh sạch là sản phẩm nghiên cứu của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Protein tái tổ hợp.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (hình 20) cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc băng ADN duy nhất, rõ nét và có kích thƣớc khoảng 1,1 kb của cotB (hình 21a) và băng có kích thƣớc khoảng 0,55 kb, tƣơng ứng với kích thƣớc của streptavidin (hình 21b)
(a) (b)
Hình 21: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen cotB (a)và streptavidin (b)
(a) Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Đường chạy 2: Sản phẩm PCR của cotB từ ADN hệ gen (b) Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Đường chạy 2: Sản phẩm PCR của streptavidin từ ADN hệ gen
Kết quả này chứng tỏ cặp mồi đƣợc thiết kế và các điều kiện PCR đƣợc chúng tôi lựa chọn là phù hợp cho việc nhân bản đoạn gen mã hóa streptavidin và
3.1.2. Nhân dòng đoạn gen cotB vào vector pDG364
Sau khi thu đƣợc kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gen mã hóa
cotB trên gel agarose 1%, chúng tôi tiến hành nhân dòng đoạn gen này vào vector pDG364.
Để nhân dòng đoạn gen cotB vào vector pDG364 tại vị trí đa điểm, chúng tôi xử lý đồng thời đoạn gen cotB và vector pDG364 bằng cặp enzyme cắt giới hạn là
BamHI và HindIII để tạo đầu so le tƣơng ứng. Kết quả điện di sản phẩm ADN sau khi đƣợc phân cắt bằng cặp enzyme BamHI và HindIII và tinh sạch bằng kit tinh sạch gel của hãng Promega (hình 22) cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc một băng ADN duy nhất có kích thƣớc khoảng 6,2 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pDG364 dạng mạch thẳng và một băng ADN duy nhất có kích thƣớc khoảng 1,1 kb tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn cotB. Vector pDG364và đoạn cotB lúc này đồng thời chứa trình tự nhận biết enzyme giới hạn của BamHI và HindIII, sẵn sàng cho phản ứng gắn bằng T4 ADN ligase.
Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn của vector pDG364
Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1 kb
Đường chạy 2: Vector pGD364 thu đƣợc sau khi đƣợc xử lý enzyme giới hạn và tinh sạch
Đường chạy 3: Đoạn gen cotB thu đƣợc sau khi đƣợc xử lý enzyme giới hạn và tinh sạch
Do cả vector pDG364 và đoạn gen cotB đều chứa hai đầu dính của BamHI và
HindIII nên gen cotB dễ dàng ghép cặp dựa trên trình tự bổ sung với trình tự hai đầu của vector và đƣợc nối lại bằng enzyme T4 ADN ligase. T4 ADN ligase có vai trò xúc tác cho quá trình hình thành liên kết phosphodiester giữa 3’OH của nucleotide này với 5’phosphate của nucleotide khác. Lƣợng vector và đoạn gen cần cho vào hỗn hợp phản ứng đƣợc xác định dựa trên kết quả định lƣợng ADN sao cho tỉ lệ
[đoạn gen : vector] là [3:1]. Sản phẩm sau phản ứng gắn đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp đƣợc nhân lên với số lƣợng lớn. Plasmid pDG364 có chứa gen kháng kháng sinh chloramphenicol, nhờ đó mà các tế bào mang vector có thể sinh trƣởng bình thƣờng ở môi trƣờng có chứa chloramphenicol ở nồng độ ức chế tối thiểu.
