- Mẫu DNA hòa với 5μl TE được biến tín hở 98°C trong 5’ Cho hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của các probe vào.
B. Nồng độ các probe tương ứng với các exon 45-50 ở mẹ bệnh nhân chỉ bằng ½ so với chứng nữ, chứng tỏ mẹ bệnh nhân ở dạng dị hợp tử, mang 1 NST X chứa gen dystrophin đột biến mất
1.5.2. Phương pháp lấy mẫu không xâm phạm tha
Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến phương pháp lấy mẫu thai nhi bằng phương pháp không xâm phạm thai. Phương pháp lấy mẫu không xâm nhập giúp tránh được nguy cơ có thể xảy ra đối với thai và người mẹ. Có hai phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai đó là:
- Thu thập tế bào thai nhi trong máu mẹ,
- Tách DNA thai nhi tự do lưu hành trong máu của người mẹ.
1.5.2.1. Phương pháp thu thập tế bào thai nhi trong máu mẹ
Từ năm 1893, người ta đã cho rằng tế bào của thai nhi có thể lưu hành trong máu mẹ với sự kiện Schmorl phát hiện được cỏc nguyờn bào nuôi trong phổi của một thai phụ bị tử vong vì sản giật [64]. Một số tác giả khác cũng có những quan sát tương tự như vậy; nhưng cho đến khi phát hiện được những tế bào lympho mang NST Y trong máu một thai phụ (mang thai có giới tính nam), người ta mới chắn chắn được rằng tế bào thai nhi thực sự có lưu hành trong máu mẹ [134]. Từ đó, các công trình nghiên cứu về tế bào thai nhi trong máu mẹ ngày càng nhiều và đặc biệt nở rộ vào những năm 1990. Sự xuất hiện tế bào thai nhi trong máu mẹ là do tế bào máu thai nhi có thể đi vào tuần hoàn mẹ thông qua nhung mao nhau thai. Những tế bào thai nhi có thể được thu thập một cách an toàn từ khoảng tuần thứ 18 của thai kỳ trở đi. Hiện nay, với những kỹ thuật hiện đại, người ta có thể thu thập các tế bào này vào tuần thứ 12 của thai kỳ [100].
Có nhiều loại tế bào thai nhi xuất hiện trong máu mẹ, tuy nhiên nguyên hồng cầu được sử dụng nhiều nhất để phân tích và xác định bệnh lý di truyền nói chung. Sau khi lấy máu mẹ, cần phải tiến hành các công đoạn gồm (1) làm giàu các tế bào thai nhi do số lượng của chúng trong một mẫu máu là rất hạn chế, (2) nhận diện tế bào thai nhi trong số các tế bào được làm giàu và (3) thực hiện các chẩn đoán di truyền học [64].
* Một số tế bào thai xuất hiện trong máu mẹ:
- Tế bào hồng cầu: Sự hiện diện của tế bào hồng cầu thai nhi trong máu mẹ được chứng minh trong rất nhiều nghiên cứu [64]. Tuy nhiên hồng cầu là những tế bào khụng nhõn nờn không có tác dụng trong chẩn đoán di truyền học.
- Nguyên bào nuôi: việc sử dụng nguyên bào nuôi trong chẩn đoán trước sinh có một số khó khăn nhất định. Thứ nhất, hiện tượng nguyên bào nuôi đi vào tuần hoàn của mẹ không phải xảy ra ở tất cả các trường hợp mang thai. Thứ hai, nếu hiện tượng này có xảy ra thỡ cỏc nguyờn bào nuôi cũng nhanh chóng bị đào thải bởi tuần hoàn phổi [30]. Ngoài ra, nguyên bào nuụi cú nguồn gốc ngoài phôi, tức là một phần của bánh rau, do vậy nguyên bào nuôi có khả năng biểu hiện tình trạng khảm trong khoảng 1% trường hợp, do vậy nú khụng phản ánh chân thực bộ gen của thai nhi [59].
- Tế bào bạch cầu: việc sử dụng tế bào bạch cầu thai nhi trong máu mẹ cũng gặp một số khó khăn nhất định. Bianchi và CS đã phát hiện rằng các tế bào gốc tạo mỏu, cỏc tế bào tiền thân lympho và tủy và tế bào lympho T của thai nhi có thể tồn tại trong máu một phụ nữ đến 6 năm. Do vậy, nếu kỹ thuật này thực hiện ở các lần mang thai con rạ thì rất có thể sẽ thu nhận những tế bào bạch cầu của thai nhi trong lần mang thai trước [36]. Ngoài ra, việc nhận diện các tế bào bạch cầu thai nhi cũng gặp bất lợi là hiện nay chúng ta không đủ các loại kháng thể đơn dòng để phát hiện bạch cầu tương ứng [64].
