Với các dung dịch virus pha loãng, chúng tôi tiến hành tách chiết ADN bằng bộ kit Virus Magnet Nano. Từ 250 µl dịch nghiền, chúng tôi thu đƣợc 50 µl sản phẩm ADN tinh sạch. 3 µl thu đƣợc đƣợc làm khuôn cho phản ứng realtime PCR xác định số bản copies trong dung dịch virus ở từng nồng độ (hình 37).
Với mẫu tôm đã đƣợc xác định là nhiễm bệnh đốm trắng do WSSV gây nên, chúng tôi tiến hành nghiền và thu dịch trong chứa virus. Để khẳng định chắc chắc hơn nữa sự có mặt của virus, mẫu dịch nghiền này đƣợc chúng tôi tách chiết và tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu của đoạn gen mã hóa cho VP28. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhƣ sau:
940C : 30 giây
600C : 45 giây x 35 chu kỳ 720C : 30 giây
Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 36) cho thấy, chúng tôi đã thu đƣợc một băng duy nhất có kích thƣớc 650 bp của đoạn VP28 ở đƣờng chạy số 3. Nhƣ vậy, mẫu dịch nghiền chúng tôi thu đƣợc là có virus gây bệnh đốm trắng.
Hình 37: Kiểm tra sự có mặt của virus trong mẫu dịch nghiền
Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1 kb
Đường chạy 2: đối chứng (-)
Đường chạy 3: mẫu dịch nghiền
Đường chạy 4: đối chứng (+)
Với kết quả kiểm tra thu đƣợc, chúng tối tiếp tục tiến hành pha loãng dung dịch virus theo các tỷ lệ 1:4, 1:16 và 1:64 và xác định nồng độ virus bằng Realtime PCR. Để làm đƣợc thí nghiệm này, 250µl dịch virus ở nồng độ gốc ban đầu và các nồng độ pha loãng đƣợc tiến hành tách chiết ADN song song. Tiếp đó, 3µl trong tổng số 50µl ADN thu đƣợc, đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR và Realtime PCR. Kết quả thu đƣợc nhƣ trên hình 38 và 39.
Hình 38: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra WSSV ở các nồng độ pha loãng
Đường chạy 1: Thang chuẩn ADN 1 kb
Đường chạy 2: Dịch WSSV pha loãng 1:4
Đường chạy 3: Dịch WSSV nồng độ gốc ban đầu
Đường chạy 3: Dịch WSSV pha loãng 1:16
Đường chạy 4: Dịch WSSV pha loãng 1:64
Kết quả thu đƣợc trên hình 38 cho thấy, với hai nồng độ pha loãng là 1:16 và 1:64 thì PCR không phát hiện đƣợc sự có mặt của WSSV do nồng độ virus và ADN
tách chiết đƣợc từ mẫu dịch quá thấp. Kết quả này phù hợp với kết quả realtime PCR trên hình 38.
Fluor Well Type Ident. Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set
SQ Mean SD Mean SD Point
SYBR E02 Unkn Wssv 1:4 2 27.06 3.117 1.31E+03 1.31E+03 0.00E+00 27.06 N/A N/A
SYBR E01 Unkn Wssv 1 1 23.37 4.055 1.14E+04 1.14E+04 0.00E+00 23.37 N/A N/A
SYBR C06 Std - 6 24.69 3.699 5.00E+03 5.00E+03 0.00E+00 24.69 N/A N/A
SYBR C05 Std - 5 20.25 4.699 5.00E+04 5.00E+04 0.00E+00 20.25 N/A N/A
SYBR C04 Std - 4 17.84 5.699 5.00E+05 5.00E+05 0.00E+00 17.84 N/A N/A
SYBR C03 Std - 3 12.88 6.699 5.00E+06 5.00E+06 0.00E+00 12.88 N/A N/A
SYBR C02 Std - 2 9.35 7.699 5.00E+07 5.00E+07 0.00E+00 9.35 N/A N/A
SYBR C01 Std - 1 4.73 8.699 5.00E+08 5.00E+08 0.00E+00 4.73 N/A N/A
Hình 39: Kết quả realtime xác đinh số bản copies trong dung dịch virus trong các nồng độ pha loãng
5x108 5x107
5x105
WSSV 1:4 WSSV 1
Từ kết quả thu đƣợc, chúng tôi tính đƣợc nồng độ virus trong từng nồng độ pha loãng nhƣ sau:
Bảng 3: Số bản copies trong từng dung dịch WSSV
Nồng độ pha loãng Số bản copies/50µl Số bản copies/1ml WSSV ban đầu 3,8x104 copies 76x104 copies
WSSV 1:4 4,3x103 copies 87x103 copies
WSSV 1:16 - -
WSSV 1:64 - -
(-): không thể xác định
Với hai nồng độ pha loãng 1:16 và 1: 64, Realtime PCR không thể xác định đƣợc số bản copies do hàm lƣợng ADN thu đƣợc quá ít, không đủ để khuếch đại.