Sau khi biến nạp sản phẩm gắn vào E. coli và nuôi cấy trên đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh chloramphenicol, chúng tôi đã nhận đƣợc một số khuẩn lạc. Tuy nhiên, chúng tôi chƣa thể khẳng định các khuẩn lạc này chứa vector tái tổ hợp pDG364 cotB hay không. Để xác định khuẩn lạc nào thực sự chứa vector pDG364
cotB, chúng tôi tiến hành PCR trực tiếp các khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi của vector pDG364 gồm 364Fw/Rv. Trên lý thuyết, nếu nhƣ đoạn cotB đƣợc gắn vào vector pDG364 thì sản phẩm PCR thu đƣợc khi chạy bằng cặp mồi của vector là 364 Fw và 364 Rv sẽ có kích thƣớc băng ADN khoảng 1,6 kb, bằng tổng kích thƣớc của đoạn cotB (1,1 kb) và khoảng cách giữa hai vị trí gắn mồi (0,5 kb).
Chế độ nhiệt của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 364Fw/Rv nhƣ sau: 940C : 30 giây
560C : 45 giây 30 chu kỳ 720C : 1 phút 40 giây
Sau khi tiến hành phản ứng PCR 4 khuẩn lạc đƣợc chọn ngẫu nhiên, sử dụng cặp mồi 364 Fw/Rv, kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc thể hiện ở hình 23.
Hình 23: Kết quả điện di sản phẩm PCR các khuẩn lạc bằng cặp mồi 364 Fw/Rv
Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1 kb
Trong số 4 khuẩn lạc đƣợc kiểm tra bằng cặp mồi của vector pDG364, có 2 khuẩn lạc (các khuẩn lạc 3,4) cho kết quả dƣơng tính với kích thƣớc băng ADN xuất hiện trên bản gel điện di agarose là khoảng 1,6 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết của chúng tôi. Từ kết quả này, chúng tôi có thể kết luận rằng đoạn gen cotB
đã gắn thành công vào vector pDG364, tạo vector tái tổ hợp pDG364 cotB. Với kết quả thu đƣợc, chúng tôi lựa chọn khuẩn lạc số 3 để tách plasmid, chuẩn bị cho các bƣớc nhân dòng tiếp theo.
3.1.3. Nhân dòng đoạn gen streptavidin vào vector pDG364 cotB
Để đƣa đƣợc đoạn gen streptavidin vào vector pDG364 cotB, cả đoạn gen và vector đều cần đƣợc xử lý bằng cạp enzyme giới hạn HindIII và EcoRI để tạo đầu gắn. Sau các bƣớc xử lý bằng enzyme giới hạn và tinh sạch bằng kit thôi gel của promega, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ ỏ hình 24. 6
Hình 24 : Kết quả điện di sản phẩm sau khi tinh sạch gel của streptavidin và pDG 364 cotB
Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Đường chạy 2: Vector pDG 364 cotBthu đƣợc sau khi đƣợc xử lý enzyme giới hạn và tinh sạch
Đường chạy 3 : Đoa ̣n chèn streptavidin thu đƣợc sau khi đƣợc xử lý enzyme giới hạn và tinh sạch
Hình 24 cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc đoạn ADN với kích thƣớc khoảng 7,3 kb của vector pDG 364 cotB dạng mạch thẳng ở đƣờng chạy 1 và đoạn ADN có kích thƣớc khoảng 0,55 kb của streptavidin ở đƣờng chạy 3. Cả vector và đoạn
streptavidin lúc này đều đã chứa các trình tự nhận biết enzyme giới hạn HindIII và
EcoRI
Cũng dựa trên cơ sở nhƣ phản ứng gắn giữa cotB với pDG 364, phản ứng nối
streptavidin vào vector pDG 364 cotB đƣợc tiến hành với các thành phần và thời gian đƣợc nêu ở phần 2.2.8. Các khuẩn lạc thu đƣợc sau quá trình biến nạp đƣợc
kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR, với cặp mồi của hai đoạn cotB, streptavidin và của vector pDG364
Trên lý thuyết, nếu nhƣ đoạn streptavidin đƣợc gắn tiếp vào cotB, sản phẩm PCR thu đƣợc khi chạy bằng cặp mồi của cotB có kích thƣớc 1,1 kb, với cặp mồi
strep Fw và strep Rv cho băng 549 bp, còn với cặp mồi 364 Fw và 364 Rv thì kích thƣớc băng thu đƣợc là 2,1 kb, bằng tổng kích thƣớc của hai đoạn cotB và
streptavidin cùng với khoảng cách giữa hai vị trí gắn mồi 364 Fw và 364 Rv. Chế độ nhiệt của phản ứng PCR sử dụng mồi vector nhƣ sau:
940C : 30 giây
560C : 45 giây x 30 chu kỳ 720C : 2 phút 10 giây
Sau khi tiến hành phản ứng PCR cho 3 khuẩn lạc đƣợc chọn ngẫu nhiên, sử dụng cặp mồi của vector pDG 364 Fw/Rv, kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc thể hiện ở hình 25.