- Tế bào gốc và các tế bào gốc tạo máu: phương pháp này có lợi điểm là tế bào gốc có thể nhân lên nhanh chóng in vitro do vậy có thể cung cấp đủ một lượng tế bào cần thiết cho các xét nghiệm di truyền học [64]. Tuy nhiờn
các tế bào này lại có khả năng tồn tại lâu trong máu mẹ, do vậy, như trên đã nói, nếu kỹ thuật này thực hiện ở các lần mang thai con rạ thì rất có thể sẽ thu nhận những tế bào bạch cầu của thai nhi trong lần mang thai trước [37].
- Nguyên hồng cầu: các tế bào hồng cầu có nhân (nguyên hồng cầu) của thai nhi là loại tế bào có thể đáp ứng tốt nhất các tiêu chí của kỹ thuật phát hiện tế bào thai nhi trong máu mẹ vỡ nú cú đời sống tương đối ngắn, có hình thái đặc trưng và hầu như luôn hiện diện trong máu mẹ ở bất kỳ trường hợp mang thai nào [101]. Do vậy, hiện nay người ta thường tiến hành tách, làm giàu cỏc nguyờn hồng cầu thai từ máu mẹ để tiến hành phân tích, xác định bệnh lý di truyền nói chung và bệnh DMD nói riêng.
* Phương pháp làm giàu nguyên hồng cầu thai nhi trong máu mẹ:
Có nhiều phương pháp làm giàu nguyên hồng cầu thai nhi trong máu mẹ, như kỹ thuật sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu, kỹ thuật ly tâm theo gradient nồng độ, nuôi cấy tế bào, sử dụng cột avidinbiotin, ...[108].
- Phương pháp FACS và MACS: FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) và MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) là những phương pháp được ưa chuộng để làm giàu tế bào vào những năm 1990. Cả hai kỹ thuật này đều dựa trên nguyên lý nhận diện khỏng nguyờn-khỏng thể bằng cách sử dụng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu nguyên hồng cầu. Để thực hiện FACS, đầu tiên các kháng thể được gắn với các chất nhuộm huỳnh quang; còn trong MACS thỡ cỏc kháng thể này gắn với các hạt từ [35], [39], [46], [60].
- Phương pháp ly tâm theo gradient nồng độ: quy trình thực hiện bởi Parano (2001) được tóm tắt như sau [101]:
+ Lấy 8ml máu của người mẹ vào tuần thai thứ 14-16. Giữ mẫu máu ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ hoặc ở 48°C qua đêm.
+ Để loại bỏ các tế bào hồng cầu khụng nhõn, cho vào dung dịch Histopaque (Sigma Diagnostic) và quay ly tâm 3000 vòng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau quay ly tâm, để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
+ Nguyên hồng cầu nằm ở lớp dịch nổi trên cùng, có tỷ trọng khoảng 1,077 đến 1,083 g/ml. Hút khoảng 2ml dịch nổi bằng pipet Pasteur.
+ Rửa tế bào 2 lần với dung dịch PBS (phosphate buffer saline).
Mẫu tế bào thai sau khi làm giàu được làm tiêu bản để nhận diện tế bào thai nhi.
* Nhận diện tế bào thai nhi tách từ máu mẹ:
Do quá trình làm giàu nguyên hồng cầu chỉ cho sản phẩm có độ tinh khiết thấp nên việc tầm soát sau đó rất tốn công sức. Zheng và CS [141] cũng như Ferguson-Smith [50] tìm ra phương pháp phát hiện nguyên hồng cầu bằng cách nhuộm kộp nguyờn hồng cầu với các kháng thể kháng hemoglobin thai nhi và huỳnh quang. Parano (2001) phát hiện nguyên hồng cầu bằng cách nhuộm với kháng thể kháng hemoglobin đặc hiệu của thai nhi (anti- hemoglobin F), sau đó phát hiện sự hiện diện của nguyên hồng cầu bằng quan sát dưới kính hiển vi. Nguyên hồng cầu được xác định khi băng nhuộm phát sáng [101].
Hình 1.13. Phát hiện nguyên hồng cầu thai nhi trong máu mẹ bằng kỹ thuật nhuộm với kháng thể kháng hemoglobin F (Nguồn: Parano, 2001)
Các tế bào máu thai nhi có thể được phân tích để chẩn đoán rối loạn di truyền bằng cách sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử thông qua phân lập DNA, RNA, khuếch đại bởi phản ứng PCR, RT-PCR và một số kỹ thuật như đã trình bày ở mục 1.4 [27], [45].
