thẩm tách miễn dịch
Sau khi xử lý bào tử bằng dung dịch tách chiết chứa SDS 10% và DTT 1M, li tâm thu dịch nổi, chúng tôi đã thu đƣợc dịch chiết chứa các protein của lớp áo bào tử. Vì sản phẩm cuối cùng mà chúng tôi hy vọng biểu hiện đƣợc sẽ là một protein dung hợp giữa cotB và streptavidin nên kích thƣớc băng protein hiện trên màng sẽ là tổng của hai thành phần cotB (kích thƣớc khoảng gần 35 kDa) và streptavidin (kích thƣớc 15 kDa). Nhƣ vậy, theo tính toán lý thuyết, protein dung hợp cotB- streptavidin sẽ có kích thƣớc khoảng 50 kDa.
Bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đa dòng của streptavidin chúng tôi đã thu đƣợc kết quả ở hình 31. Các đƣờng chạy 2-5 là các mẫu bào tử hình thành từ tế bào B. subtilis mang gen cotB-streptavidin, chúng tôi đã thu đƣợc băng protein có kích thƣớc khoảng 50 kDa đúng nhƣ kích thƣớc mong
muốn. Ngƣợc lại, ở đƣờng chạy số 6 là mẫu bào tử hình thành từ tế bào B. subtilis
chủng PY79 ban đầu không xuất hiện băng protein nào.
Hình 31: Kết quả thẩm tách miễn dịch kiểm tra sự biểu hiện của protein dung hợp cotB-streptavidin trên bào tử
Đường chạy 1: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn
Đường chạy 2-5: Bào tử thu đƣợc tƣơng ứng từ các khuẩn lạc số 1, 2, 3, 4.
Đường chạy 6: Đối chứng âm, bào tử B. subtilis PY79 hoang dại không có protein dung hợp
Từ kết quả này, chúng tôi bƣớc đầu khẳng định bào tử B. subtilis đã biểu hiện protein dung hợp cotB-streptavidin (bào tử-strep). Mức độ biểu hiện ở các bào tử hình thành từ khuẩn lạc khác nhau có sự khác nhau. Dựa vào độ đậm nhạt của băng protein thu đƣợc ở trên, chúng tôi đã lựa chọn bào tử đƣợc hình thành từ khuẩn lạc số 4 với mức biểu hiện protein dung hợp cotB-streptavidin cao nhất cho các thí nghiệm tiếp sau.
3.3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ LIÊN KẾT CỦA BÀO TỬ-STREP VỚI KHÁNG THỂ KHÁNG VP28-BIOTINYL.
Để có thể kiểm tra đƣợc khả năng gắn của kháng thể với bào tử, bào tử-strep sau khi đƣợc ủ với kháng thể kháng VP28 đơn dòng và đa dòng đƣợc biotinyl hóa với vai trò nhƣ kháng thể sơ cấp trong thí nghiệm thẩm tách miễn dịch, sẽ đƣợc xử lý bằng SDS và DTT để thu dịch chiết protein lớp áo bào tử. DTT có vai trò phân tách cầu nối đisunfit giữa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, kết quả làm văng ra chuỗi nhẹ và chuỗi nặng của kháng thể kháng VP28 trong dịch chiết áo bào tử. Dịch chiết này đƣợc kiểm tra bằng thẩm tách miễn dịch. Nhƣ vậy trên màng thẩm tách miễn dịch, về lý thuyết chúng tôi sẽ thu đƣợc băng có kích thƣớc khoảng 55 kDa tƣơng ứng với kích thƣớc chuỗi nhẹ của kháng thể kháng VP28 trong mẫu dịch chiết áo bào tử