Hình 25: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra các khuẩn la ̣c bằng că ̣p mồi của vector pDG 364
Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Đường chạy 2-4: Các khuẩn lạc 1- 3
Kết quả điện di cho thấy ở cả 3 đƣờng chạy 2,3,4 xuất hiện m ột băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 2,1 kb. Kích thƣớc này phù hợp với các tính toán nêu trên, chứng tỏ cả 3 khuẩn la ̣c đều chƣ́a vector pDG 364 mang đoa ̣n gen dung hợp
Để có thể khẳng định chắc chắn hơn, chúng tôi kiểm tra tiếp 3 khuẩn lạc này bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu của cotB và streptavidin . Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 26) cho thấy cả 3 khuẩn lạc số khi đƣợc kiểm tra bằng cặp mồi đặc hiệu của cotB và streptavidin đã cho các băng có kích thƣớc 1,1 kb của
cotB (đƣờng chạy 2-4) và băng có kích thƣớc khoảng 0,55 kb của streptavidin
(đƣờng chạy 5-7) .
Hình 26 : Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra thể tái tổ hợp bằng các cặp mồi
Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1 kb
Đường chạy 2-4: Các khuẩn lạc 1-3 với cặp mồi cotB Fw/Rv
Đường chạy 5-7: Các khuẩn lạc 1-3 với cặp mồi streptavidin Fw/Rv
Những kết quả ban đầu này cho phép chúng tôi sơ bộ khẳng định đoạn gen
streptavidin đã gắn thành công vào vector pDG 364 cotB, tạo thành vector tái tổ hợp pDG 364 cotB-streptavidin. Khuẩn lạc số 2 đƣợc chọn nuôi và tách plasmid cho các thí nghiệm tiếp theo.
Để khẳng định thêm, chúng tôi tiến hành kiểm tra một lần nữa thể tái tổ hợp thu đƣợc bằng phƣơng pháp cắt enzyme giới hạn với từng cặp enzyme giới hạn
HindIII và EcoRI và BamHI và EcoRI Thành phần phản ứng nhƣ sau:
Plasmid : 5 μl Đệm II : 1 μl
Enzyme : 0,5 μl/mỗi loại Nƣớc vừa đủ 10 μl
Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả điện di các sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme giới hạn (hình 27) cho thấy khi plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt bởi cặp HindIII và EcoRI, đã cho băng 0,55 kb của
streptavidin (hình 27b), còn khi đƣợc cắt bằng cặp enzyme BamHI và EcoRI thì xuất hiện băng 1,6 kb của đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin (hình 27a),
(a) (b)
Hình 27: Kết quả điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn của vector tái tổ hợp pDG364 cotB-streptavidin
(a) Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1 kb
Đường chạy 2: Plasmid đƣợc xử lý với cặp enzyme BamHI và EcoRI Đường chạy 3: Plasmid ban đầu
(b) Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1 kb
Đường chạy 2: Plasmid ban đầu
Đường chạy 3: Plasmid đƣợc xử lý với cặp enzyme HindIII và EcoRI
Tƣ̀ kết quả này, chúng tôi có thể kết luâ ̣n rằn g chúng tôi đã tạo thành công vector tái tổ hợp pDG 364 cotB streptavidin
3.1.4. Đƣa đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin trên vector vào hệ gen B. subtilis subtilis
