- Chu trình của phản ứng PCR như sau:
2.3.10.Xác định người lành mang gen dystrophin đột biến
2.3.10.1. Phản ứng multiplex PCR xác định kiểu gen dị hợp tử
Kết quả giải trình tự cho phép xác định chính xác dạng đột biến và vị trí đột biến của gen dystrophin. Trong số các bệnh nhân được chẩn đoán bị đột biến mất đoạn, có 30 gia đình hợp tác với nhóm nghiên cứu để tiếp tục tiến hành phân tích gen của các bà mẹ, chị em gái và dì của bệnh nhân. Chúng tôi đã sử dụng phương pháp multiplex PCR định lượng để phát hiện các trường hợp dị hợp tử.
* Nguyên tắc phản ứng:
Trên cơ sở xác định được vị trí đột biến của bệnh nhân, chúng tôi sử dụng 4 cặp mồi cùng nồng độ để khuếch đại bốn exon của gen dystrophin ở bệnh nhân và các thành viên trong gia đình. Bốn exon được lựa chọn bao gồm 2 exon mà bệnh nhân không bị đột biến nhằm làm đối chứng nội và 2 exon bệnh nhân bị đột biến. Phản ứng được tiến hành song song với mẫu đối chứng nam và nữ. Mỗi gia đình bệnh nhân được lặp lại thí nghiệm 3 lần.
* Tiến hành phản ứng:
Mỗi phản ứng multiplex PCR có thể tích là 20μl chứa các thành phần:
Thành phần Thể tích (μl)
10 x buffer 2
2,5 mM dNTP 2
Taq polymerase (5U/μL) 0,2
10 pmol mồi xuôi (0,5μl cho mỗi mồi x 4 mồi = 2,0μl)
2,0 10 pmol mồi ngược (0,5μl cho mỗi
mồi x 4 mồi = 2,0μl)
2,0
DNA (100ng) 1,0
Nước cất 10,8
Tổng số 20μl
* Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR:
Sau khi khuếch đại các exon của gen dystrophin, phân tích sản phẩm PCR bằng 2 phương pháp điện di trên thạch agarose nồng độ 3% và điện di mao quản bởi máy Agilent 2100 Bioanalyzer. Đậm độ các băng phân tách bởi thạch agarose (nhuộm với ethidium bromide) sẽ được so sánh với nồng độ các exon đo được trờn mỏy Agilent 2100 Bioanalyzer.
Agilent 2100 Bioanalyzer là công cụ phân tích mẫu acid nucleic cũng như protein đạt các tiêu chuẩn công nghiệp và đã thay thế cho phương pháp
940C/5phút 940C/30giây 600C/30giây 720C/30giây 20 CK 720C/5phút 40C/ 940C/5phút 940C/30giây 600C/30giây 720C/30giây 20 CK 720C/5phút 40C/
điện di trên gel agarose vốn đòi hỏi nhiều công sức. Đặc trưng của Agilent 2100 Bioanalyzer là nó có thể được sử dụng cả trong phân tách điện di (ví dụ: tách các đoạn DNA) và phân tích các chỉ số huỳnh quang tế bào trong phương pháp đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry). Nhờ vậy, phân tích kết quả điện di DNA có thể cho biết đồng thời cả kích thước và nồng độ của các đoạn DNA được phân tách. Kể từ khi được đưa vào sử dụng năm 1999, Agilent 2100 Bioanalyzer được các nhà nghiên cứu ưa chuộng nhờ kết quả chính xác, thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu nhỏ (1-4 μl) và khả năng tự động hoá cao.
Trong phản ứng xác định người lành mang gen, khi điện di hỗn hợp PCR được khuếch đại bởi 4 cặp mồi đặc hiệu cho 4 exon, kết quả của người bình thường được thể hiện ở hình 2.3.
Hình 2.3. Kết quả điện di mao quản trờn mỏy Agilent 2100 Bioanalyzer
Trong đó, trục hoành biểu hiện kích thước (số lượng bp) của các exon và trục tung thể hiện nồng độ của các exon. Hình ảnh điện di cú sỏu đỉnh: đỉnh đầu tiên là mẫu chứng giới hạn dưới; có kích thước 15 bp, đỉnh thứ 6 là mẫu chứng giới hạn trờn; cú kích thước 1500 bp. Bốn đỉnh ở giữa tương ứng với bốn exon được khuếch đại, chiều cao mỗi đỉnh thể hiện nồng độ của exon tương ứng trong hỗn hợp PCR. E46 E51 E49 E41 15 bp 1500 bp Kíchthước (bp) E46 E51 E49 E41 15 bp 1500 bp Kíchthước (bp)
2.3.10.2. Phân tích phả hệ gia đình các bệnh nhân
* Phân tích phả hệ nhằm tìm ra những phả hệ có tiền sử gia đình. Bà mẹ sinh con bị bệnh DMD trong các gia đình này được gọi là dị hợp tử bắt buộc. Bà mẹ này phải có một trong 3 điều kiện sau:
- Có ít nhất hai con trai bị bệnh
- Có một con bị bệnh và một người anh hoặc em trai của bà bị bệnh. - Có một con bị bệnh và con của chị em gái của bà bị bệnh
* Minh họa các phả hệ có tiền sử di truyền và không có tiền sử di truyền: - Trường hợp 1: Mẹ có 2 con bị bệnh trở lên
- Trường hợp 2: phả hệ có hai thế hệ bị bệnh trở lên, thường bà mẹ có 1 người con bị bệnh và một người anh em trai bị bệnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẹ là dị hợp tử bắt buộc I II III Mẹ là dị hợp tử bắt buộc I II III Mẹ là dị hợp tử bắt buộc I II III Mẹ là dị hợp tử bắt buộc I II III I II III
- Trường hợp 3: phả hệ có ít nhất hai chị em gái đều có con bị bệnh.
- Trường hợp gia đình không có tiền sử di truyền: gia đình chỉ có một con trai độc nhất bị bệnh.
2.3.10.3. Phương pháp xác định hoạt độ CK huyết tương