VP28-biotinyl
Trong thí nghiệm này, chúng tôi gắn bào tử-strep với kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl với các lƣợng kháng thể nhƣ sau: 10 µg, 50 µg và 100µg. Bào tử B. subtilis PY79 hoang dại cũng đƣợc làm song song để kiểm tra.
Hình 32: Kiểm tra khả năng gắn của bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa dòng
Đường chạy 1: 109 bào tử B.subtilis PY79 ủ với 10 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 2: 109 bào tử B.subtilis PY79 ủ với 50 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 3: 109 bào tử B.subtilis PY79 ủ với 100 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 4: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn
Đường chạy 5: 109 bào tử-strep ủ với 100 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 6: 109 bào tử-strep ủ với 50 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 7: 109 bào tử-strep ủ với 10 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 8: 1 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Kết quả thu đƣợc trên hình 32 cho thấy, khi gắn kháng thể đa dòng với bào tử, chúng tôi đã thu đƣợc băng 55 kDa ở các mẫu bào tử-strep của kháng thể kháng VP28 (đƣờng chạy 5-7). Những băng protein này có kích thƣớc đúng bằng băng protein thu đƣợc đối với mẫu đối chứng là kháng thể kháng VP28 đa dòng. Độ đậm nhạt của các băng thu đƣợc tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể cho vào. Tuy nhiên đối với mẫu bào tử B. subtilis PY79 hoang dại (đƣờng chạy 1-3), chúng tôi cũng thu đƣợc băng tƣơng tự nhƣ bào tử-strep ở tất cả lƣợng kháng thể. So sánh với các mẫu bào tử-strep thì độ đậm của các băng thu đƣợc kém hơn khoảng 0,5 lần. Điều này có thể đƣợc lí giải do trong quá trình thao tác, kháng thể kháng VP28 liên kết không đặc hiệu với các protein ở lớp áo ngoài của bào tử . Từ kết quả này, chúng tôi có thể bƣớc đầu kết luận bào tử-strep có khả năng tƣơng tác với kháng thể kháng VP28-
biotinyl đa dòng. Bào tử B. subtilis cũng cho thấy có thể gắn với kháng thể kháng VP28-biotinyl với ái lực kém hơn bào tử-strep. Bởi vậy, mức độ đặc hiệu và bền vững của liên kết giữa bào tử-strep, bào tử B. subtilis PY79 với kháng thể cần phải đƣợc tiếp tục kiểm tra.
Để có thể kiểm tra đƣợc độ bền vững của liên kết giữa bào tử với streptavidin, các mẫu bào tử sau khi đƣợc gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl đƣợc bảo quản ở 40C sau 2 tháng sẽ đƣợc kiểm tra lại bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch (hình 33).
Hình 33: Mẫu bào tử-strep gắn với kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl sau 2 tháng bảo quản
Đường chạy 1: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn
Đường chạy 2: 109 bào tử-strep ủ với 100 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 3: 109 bào tử-strep ủ với 50 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 4: 109 bào tử-strep ủ với 10 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 5: 109 bào tử B.subtilis PY79 ủ với 100 µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 6: 109 bào tử-strep
Đường chạy 7: 1µg kháng thể kháng VP28 biotinyl
Kết quả thu đƣợc trên hình 34 cho thấy, sau 2 tháng bảo quản, chúng tôi thu đƣợc các băng có kích thƣớc 55 kDa của kháng thể kháng VP28 đa dòng ở các đƣờng chạy số 2, 3, 4 tƣơng ứng với lƣợng kháng thể là 100, 50, 10 µg. Đặc biệt ở đƣờng chạy số 5 là mẫu bào tử B. subtilis PY79 đƣợc ủ với kháng thể kháng VP28- biotinyl với 100 µg, chúng tôi không thu đƣợc băng 55 kDa nào. Kết quả này chứng tỏ liên kết giữa kháng thể với protein lớp vỏ áo ngoài của bào tử B. subtilis PY79 với kháng thể là không bền vững và không phải là liên kết đặc hiệu. Ngoài ra, trong 3 lƣợng kháng thể đƣợc sử dụng để ủ với bào tử-strep là 10 µg, 50 µg và 100 µg thì
băng thu đƣợc đối với 10 µg khá mờ nhạt. Nhƣ vậy, với 10 µg kháng thể đƣợc sử dụng cho phản ứng gắn với bào tử-strep thì liên kết giữa streptavidin với kháng thể biotinyl hóa không đƣợc bền vững nhƣ khi sử dụng hai lƣợng kháng thể là 50 µg và 100 µg. Từ kết quả thu đƣợc, chúng tôi có thể khẳng định bào tử-strep có khả năng liên kết đặc hiệu và bền vững với kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl và đây là cơ sở để chúng tôi phát triển phƣơng pháp ngƣng kết miễn dịch ứng dụng trong phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm WSSV.
3.3.1. Đánh giá mức độ liên kết của bào tử-strep với kháng thể đơn dòng kháng VP28-biotinyl
Dựa trên những kết quả thu đƣợc đối với kháng thể đa dòng kháng VP28- biotinyl, chúng tôi tiếp tục đánh giá khả năng gắn với kháng thể đơn dòng kháng VP28-biotinyl với bào tử-strep. Trong thí nghiệm này, lƣợng kháng thể đơn dòng chúng tôi sử dụng cho phản ứng là 50 µg và 100 µg. Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch đƣợc thể hiện trên hình 34.
Hình 34: Kiểm tra khả năng gắn của bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa dòng
Đường chạy 1: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn
Đường chạy 2: 109 bào tử-strep ủ với 50 µg kháng thể đơn dòng kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 3: 109 bào tử-strep ủ với 100 µg kháng thể đơn dòng kháng VP28 biotinyl
Đường chạy 4: 1µg kháng thể đơn dòng kháng VP28 biotinyl
Hình 34 cho thấy bào tử-strep cũng có khả năng gắn với kháng thể đơn dòng kháng VP28-biotinyl ở cả 50 µg và 100 µg. Nhƣ vậy, bào tử-strep gắn với kháng thể kháng VP28-biotinyl cả đơn và đa dòng chúng tôi thu đƣợc đều có thể sử dụng cho phản ứng ngƣng kết sau này.