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng pDG364 làm vector chuyển gen để đƣa đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin vào hệ gen B. subtilis. Vector này đƣợc thiết kế sẵn chứa hai trình tự amyE front và amyE back tƣơng đồng hoàn toàn với trình tự gen amyE mã hóa enzyme amylase trên hệ gen B. subtilis (vắng mặt enzyme này tế bào vẫn có khả năng sinh trƣởng bình thƣờng). Nằm xen giữa hai
trình tự này là gen cat quy định khả năng kháng chloramphenicol. Theo nhƣ tính toán, đoạn gen cotB-streptavidin đã đƣợc chèn giữa hai trình tự amyE front và amyE back trên vector tái tổ hợp; do đó khi đƣợc biến nạp vào tế bào B. subtlis khả biến sẽ xảy ra trao đổi chéo kép dẫn tới kết quả là đoạn gen cotB-streptavidin đƣợc thay vào vị trí của gen amyE trên hệ gen của B. subtilis (hình 28). Các tế bào B. subtilis mang đoạn gen cotB-streptavidin sẽ không tổng hợp đƣợc amylase dẫn tới mất khả năng phân giải tinh bột. Đây chính là cơ sở để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen cotB-streptavidin trong hệ gen B. subtilis.
Để dung hợp đoạn gen cotB-streptavidin vào hệ gen của B. subtilis dựa trên cơ chế trao đổi chéo kép, chúng tôi đã sử dụng enzyme PstI để mở vòng vector này. Sản phẩm sau khi cắt enzyme giới hạn đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Hình 28: Xƣ̉ lý enzyme giới ha ̣n cho pDG364-cotB-streptavidin
Đường chạy 1: Plasmid ban đầu
Đường chạy 2: Plasmid đã đƣợc xử lý bằng enzyme giới hạn PstI
Kết quả thu đƣợc (hình 28) cho thấy trên đƣờng chạy số 2 là sản phẩm plasmid đã đƣợc cắt enzyme giới hạn PstI với một băng duy nhất, chứng tỏ vector tái tổ hợp đã đƣợc duỗi thẳng hoàn toàn, sẵn sàng cho bƣớc dung hợp vào hệ gen B. subtilis.
Kết quả biến nạp vào tế bào B. subtilis cho thấy chúng tôi thu đƣợc một số khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy. Các khuẩn lạc thu đƣợc sẽ đƣợc đĩa LB đặc có bổ sung 1% tinh bột chứa chloramphenicol 5µg/ml và nuôi ở 420C qua đêm. Khi nhuộm màu iot đĩa nuôi cấy, các khuẩn lạc B. subtilis PY79 ban đầu vì tổng hợp đƣợc amylase nên xuất hiện vòng phân giải tinh bột. Ngƣợc lại, các khuẩn lạc B. subtilis
mang đoạn gen dung hợp thành công sẽ không xuất hiện vòng phân giải tinh bột nào là hệ quả của việc mất khả năng tổng hợp amylase (hình 29).
Kết quả thu đƣợc ở hình 29 cho thấy tại vi ̣ trí các khuẩn la ̣c chƣ́a đoa ̣n gen dung hơ ̣p (các khuẩn lạc 1-28 ) không xuất hiê ̣n vòng phân gi ải tinh bột, trong khi đó đối chƣ́ng âm là da ̣ng B. subtilis PY79 ban đầu có vòng phân gi ải tinh bột rất rõ ràng. Nhƣ vậy các khuẩn lạc đƣợc kiểm tra đều không còn khả năng t ổng hợp amylase phân hủy tinh bô ̣t , đoạn gen cotB-streptavidin đã đƣợc dung hợp vào hệ gen B. subtilis. Một số khuẩn lạc sẽ đƣợc chọn nuôi, tạo bào tử để kiểm tra sự biểu