1.5.2.2. Phương pháp tách DNA thai nhi tự do lưu hành trong máu của người mẹ
Năm 1948, Madel và Metais [145] đã công bố trong huyết tương của cả người khỏe mạnh lẫn người bệnh đều có chứa các nucleic acid. Trong huyết
thanh của các bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống [128], viêm khớp dạng thấp và ung thư đều có một lượng lớn DNA [83]. Năm 1997, Lo và CS đã chứng minh được sự hiện diện của DNA thai nhi tự do lưu hành trong huyết tương và huyết thanh của phụ nữ có thai [86]. Các nhà nghiên cứu cũng đã sử dụng kỹ thuật real time PCR để định lượng DNA của thai nhi, cụ thể là SRY, một chuỗi trình tự đặc hiệu cho NST giới tính Y trong máu những bà mẹ mang thai nam. Kết quả rất đáng ngạc nhiên: trung bình có đến 25,4 copy của DNA thai nhi trong 1ml máu mẹ trong giai đoạn sớm của thai kỳ, nghĩa là cao hơn gấp nhiều lần số tế bào thai nhi trong máu mẹ [87]. Nguồn gốc của DNA thai nhi tự do trong máu mẹ vẫn chưa được biết chắc chắn. Có thể chỳng cú nguồn gốc từ (1) các tế bào thai nhi trong máu mẹ bị phá hủy và giải phóng ra, (2) DNA tự do của thai nhi được vận chuyển qua rau thai hoặc (3) sự phá hủy của các nhung mao màng nuôi nằm sát với các khoang gian nhung mao trong rau thai [116].
* Kỹ thuật chiết tách DNA tự do lưu hành trong máu mẹ:
- Lấy 3,5 ml máu thai phụ, chống đông bằng EDTA. Ly tâm 16000g trong 10 phỳt. Hỳt dịch nổi cho vào ống polypropylene, ly tâm ở 16000g trong 10 phút. Hút 900 μl dịch nổi cho vào ống polypropylene khác và bảo quản ở nhiệt độ -80°C.
- Sau khi để tan băng, 400 μl mẫu nghiệm được ly tâm ở 16000g trong 10 phút và DNA được tách chiết bằng kit High Pure PCR Template Purification của hãng Roche.
- Sử dụng 40 μl proteinase K để làm tiêu protein và rửa DNA với 50 μl dung dịch đệm rửa. Cần lưu ý, trước khi rửa, mẫu nghiệm được đặt trong tủ lắc ở nhiệt độ 70°C trong 5 phút. DNA thu được bảo quản ở nhiệt độ 4°C để sử dụng cho các kỹ thuật di truyền phân tử [142].
* Ứng dụng của kỹ thuật phát hiện DNA thai nhi tự do trong máu mẹ:
Đầu tiên, kỹ thuật phát hiện DNA thai nhi bên ngoài tế bào lưu hành trong máu mẹ được sử dụng để chẩn đoán giới tính thai nhi và định nhóm
máu hệ Rh. Sau đó kỹ thuật này được sử dụng để chẩn đoán các bệnh lý di truyền đơn gen [116].
Việc xác định giới tính thai nhi được thực hiện bằng cách phát hiện cỏc dóy trình tự đặc hiệu của NST Y. Nếu phát hiện được dãy trình tự đặc hiệu NST Y thì thai nhi là nam. Ngược lại, vắng mặt các chuỗi trình tự trên chứng tỏ thai nhi là nữ. Cỏc dóy trình tự đặc hiệu cho NST Y thường được dùng trong chẩn đoán giới tính thai nhi là SRY, DYS và DAZ [116].
Bất đồng nhóm máu Rh giữa một thai phụ có Rh(-) và thai nhi có Rh(+) có thể gây nên đáp ứng miễn dịch ở mẹ với những hậu quả trầm trọng như tán huyết ở con gây nên vàng da nặng nề, thậm chí vàng da nhân hoặc có thể gây nên sẩy thai liờn tiếp ở các lần có thai sau [116]. Vì vậy, việc xử trí kịp thời những bà mẹ có nhóm máu Rh(-) mang thai Rh(+) là rất quan trọng. DNA thai nhi tự do trong máu mẹ đã được sử dụng để chẩn đoán sớm nhóm máu Rh của thai nhi ở những bà mẹ có Rh(-) [87].
Năm 2000, Saito và CS lần đầu tiên thành công trong việc sử dụng DNA thai nhi tự do trong máu mẹ để chẩn đoán bệnh tạo xương bất toàn [113]. Sau đó, DNA thai nhi tự do trong máu mẹ cũng được sử dụng để chẩn đoán trước sinh các bệnh lý xơ nang tụy [98], beta-thalassemia [133] và tăng sản thượng thận bẩm sinh [42]. Phương pháp này có thể sử dụng để chẩn đoán một gen bất thường của thai nhi có nguồn gốc từ bố hoặc một đột biến không phải từ mẹ. Nếu gen bệnh của thai nhi có nguồn gốc từ mẹ (như bệnh DMD, hemophilia,…) thì phương pháp này không sử dụng được. Chớnh vỡ lý do này mà phương pháp chẩn đoán bệnh lý di truyền đơn gen sử dụng DNA thai nhi tự do có chỉ định hạn chế [116].