thể đa dòng kháng VP28-biotinyl với dịch nghiền tôm nhiễm WSSV
Để có thể đánh giá đƣợc liệu bào tử-strep gắn khắng thể kháng VP28- biotinyl có thể đƣợc sử dụng nhƣ là giá thể cho phản ứng ngƣng kết hay không, chúng tôi tiến hành thí nghiệm ủ bào tử đã gắn với kháng thể đa dòng biotinyl hóa với dịch nghiền chứa virus gây bệnh đốm trắng với các dải nồng độ khác nhau. Bào tử đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là bào tử-strep đã đƣợc nhuộm xanh bằng IC5- PE-maleimide sau khi đƣợc gắn với kháng thể kháng VP28-biotinyl. Bào tử B. subtilis PY79 gắn với kháng thể cũng đƣợc sử dụng trong thí nghiệm làm đối chứng âm. Sau 4 giờ ủ ở nhiệt độ phòng, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ trên hình 40.
Hình 40: Kiểm tra khả năng hình thành phản ứng ngƣng kết của bào tử
Hàng 1: 20µl dịch nghiền có chứa WSSV
Hàng2: 50µl dịch nghiền có chứa WSSV
Hàng3: 100µl dịch nghiền có chứa WSSV
Hàng4: 200µl dịch nghiền có chứa WSSV
Cột A: 10 µl chứa 108 bào tử B. subtilis PY79 ủ với 100µg kháng thể kháng VP28
CộtB: 10 µl chứa 108 bào tử-strep ủ với 10µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
CộtC: 10 µl chứa 108 bào tử-strep ủ với 50µg kháng thể kháng VP28 biotinyl CộtD: 10 µl chứa 108 bào tử-strep ủ với 100µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Hình 40 cho thấy, ở hàng thứ 2, có sự khác biệt rõ rệt giữa đối chứng âm là mẫu bào tử B. subtilis PY79 (cột A) với các mẫu bào tử-strep (cột B, C, D). Sự ngƣng kết xảy ra rõ nét ở các mẫu bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl với thể tích dịch nghiền là 50µl trong khi với mẫu bào tử B. subtilis PY79, sự ngƣng kết không hề xảy ra, bào tử tập trung thành cụm ở đáy giếng phản ứng. Kết quả này phù hợp với kết quả thẩm tách miễn dịch mà chúng tôi thu đƣợc ở trên và đồng thời tái khẳng định mối liên kết không bền vững và không đặc hiệu giữa bào tử B. subtilis PY79 với kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl.
Bên cạnh đó, với dải thể tích dịch nghiền virus cho vào, chúng tôi quan sát thấy, với 20µl thể tích dịch nghiền (hàng 1) thì phản ứng ngƣng kết hầu nhƣ không xảy ra. Nguyên nhân có thể do lƣợng virus trong dung dịch quá ít để hình thành nên mạng lƣới kháng nguyên-kháng thể. Do vậy, phản ứng ngƣng kết không xảy ra đƣợc. Ngoài ra, với lƣợng thể tích dịch nghiền là 100 µl và 200 µl (hàng 3, 4) thì cũng khó có thể kiểm tra đƣợc phản ứng ngƣng kết có xảy ra hay không do lƣợng thể tích quá lớn, gây khó khăn cho quan sát. Với kết quả này, chúng tôi quyết định
chọn thể tích dịch nghiền là 50 µl cho toàn bộ thí nghiệm sau này. Đồng thời, phản ứng ngƣng kết xảy ra với bào tử-strep gắn 10 µg, 50 µg và 100 µg kháng thể biotinyl hóa. Tuy nhiên, kết hợp với kết quả western blot ở mục 3.3, để đảm bảo liên kết giữa bào tử-strep với kháng thể kháng VP28-biotinyl bền vững, nồng độ kháng thể đƣợc chọn cho các thí nghiệm sau này là 50 µg.